ферменты. ВОПРОСЫ ПО ФЕРМЕНТАМ (1). Вопросы по ферментам
 Скачать 66 Kb.
|
|
ВОПРОСЫ ПО ФЕРМЕНТАМ Проводили выделение органелл для измерения активности ферментов? Учитывали субклеточную локализацию? Проводили разделение изоформ изоферментов? Мы измеряли общую ферментативную активность в гомогенате. Органеллы не разделяли. Разделение изоформ (изоферментов) не проводили. Но из литературных данных известно, что аконитаза встречается у всех эукариот и бактерий в цитозоле. Многоклеточные организмы имеют дополнительную митохондриальную форму (так называемая аконитаза -2). Две изоферментные формы. Различно локализованные формы – это изоформы или изоферменты? Какие еще знаете множественные молекулярные формы ферментов? Дать определение: У одного и того же вида, в одной и той же ткани и даже в одной и той же клетке ферменты могут существовать в виде множественных молекулярных форм (ММФ). Эти формы катализируют одну и ту же реакцию, но могут различаться по своим каталитическим свойствам: величине молекулярной массы, аминокислотному составу, электрофоретической подвижности, термостабильности, оптимуму рН, субстратной специфичности, действию на них активаторов и ингибиторов, иммунологическим характеристикам. Часто такие формы называют изоферментами, хотя, строго говоря, термин изофермент или изоэнзим может быть употреблен только в отношении генетически детерминированных ММФ, отличающихся по первичной структуре. Те формы ферментов, для которых не доказано, что они кодируются различными генами, называют изоформами. ММФ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы представляют собой генетические варианты (аллелозимы). В группу аллелозимов объединяются ММФ ферментов, вариабельность которых определяется их синтезом на разных аллелях одной гетерозиготы. Существуют также формы, различающиеся по конформации. Сюда относят все аллостерические модификации ферментов. В группу так называемых «конформеров» выделяют ферменты, способные образовывать различные модификации третичной структуры при одной и той же аминокислотной последовательности в полипептидной цепи. При одних и тех же условиях молекула белка стремиться принять такую конформацию, которая характеризуется минимумом свободной энергии системы. В случае изменения условий, например при взаимодействии с каким-либо лигандом, молекула фермента принимает другую конформацию, что сопровождается изменением числа и соотношения заряженных групп и других характеристик молекулы. Следует подчеркнуть, что среди конформеров принято выделять истинные, к которым относятся формы ферментов, имеющие одинаковую первичную структуру, но различную конформацию в отсутствие каких-либо лигандов. Физиологическая роль конформеров в настоящее время до конца не выяснена. Однако показано, что аллостерические модификации молекулы фермента могут обладать регуляторным эффектом в процессе биосинтеза белка. Наряду с этим полагают, что вследствие различий в зарядах они не одинаково связываются внутри клетки. Метазимы возникают в результате химических модификаций ферментов, таких как фосфорилирование или аденилирование. В других случаях метазимы образуются при синтезе ферментов из одной полипептидной цепи белка – предшественника. Например, из химотрипсина образуется до семи форм химотрипсина. Как выражали активность ферментов и какие знаете еще способы? Согласно правилам, рекомендованным комиссией по ферментам Международного биохимического союза (а также Комитетом по ферментам ВОЗ), за ферментативную единицу (Е) (иногда применяется термин международная единица МЕ) любого фермента принимается то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25 0С в оптимальных условиях действия фермента. Температура 25 0С является стандартной в физической химии. Однако во втором издании рекомендаций Международный биохимический союз предложил проводить измерения при температуре 30 0С в связи с заявлениями из стран, климатические условия в которых затрудняют термостатирование при 25 0С. Е=мкмоль/мин Удельная активностьвыражается в ферментативных единицах на мг белка. Е/мг. Концентрация ферментав растворе представляет собой число ферментативных единиц единиц в единице объема чаще в 1 мл). В практике КДЛ каталитическая активность энзима выражается числом единиц, рассчитанных для 1 литра сыворотки крови (или другой биологической жидкости), либо на 1 мг белка (для тканей), поэтому ее размерность ед/л или ед/мг белка. Молекулярная активностьсоответствует числу ферментатитвных единиц в одном микромоле чистого фермента (при оптимальной концентрации субстрата), т.