Диплом. Вольтамперометрическое определение холекальциферола в биологическиактивных добавках
 Скачать 1.99 Mb.
|
|
2.4 Методика исследования модифицированных электродных поверхностей Разработана методика по приготовлению МЭ. На этапе подготовки модификатора и последующего его нанесения на поверхность электрода проводились следующие операции взвешивание сухих компонентов модификатора, а именно ДАГУДФК и НЧ никеля смешение сухих компонентов. Подготовка в качестве основы модификатора агарозного геля растворением сухого компонента вводе при нагревании внесение в основу смеси сухих компонентов, Подготовка поверхности электрода последовательной обработкой водой и этанолом, зачисткой фильтровальной бумагой и последовательным высушиванием на воздухе в течение 30 минут. 43 Нанесение модификатора на поверхность электрода проводилась окунанием; сушка электрода на воздухе в течение 5 часов до образования тонкой пленки. Подбор состава модификатора осуществлялся на основании литературных данных [32] и практического исследования влияния различных компонентов на изменение площади электроактивной поверхности МЭ и на электрохимический отклик холекальциферола согласно разработанной методике. Далее нами был проведен подбор связующего компонента для модифицирующего слоя. Из наиболее распространенных желирующих агентов были отобраны для дальнейшего исследования агар-агар, декстран и хитозан. Приготовление мембран с вышеуказанными связующими компонентами проводилось аналогично разработанной методике по изготовлению МЭ. Оценка применимости в слое модификатора конкретного связующего компонента проводилась последующим параметрам 1) простота приготовления 2) параметры связывания 3) электрохимическая проводимость – электрохимический отклик ГЦФ пары на МЭ. 2.4.1 ИК-спектроскопия образцов электродных поверхностей Изучение морфологии получаемой электродной поверхности проводилось методом ИК-спектроскопии с обратным Фурье- преобразованием. Для исследования применялся ИК-спектрометр «FTIR Cary 660» (Agilent Technologies, США. Работу с образцами поверхности проводили при помощи приставки НПВО ATR Accessory (Pike Technologies, США) содержащей кристалл селенида цинка (ZnSe). Для подготовки образца немодифицированной поверхности использовался композитный углеродсодержащий электрод, с которого резаком срезалась поверхность. Толщина образца равнялась 1 мм. Полученный образец размещали в приставке НПВО и фиксировали держателем. Затем проводили съемку в диапазоне длин волн от 1000 до 4000 44 см Подбор ширины щели производился автоматически, она оставляла 8 мм. Хранение образцов осуществлялось в эксикаторе. После чего проводилась подготовка модифицированного образца путем нанесения ДАГУДФК на поверхность рабочего электрода. Затем электрод размещался в сушильном шкафу в течение 5 часов при температуре С или сушился при температуре Св течение 7 часов на воздухе. Образцы поверхности также отделялись от рабочего электрода резаком. ИК- спектроскопия проводилась по ранее описанной методике. Проведение съемки на электродной поверхности, содержащей наночастицы Ni, было затруднено, в силу их высокой отражающей способности. В связи с чем, в данной работе ИК-спектры электродных поверхностей с окончательно доработанным слоем модификатора не приводятся. 2.4.2 Методика микроскопического исследования электродных поверхностей Микроскопическое изучение морфологии электродных поверхностей проводилось при помощи сканирующего электронного микроскопа Hitachi S- 3400N (Hitachi, Япония. Исследование образцов проводили в режим обратно-рассеянных электронов в низком вакууме (6 Пас ускоряющим напряжением 20 кВ. Данные исследования проводились на базе НИ ТПУ Проводилась предварительная съемка образца поверхности в отсутствии модифицирующего слоя. Образец электродной поверхности размещался на металлическом столике при помощи проводящего углеродного скотча. Затем столик помещается в рабочую камеру. Затем подготавливался образец модифицированной поверхности. После чего вновь проводилась съемка. 