Диплом про гриб. Березовый гриб. Введение березовый гриб тритерпеновый флавоноид
 Скачать 4.88 Mb.
|
|
2.3.2 Исследование толуольного экстракта Экстракцию чаги проводим по схеме (Рисунок 2.8) в аппарате Сокслета (Рисунок 2.6) при температуре 111°С (Ткип растворителя). Полученный экстракт упариваем до 10мл. Полученный после экстракции раствор (экстракт) изучаем с помощью ТСХ. Для этого на пластинки «Silufol» наносим анализируемый экстракт. Путем предварительного подбора выявляем наиболее подходящие системы растворителей: 1. хлороформ - бензол - этилацетат(4:8:1); . бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10); Первая система часто применяется для терпеновых соединений, которая хорошо показала разделение фенолокислот и терпеновых соединений, а вторая система хорошо разделяет малополярные соединения. Полученные хроматограммы высушиваем при комнатной температуре, просматриваем их в видимом и УФ-свете, проявляем ФМК, 5 % водным раствором соды, 5 % спиртовым раствором хлорида алюминия, парами аммиака (Таблица 2.13). Хроматографирование в первой системе дало наибольшее разделение веществ (6 пятен). В обеих системах наблюдаем флюоресценцию голубым цветом, пятна с Rf1=0.84 и Rf2=0.77, которые при опрыскивании ФМК окрашиваются в синий цвет, что предполагает наличие фенолокислот. Пятна 2, 3 и 4 с Rf1=0.22; Rf2=0.47; Rf3=0.63 соответственно, не флюоресцируют в УФ-свете, а с ФМК дают синее окрашивание, что дает основание отнести эти вещества к терпеноидам. Их идентификацию проводили при «свидетелях» - бетулиновой кислоте, бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 2, 3 и 4 оказались идентичны бетулиновой кислоте (Rf=0.22), бетулину (Rf=0.47) и лупеолу (Rf=0.63) соответственно. Таблица 2.13 - Хроматографический анализ толуольного экстракта
При просматривании хроматограммы в видимом и УФ-свете на старте видно желтое пятно, которое характерно для флавоноидов. Во второй системе наблюдается частичное разделение флавоноидов с Rf= 0.23 и Rf = 0.30. Однако в данной хроматограмме можно наблюдать другие индивидуальные компоненты, такие как фенолокислоты, стеролы. Наличие стеролов с Rf1=0.66 и Rf2=0.40, подтверждается качественными реакциями с серной кислотой (H2SO4), дающая характерное розовое окрашивание. При опрыскивании хроматограммы 5 % водным раствором соды, 5 % спиртовым раствором хлорида алюминия и парами аммиака, наблюдали изменение окраски пятен, характреных для флавоноидов, а именно флавонов и флавонолов. В результате хроматографического анализа толуольного экстракта в различных системах растворителей можно сделать вывод о том, что в толуольном экстракте обнаружены фенолокислота; терпеновые соединения (бетулиновая кислота, бетулин и лупеол); флавоноиды (флавоны и флавонолы); стеролы. Исследование надосадочной жидкости толуольного экстракта Полученный толуольный экстракт упариваем, получаем раствор слабо-желтого цвета. Раствор сушим при нормальных условиях, получаем бледно-желтый осадок с желтым маслообразным вкраплением, которое отмываем петролейным эфиром. Петролейный экстракт упариваем, получаем желтую маслообразную жидкость с массой 0.03г. Проводим хроматографический анализ в системе растворителей гексан - диэтиловый эфир - ледяная уксусная кислота (73:25:2), характерная для анализа липидов [25]. На хроматограмме наблюдали наличие размытого, характерного для высших жирных кислот, пятен с голубым свечением из чего можно сделать вывод о наличии высших жирных кислот в толуольном экстракте. 