е. числу молекул субстрата, превращаемых в 1 мин. одной молекулой фермента. Если измерению доступна абсолютная концентрация простетической группы или активного центра, то возможно рассчитать активность каталитического центра, т.е. число молекул, превращаемых в 1 мин. одним каталитическим центром. В системе СИ за единицу фермента принят катал – это количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. катал=моль/сек Поскольку активность ферментов намного ниже, пользуются нанакаталами (нкат), либо микрокаталами (мккат). Поэтому в практике КДЛ каталитическая активность фермента иногда выражается числом нкат (мккат), рассчитанных для 1 л сыворотки крови или 1 мг белка для ткани; размерность в этом случае – нкат/ л или нкат/ мг белка. 1 ед/л = 16, 67 нкат/л 1нкат/л= 0,06 ед/ л В работе установили повышение/уменьшение активностей ферментов, а какие Вы знаете физико-химические механизмы регуляции активности ферментов? Два пути регуляции эффективности биологического катализа в клетке: путем изменения количества катализатора – фермента; путем регулирования активности фермента. Количество фермента в клетке определяется соотношением скоростей синтеза и распада фермента. Скорость синтеза данного фермента может сильно меняться в зависимости от условий. Существуют ферменты, которые всегда присутствуют в клетке в более или менее постоянных количествах: их называют конститутивными ферментами. В отличие от них так называемые адаптивные (или индуцибельные) ферменты. Механизмы регуляции ферментативной активности на уровне синтеза ферментов являются достаточно медленными; для их реализации, как правило, нужны по меньшей мере часы. Существуют и относительно быстрые регуляторные механизмы, которые направлены непосредственно на ферменты. Для многих ферментов, катализирующих ключевые стадии метаболических путей, обнаружена чувствительность к метаболитам, отличающимися по химической структуре от субстратов соответствующих ферментативных реакций. Примером может служить ингибирование первого фермента биосинтетических путей конечным продуктом цепи. Активность ферментов, катализирующих первые в строго биодеградативных путях, контролируется соединениями, являющимися индикаторами энергетического состояния клетки, такими как неорганический фосфат, пирофосфат, адениновые или другие пуриновые нуклнотиды. В метаболических путях, выполняющих одновременно биосинтетические и биодеградативные функции (называемые амфиболическими путями), возможны оба типа регуляции (ингибирование конечным продуктом и регуляция активности ферментов под действием метаболитов-индикаторов энергетического состояния клетки). Уникальным типом регуляции, присущим только амфиболическим путям, является активация предшественником: первый метаболит в последовательности реакций активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Этот тип регуляции выполняется, например, для гликогенсинтетазы млекопитающих, которая сильно активируется глюкозо-6-фосфатом – предшественником гликогена. Моно, Шанжё и Жакоб, желая подчеркнуть различия в химической структуре между субстратом ферментативной реакции и метаболитами, оказывающими регулирующее воздействие на фермент, предложили называть подобные метаболиты – регуляторы аллостерическими эффекторами. Аллостерические эффекторы связываются на особых центрах белковой молекулы («аллостерических центрах»), пространственно удаленных от активных центров, где происходит каталитическое превращение субстрата, и что взаимодействия между пространственно разобщенными активными и аллостерическими центрами опосредуются конформационными изменениями белковой молекулы. Рассмотренный механизм регуляции активности ферментов называют аллостерическим. Другими словами:Аллостерический механизм регуляции активности ферментов представляет собой