45 2.4.3 Оценка величины электроактивной поверхности методом вольтамперометрии Оценка величины площади электроактивной поверхности проводилась методом вольтамперометрии с помощью ГЦФ пары и последующего аналитического расчета. В фоновый электролит помещалась добавка стандартного раствора ГЦФ и последующее снятие ЦВА с регистрацией тока электроокисления и электровосстановления. После чего следует расчет площади электроактивной поверхности электрода по уравнению Рэндлса-Шевчика: i p = 2,69•10 5 n 3/2 AD 1/2 ox W 1/2 C 0 ox (2.2), где i p - ток пика (А, n – число электронов, A – площадь электроактивной поверхности, W – скорость развертки (В/с), D – коэффициент диффузии (см 2 /с), C – концентрация деполяризатора (моль/л). Аналогичным образом проводили подбор материала мембраны. Для чего, сначала записывали ЦВА ГЦФ пары на не модифицированных электродах. Затем на поверхность наносили связующее (агар-агар, декстран и хитозан), высушивали и повторно записывали ЦВА ГЦФ пары. Полученные значения токов применяли для оценки величины электроактивной поверхности по уравнению (2.2). 2.4.4 Методика получения и характеристика применяемых наночастиц В данной работе применялись наночастицы Ni, полученные путем электровзрывом проводника (ЭВП). Процесс осуществляется при следующих параметрах время взрыва составляло 10–6 с температура в момент взрыва – 370 С, давление – 110 Па развиваемая мощность равнялась 1013 Вт/кг; скорость разлета продуктов изменялась в интервале от 1 до 5 км/с. Схема установки для получения НЧ Ni представлена на рисунке 5 46 Рисунок 5 – Схема установки производства нанопорошков методом ЭВП: 1 – высоковольтный источник питания 2 – емкостный накопитель энергии 3 – механизм подачи проволоки 4 – взрываемый проводник 5 – высоковольтный электрод 6 – коммутатор 7 – накопитель нанопорошка; 8 – вентилятор 9 – взрывная камера 10 – система газового снабжения 11 – заземленный электрод Емкостный накопитель заряжается от высоковольтного источника. Далее осуществляется автоматическая подача взрываемого отрезка проволоки в промежуток между электродами. По достижении проволокой высоковольтного электрода накопитель разряжается на отрезок проволоки между электродами. Образовавшийся при взрыве порошок собирается в накопителе. Объем камеры перед работой вакуумируется, а затем заполняется аргоном. Выбор данного метода получения НЧ металлов обусловлено возможностью эффективного контроля параметров получаемого порошка НЧ при помощи параметров процесса. Кроме того, порошки НЧ, получаемые описанным методом, как правило, имеют сферическую форму частиц, что важно для дальнейшего применения их, в качестве разветвляющего электродную поверхность материала. Также получение нанопорошков электровзрывом характеризуется низкими затратами энергии и отсутствием теплоносителя. Помимо этого, в данном методе процесс осуществляется в 47 изолированной камере и отсутсвуют технологические выбросы. Таким образом, получение НЧ электровзрывом характеризуется высокой экологичностью и технологичексой безопасностью. Синтез НЧ методом электровзрыва проводился на базе Научно-исследовательской лаборатории СВЧ-технологии НИ ТПУ. Характеризацию НЧ проводили при помощи просвечивающей электронной микроскопии и лазерной дифракции. Для просвечивающей электронной микроскопии применялся высокоразрешающий ПЭМ JEM- 2100F (JEOL, Япония. Получение микроскопических снимков проводили при энергии пучка 200 кэВ значении расстояния пробега электронов 8 см под высоким вакуумом. Проводили предварительное смешение изопропанола с НЧ металла. Полученную суспензию наносили на металлическую пластинку, после чего высушивали при 30 Св течение 1 часа. Применение указанных условий позволило снизить возможное влияние дефектов линз на получаемое изображение и свести к минимуму астигматизм и сферические аберрации. Распределение получаемых НЧ по размерам оценивалось при помощи лазерного анализатора размеров частиц SALD-7101 (Shimadzu, Япония. Пробу образца предварительно диспергировали в изопропиловом спирте. Полученную систему помещали в кварцевую кювету. 2.5 Спектрофотометрическая методика определения холекальциферола Предварительно нами было проведено исследование по подбору оптимального растворителя, которое заключалось в измерении оптической плотности приготовленных растворов стандарта холекальциферола в соответствующих растворителях с концентрацией 5 мкг/см 3 . Для исследования были выбраны следующие растворители изопропанол, ацетонитрил, гексан и N,N – диметилформамид. После спектрофотометрических измерений проведен сравнительный анализ полученных результатов, входе которого для дальнейшего анализа отобран 48 растворитель с наибольшим значением оптической плотности при одном значении концентрации, что соответствует наибольшему значению удельного