2.3.3 Исследование этилацетатного экстракта Этилацетатный экстракт получаем по схеме (Рисунок 2.8) при экстрагировании чаги этилацетатом при температуре 77 °С (Ткип растворителя). После предварительной экстракции полученный экстракт упариваем до 10 мл, охлаждаем. Экстракт сливаем и оставляем, который испарятся при нормальных условиях, в результате чего выпадает черный осадок с массой 0.22 г, выход составил 0.55 %. Исследование надосадочной жидкости этилацетатного экстракта Проводим хроматографирование этилацетатного экстракта с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol». Для этого использовали различные системы растворителей: 1. хлороформ - бензол - этилацетат (4:8:1); 2. бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10). Полученные хроматограммы просушиваем при комнатной температуре, просматриваем их в видимом и УФ-свете, проявляем ФМК, 5 % водным раствором соды, 5 % спиртовым раствором хлорида алюминия, парами аммиака (Таблица 2.14). Таблица 2.14 - Хроматографический анализ этилацетатного экстракта
Хроматографирование в системах 1 и 2 дало полное разделение веществ (4 пятна). В обеих системах наблюдали флюоресценцию голубого цвета, пятна с Rf1=0.54 и Rf2=0.59, которые при опрыскивании ФМК окрашиваются в синий цвет, что предполагает наличие фенолокислот. Пятна 2 и 3 в системе 1 с Rf =0.36 и Rf=0.46 не флюоресцируют в УФ-свете, а с ФМК дают синее окрашивание. Идентификацию проводили при «свидетелях» - бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 2 и 3 оказались идентичны бетулину (Rf=0.36) и лупеолу (Rf=0.46). При просматривании хроматограммы в видимом и УФ-свете на старте видно желтое пятно, предполагаем о наличии флавоноидов. В системе 2 наблюдается частичное разделение флавоноидов с Rf=0.30 и Rf = 0.37. Однако в данной хроматограмме можно наблюдать и другие индивидуальные компоненты, такие как фенолокислоты, стеролы. Наличие стеролов с Rf =0.37 подтверждается качественной реакцией с серной кислотой, дающая характерное розовое окрашивание. При опрыскивании хроматограммы 5 % водным раствором соды, 5 % спиртовым раствором хлорида алюминия и парами аммиака, наблюдали изменение окраски третьего пятна, характерная для флавоноидов, а именно изофлавона. В результате хроматографического анализа этилацетатного экстракта в различных системах растворителей были идентифицированы: фенолокислота; терпеновые соединения (бетулин и лупеол); флавоноиды (изофлавон); стеролы. Исследование этилацетатного осадка Этилацетатный осадок последовательно растворяем в различных растворителях с повышающимся градиентом полярности хлороформ, диэтиловый эфир, этиловый спирт. В хлороформе и диэтиловом эфире этилацетатный осадок полностью не растворяется, а раствор приобретает желтоватую окраску. В этиловом спирте этилацетатный осадок растворяется полностью. В дальнейшем проводим хроматографирование полученных растворов этилацетатного осадка с помощью ТСХ на пластинках «Silufol». Для этого использовали следующую систему растворителей: . бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10). Полученные хроматограммы высушиваем при комнатной температуре, просматриваем их в видимом и УФ - свете, проявляем фосфорномолибденой кислотой и специфическими проявителями. Исследование этилацетатного осадка (смыв хлороформом) При хроматографическом анализе этилацетатного осадка (смыв хлороформом) определяем 10 пятен. Распределение пятен в системе растворителей показано в таблице 2.15. Таблица 2.15 - Хроматографический анализ этилацетатного осадка (смыв хлороформом)
Предполагаем, что в этилацетатном осадке (смыв хлороформом) содержится фенолокислота (10 пятно), так как десятое пятно флюоресцирует голубым цветом, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом. Пятна 9 и 7 можно отнести к терпеновым соединениям, так как терпеновые соединения не флюоресцируют в УФ-свете, а с ФМК дают синее окрашивание. Идентификацию проводим при «свидетелях» - бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 9 и 7 оказались идентичны бетулину (Rf=0.66) и лупеолу (Rf=0.84) соответственно. При просматривании хроматограммы в УФ - свете, было обнаружено четвертое пятно флуоресцирующее желтым свечением, предположительно - флавоноид. Для идентификации проводим качественные реакции на флавоноиды. Для этого используем следующие реактивы: пары аммиака, 5 % водный раствор соды, 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия. Данные реактивы дали качественные реакции на флавоноиды, а именно флавонол [28]. Оставшиеся пятна 2, 3, 5, 6, 8 идентифицированы, как кумарины. Идентификация проводилась с помощью специфических проявителей, таких как: пары йода (I2), 10 % гидроксид калия (KOH) в метаноле. При опрыскивании специфическими проявителями пятна меняли свою окраску, т.