регуляторный механизм, в котором контроль активности фермента реализуется путем измения конформации белковой молекулы, индуцируемого связыванием метаболита-регулятора в особом (аллостерическом) центре, пространственно удаленном от активного центра. Изменение конформации молекулы фермента влечет за собой изменение каталитических характеристик активного центра. Метаболит-регулятор, модифицирующий активность фермента, называют аллостерическим эффектором. Олигомерная молекула фермента, состоящая из нескольких субъединиц, может содержать несколько активных центров и несколько аллостерических центров для определенного эффектора. В таком олигомере возможны взаимодействия не только между активным и аллостерическим центрами, но и между центрами одного сорта (между активными или между аллостерическими центрами). Многие ферменты обладают олигомерной структурой, т.е. построены из отдельных субъединиц. Связи между субъединицами имеют чаще всего нековалентный характер, и это определяет возможность диссоциации ферментного олигомера на отдельные субъединицы, которые, как правило, отличаются по своим каталитическим свойствам от ферментного олигомера. Важно отметить, что положение равновесия между олигомерными формами фермента контролируется присутствием субстратов, коферментов и аллостерических эффекторов. Таким образом, воздействие метаболитов на прочность связей между субъединицами в ферментном олигомере имеет регуляторное значение (диссоциативный механизм регуляции активности ферментов). По современным представлениям, клеточные метаболиты оказывают влияние на способность ферментов взаимодействовать с субклеточными структурами. Ферменты, адсорбированные структурными белками мышц и мембранами клеточных органелл, имеют иное микроокружение, нежели ферменты в растворе, и характеризуются измененными каталитическими характеристиками. Контролируемая метаболитами адсорбция ферментов на субклеточных структурах (адсорбционный механизм регуляции ферментативной активности) расширяет регуляторные возможности клетки. Аллостерический, диссоциативный и адсорбционный механизмы регуляции ферментативной активности являются родственными в том отношении, что в каждом из них влияние метаболита – регулятора на каталитические свойства фермента осуществляется не путем прямого воздействия на активный центр фермента, а косвенным путем (через изменение конформационного, олигомерного или адсорбционного состояния фермента). Некоторые ферменты регулируются путем обратной ковалентной модификации. У этих ферментов переход активной формы в неактивную происходит путем ковалентной модификации молекулы фермента. (Единственная регуляция, которая затрагивает активный центр фермента!). Общее понятие метаболизма? МЕТАБОЛИЗМ (ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ОБМЕН ВЕЩЕСТВ) есть совокупность химических реакций, протекающих в клетке. НАЗНАЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА: 1) аккумуляция энергии; 2) синтез мономеров и макромолекул (с запасанием и затратой энергии); 3) совершение работы (механической, осмотической и др.) с затратой энергии; 4) распад элементов клетки для обновления структур; 5) синтез и распад специальных молекул (гормоны, ферменты, кофакторы) ЦЕПИ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ОБРАЗУЮТ т.н. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ (ЦИКЛЫ): ЦЕНТРАЛЬНЫЕ (общие для распада и синтеза макромолекул) СПЕЦИАЛЬНЫЕ (синтез и распад специальных молекул и макромолекул) МЕТАБОЛИЗМ представляет собой совокупность процессов синтеза (АНАБОЛИЗМ) и распада (КАТАБОЛИЗМ). УРОВНИ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА Для любого организма характерно состояние высокой упорядоченности. Следовательно, имеются регулирующие метаболизм механизмы, каковых в процессе эволюции выработалась целая цепь. 1. РЕГУЛЯЦИЯ НА УРОВНЕ ОТДЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ (закон масс, простейшими катализаторами и ферментами). 2. РЕГУЛЯЦИЯ СИСТЕМ МНОГИХ СОПРЯЖЕННЫХ РЕАКЦИЙ. 3.У высокоразвитых организмов, кроме того, выработалась регуляция на уровне НЕРВНОЙ и ЭНДОКРИННОЙ систем. Рецепторы ЦНС расположенные повсюду, посылают в ЦНС сигналы о состоянии клеток, обратно ЦНС регулирует активность клеток желез внутренней секреции, синтезирующих ГОРМОНЫ (щитовидная железа, кора надпочечников, поджелудочная железа и т.