и молярного показателей светопоглощения для холекальциферола. Данный факт позволяет предположить, что, чем большее значение коэффициента поглощения имеет аналит в определенном растворителе, тем выше чувствительность методики и тем ниже предел определения аналита. Методика заключается в приготовлении серии стандартных растворов последующем определении их оптических плотностей в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм с помощью УФ, Вид- спектрофотометра Agilent Cary60 с толщиной поглощающего слоя 10 мм построении градуировочного графика приготовлении растворов объектов анализа определении их оптических плотностей определении концентраций растворов объектов анализа по градуировочному графику. Максимум поглощения холекальциферола наблюдается при 265 нм, допустимое отклонение максимума составляет 3% [22]. Подготовка серии стандартных растворов холекальциферола взвешивание навески массой 0,0050 гс точностью дог внесение в мерную колбу объемом 50 см доведение до метки изопропанолом – получение исходного раствора с концентрацией 100 мкг/см 3 ; последовательное разбавление изопропанолом в колбах вместимостью 25 см. Концентрации полученных растворов составляют соответственно 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 7; 9 мкг/см 3 Выбор серии концентраций для стандартных растворов обусловлен необходимостью выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера (уравнение 2.3), согласно которому величина оптической плотности не должна быть выше единицы А = 𝑙 ∙ 𝐶 ∙ Е см % , где Е см % – удельный показатель поглощения холекальциферола в этаноле, см С – массовая концентрация аналита, %; l – толщина поглощающего слоя, см. 49 Глава 4. Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и ресурсосбережение Научно-исследовательская работа связана с разработкой новой методики определения содержания холекальциферола в различных лекарственных формах представленных на рынке биологически-активных добавках. На сегодняшний день во всем мире существует острая проблема недостатка витамина D, что подтверждено многочисленными эпидемиологическими исследованиями. Это связано, прежде всего, с малым содержанием витаминов данной группы в природных источниках и с , так называемым, солнечным голоданием – недостаточностью солнечного облучения, что снижает количество вырабатываемого организмом витамина D. Для решения данной проблемы сегодня пользуются, в основном, введением в организм дополнительных количеств витамина в форме биологически-активных добавок различной формы. В связи с чем, разработка новой методики определения холекальциферола является актуальной для возможности осуществления контроля содержания витамина D в БАД, иными словами для проведения контроля качества готовой продукции фармацевтических производств. Объектом исследования является холекальциферол, содержащийся в биологически-активных добавках, таких как «АкваДетрим» (Россия, «Now Foods Vitamin D 3 » (США, «Natural Factors Vitamin D 3 » (Канада. Выбор объекта исследования обусловлен несколькими причинами сложившейся мировой проблемой его гиповитаминоза широким спектром его биологических функций в организме человека необходимостью контроля качества выпускаемых БАД. Согласно литературным данным существуют множество методов для количественного определения холекальциферола в различных объектах. В большинстве своем это хроматографические методики (ВЭЖХ), которые имеют ряд недостатков. В качестве главного недостатка имеющихся методик 50 следует отметить дороговизну анализа. Также в перечень недостатков можно включить высокую длительность анализа. В своей научно-исследовательской работе использовали электрохимический метод анализа, в частности вольтамперометрию, исходя из преимуществ данного метода высокая чувствительность, простота исполнения, экспрессность и низкая стоимость анализа. 4.1. Оценка коммерческого потенциала и перспективности проведения научных исследований с позиции ресурсоэффективности и ресурсосбережения 4.