е. приобретали коричневые, оранжевые цвета [15]. Пятно 1 идентифицировано как полифенол. В результате хроматографического анализа этилацетатного осадка (смыв хлороформом) в системе растворителей бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10) были идентифицированы: фенолокислота; терпеновые соединения (бетулин и лупеол); флавоноиды (флавонолы); стеролы; кумарины; полифенолы. Исследование этилацетатного осадка (смыв диэтиловым эфиром) При хроматографическом анализе этилацетатного осадка (смыв диэтиловым эфиром) определяем 4 пятна. Распределение пятен в системе растворителей показано в таблице 2.16. Предполагаем, что в этилацетатном осадке (смыв диэтиловым эфиром) содержится фенолокислота (4 пятно), так как четвертое пятно флюоресцирует голубым цветом, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом. При просматривании хроматограммы в УФ - свете, было обнаружено второе пятно темного цвета, предположительно - флавоноид. Для идентификации проводим качественные реакции на флавоноиды. Для этого используем следующие реактивы: пары аммиака, 5 % водный раствор соды, 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия. При опрыскивании хроматограммы специфическими проявителями второе пятно меняло свою окраску, от желтого до темного цвета [28]. Оставшиеся пятна идентифицированы, как антрохиноны также с помощью специфических проявителей, таких как: пары I2, 10 % KOH в метаноле. При опрыскивании специфическими проявителями пятна меняли свою окраску, приобретая более насыщенный цвет [15]. Таблица 2.16 - Хроматографический анализ этилацетатного осадка (смыв диэтиловым эфиром)
В результате хроматографического анализа этилацетатного осадка (смыв этиловым эфиром) в системе растворителей бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10) можно сделать вывод о том, что в этилацетатном осадке (смыв этиловым эфиром) обнаружены фенолокислота; флавоноиды (флавонолы); антрохиноны. Исследование этилацетатного осадка (смыв этиловым спиртом) При хроматографическом анализе этилацетатного осадка (смыв этиловым спиртом) определяем 5 пятнен. Распределение пятен в системе растворителей показано в таблице 2.17. Предполагаем, что в этилацетатном осадке (смыв этиловым спиртом) содержится фенолокислота (5 пятно), так как пятое пятно флюоресцирует голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом. При просматривании хроматограммы в УФ - свете, было обнаружены пятна 2, 3, 4, флюоресцирующие светло-желтым и желтым свечением, предположительно - флавоноиды. Для идентификации проводим качественные реакции на флавоноиды. Для этого используем следующие реактивы: пары аммиака, 5 % водный раствор соды, 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия. При опрыскивании хроматограммы специфическими проявителями пятна меняли свою окраску, пятна 2 и 3 с желтого до красного, что позволяет их отнести к халконам, а 4 пятно от светло-желтого до желтого, что относит его к флавонолам [28]. Пятно 1 идентифицированно как полифенол. Таблица 2.17 - Хроматографический анализ этилацетатного осадка (смыв диэтиловым эфиром)
В результате хроматографического анализа этилацетатного осадка (смыв этиловым спиртом) в системе растворителей бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10) были идентифицированы: фенолокислота; флавоноиды (флавонолы, халконы); полифенол. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||