д.). Первоначально нервные импульсы воздействуют на ГИПОТАЛАМУС, где синтезируются гормоны, в свою очередь регулирующие активность периферических желез. От места синтеза ГОРМОНЫ достигают клетки-мишени с потоком крови, лимфы. Гормоноподобные вещества синтезируются в клетках, не относящихся к железам внутренней секреции, и действуют в местах образования, проникая к месту действия путем ДИФФУЗИИ (МЕДИАТОРЫ). Гормоны действуют на ткани неодинаково, что обусловлено неодинаковой чувтвительностью тканей к ним. Специфичность гормона по отношению к клеткам-мишеням обусловлена наличием у клеток специфических РЕЦЕПТОРОВ, входящих в состав клеточных мембран. Рецепторы являются ГЛИКОПРОТЕИНАМИ, их специфичность обусловлена углеводным компонентом белка. В зависимости от того, где в клетке происходит передача информации, различают варианты действия гормонов: 1. МЕМБРАННЫЙ 2. МЕМБРАННО-ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ 3. ЦИТОЗОЛЬНЫЙ. МЕМБРАННЫЙ тип действия реализуется в месте связывания гормона с плазматической мембраной и заключается в избирательном изменении ее проницаемости. Механизм действия - аллостерическая регуляция. Таким путем обеспечивается трансмембранная регуляция переноса глюкозы инсулином. МЕМБРАННО-ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ заключается в том, что гормон, не проникая в клетку, влияет на обмен в ней через специального посредника. Одними из таковых являются 3'-5'-ц-АМФ и 3'-5'-ц-ГТФ и являются компонентами аденилатциклазной системы. ЦИТОЗОЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ заключается в том, что гормоны липофильной природы способны проникать внутрь клетки через мембрану и образовывать комплекс с рецепторами, находящимися в цитозоле. После этого комплекс проникает внутрь ядра и избирательно влияет на доступность для транскрипции отдельных геномов ДНК, влияя, таким образом, на синтез мРНК и соответственно, на синтез белков-ферментов, что оказывает воздействие на метаболические процессы. К вопросу: что объединяет, контролирует функционирование, например, глутатионовой АОС (работу глутатиона, ГП,ГР), НАДФН-продуцирующих ферментов и мелатонина…еще чего нибудь? В конечном итоге все контролируется, находится под управлением ЦНС!!! Дополнения к вопросам по СРО, АФК и АОС Образование АФК является следствием неполного: - одноэлектронного (образование О2-), - двухэлектронного (образование HO2-) или - трёхэлектронного (образование Н2О2)восстановления кислорода вместо полного четырёхэлектронного его восстановления, которое приводит к образованию воды (H2O). Кроме продуктов восстановления кислорода, к АФК относят также: - молекулы кислорода в синглетном состоянии (1О2), - окисел азота (NО), - пероксинитрит (ОNОО.), - гипогалогениты (НОСl, НОВr, НОJ), - а также продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ): - перекисные (RО2-)и алкоксильные (RО.)радикалы. Свободные радикалы принимают участие: - в метаболизме ксенобиотиков в организме]; - при повреждениях, вызванных ишемией и реперфузией; - в онтогенезе и в клеточной пролиферации; - в регуляции тонуса сосудов ; - при воспалении; - при бактериальных и вирусных инфекциях; - в регуляции метаболических процессов как внутриклеточные мессенджеры; - в канцерогенезе; - в атерогенезе ; в старении и т.д. Системы, продуцирующие АФК: - в дыхательной цепи митохондрий; - в электронно-транспортной цепи микросом; - путём перехода оксигемоглобина в метгемоглобин; - во время метаболизма арахидоновой кислоты; - в реакции гипоксантин-ксантиноксидаза; - при биосинтезе и окислении катехоламинов; - под воздействием ионизирующего излучения, озона, NO, NO2; - при фотолизе и функциональной активности фагоцитирующих клеток крови (нейтрофилов, моноцитов, макрофагов) . Какие знаете АФК и время их жизни? ОН радикал 10-9с. синглетный кислород 10-12с. Дать классическое определение стресса по Гансу Селье: Стресс - это состояние организма, характеризующееся выработкой адаптационных реакций в ответ на неблагоприятные факторы среды. |