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования Потенциальными потребителями являются изготовители биологически-активных добавок и лаборатории контроля качества готовой продукции фармацевтической отрасли. Анализ конкурентных технических решений В настоящее время для контроля качества холекальциферола существуют различные методы и методики, однако большинство из них обладают рядом недостатков. Рассмотрим следующие методы, которые на сегодняшний день более применимы и широко используются в лабораторной практике УФ- спектрофотомерический метод анализа [22] и ВЭЖХ [23]. Анализ конкурентных технических решений определяется по формуле КВ Б) где К – конкурентоспособность научной разработки или конкурента B i – вес показателя (в долях единицы Б – балл го показателя. Целесообразно анализ конкурентных технических решений проводить с помощью оценочной карты, которая представлена в виде таблицы 14. 51 Таблица 14 – Оценочная карта сравнения для сравнения конкурентных технических решений (разработок) Критерии оценки Вес критерия Баллы Конкурентоспособность ф Б к1 Б к2 Б ф К к1 К к2 К 1 2 3 4 5 6 7 8 Технические критерии оценки ресурсоэффективности Точность определения 0.2 4 3 5 0.8 0.6 1 2.Экспрессность 0.2 5 5 3 1 1 0.6 Простота эксплуатации 0.1 5 5 4 1 1 0.8 Простота пробоподготовки 0.1 5 5 3 0.5 0.5 0.3 5. Возможность совместного определения витаминов различной природы – селективность 0.1 2 2 5 0.2 0.2 0.5 Экономические критерии оценки эффективности 1. Цена анализа 0.2 5 5 2 1 1 0.4 2. Стоимость оборудования 0.1 5 4 3 0.5 0.4 0.3 Итого 1 31 29 25 5.0 4.7 3.9 В таблице 14: К – конкурент 1 УФ-спектрофотометрический метод анализа, К – конкурент 2 методика обращенно-фазовой ВЭЖХ , К ф – вольтамперометрический метод анализа. По итогам анализа оценочной карты можно сделать вывод, что научная разработка, описываемая в данной НИР, является конкурентноспособной. Также из представленной оценочной карты можно увидеть, что основным конкурентом разрабатываемого решения является УФ- спектрофотометрический метод анализа. 4.1.3. анализ SWOT – (Strengths – сильные стороны, Weaknesses – слабые стороны, Opportunities – возможности и Threats – угрозы) – это комплексный анализ научно-исследовательского проекта. анализ применяют для исследования внешней и внутренней среды проекта [36]. Он состоит из нескольких этапов. 52 На первом этапе рассматриваются сильные и слабые стороны проекта, те. внутренняя среда проекта, а также осуществляется выявление возможностей и угроз – внешняя среда проекта. Результаты первого этапа анализа представлены в таблице 15. Таблица 15 – Первый этап анализа Сильные стороны научно- исследовательского проекта С. Экспрессность С. Простота эксплуатации С. Низкие затраты на пробоподготовку С. Низкая стоимость анализа С. Анализ в различных лекарственных формах Слабые стороны научно- исследовательского проекта Сл1. Сниженная селективность и чувствительность по сравнению с другими методами Сл2. Необходимость прибора Сл3. Необходимость дорогостоящих реактивов, дополнительных материалов к прибору Возможности В. Разработка более дешевой и экспрессной методики анализа В. Растущий спрос на объект анализа В. Перспективы внедрения вольтамперометрии в качестве метода анализа в фармацевтическую отрасль В. Появление вольтамперометрических методик определения сходных аналитов Угрозы У. Развитие конкурентных методов анализа У2.Ограниченный круг потребителей У. Повышение стоимости оборудования У. Отсутствие необходимых реактивов Второй этап анализа предполагает рассмотрение соответствия сильных и слабых сторон научно-исследовательского проекта внешним 53 условиям окружающей среды. Это соответствие или несоответствие должны помочь выявить степень необходимости проведения стратегических изменений. В рамках данного этапа необходимо построить интерактивную матрицу проекта. Ее использование помогает разобраться с различными комбинациями взаимосвязей областей матрицы SWOT. Каждый фактор помечается либо знаком «+» (означает сильное соответствие сильных сторон возможностям, либо знаком «-» (что означает слабое соответствие «0» – если есть сомнения в том, что поставить «+» или «-». Интерактивные матрицы проекта представлены в таблицах 16-19. Таблица 16 – Интерактивная матрица проекта Сильные стороны и возможности Сильные стороны проекта Возможности проекта С С С С СВ+ В + 0 + 0 + В + + + 0 + В + + + + + Таблица 17 – Интерактивная матрица проекта Слабые стороны и возможности Слабые стороны проекта Возможности проекта Сл1 Сл2 Сл3 В - - - В 0 - - В - - - В + 0 0 Таблица 18 – Интерактивная матрица проекта Сильные стороны и угрозы Сильные стороны проекта Угрозы С С С С СУ+ У + + + + + У 0 0 + - 0 У - 0 - - 0 Таблица 19 – Интерактивная матрица проекта Слабые стороны и угрозы Слабые стороны проекта Угрозы Сл1 Сл2 Сл3 У - 0 - У 0 - - У 0 - - У 0 0 - |