Исследование ликвора. Введение Лабораторные методы исследования ликвора
 Скачать 1.08 Mb.
|
1 2 2.4.3. Общеклиническое исследование ликвора Реакция ликвора. рН в норме слабощелочная (рН в пределах 7,4–7,5). Определение реакции СМЖ проводят с помощью тест-систем. Тестовое поле для определения рН содержит метиловый красный и бромтимоловый синий, а реагентная зона полосок содержит кислотно-щелочной индикатор бромтимоловый синий. Это обеспечивает различимое сочетание окраски от оранжевого через зеленый до синего при изменении рН в диапазоне 5–9. Каплю ликвора пипеткой наносят на реагентную зону. Оценка теста должна проводиться немедленно. При кровоизлиянии в мозг рН ликвора в норме или слабо кислая, особенно у больных с тяжелой формой, а при субарахноидальном кровоизлиянии рН ликвора становится кислой. Относительная плотность ликвора. Определение плотности проводят ареометром малого размера. Наиболее простым и доступным способом является использование диагностических полосок различных производителей, содержащих тестовую зону для определения относительной плотности. Повышение относительной плотности наблюдается при травмах головного мозга, менингитах (до 1,012–1,015), уремии, сахарном диабете и др. Уменьшается плотность при гидроцефалии, обусловленной гиперпродукцией СМЖ. Относительная плотность ликвора (ОПЛ). Определение ОПЛ проводят ареометром малого размера. Наиболее простым и доступным способом является использование диагностических полосок различных производителей, содержащих тестовую зону для определения относительной плотности. Повышение ОПЛ наблюдается при травмах головного мозга, менингитах (до 1,012–1,015), уремии, сахарном диабете и др. Уменьшается ОПЛ при гидроцефалии, обусловленной гиперпродукцией СМЖ. Нормальные значения относительной плотности для люмбального ликвора 1,005-1,009, для субокципитального – 1,003-1,007, для вентрикулярного 1,002-1,004. Определение глобулинов методом высаливания (реакция Нонне-Апельта). Реакция основана на свойстве солей в определенной концентрации избирательно осаждать глобулины. Готовится насыщенный раствор сульфата аммония х.ч.: 85 г соли растворяют в 100 мл воды при кипячении. Полученный раствор выдерживают 48 ч при комнатной температуре, фильтруют и используют для постановки реакции. рН раствора нейтральная 7,0–7,1. В случае кислой реакции его подщелачивают крепким раствором аммиака. В пробирку вносят 0,5 мл ликвора, приливают 0,5 мл реактива и перемешивают (опыт). В контрольную пробирку равного диаметра наливают 1 мл воды (контроль). М.А. Базарнова и В.Т. Морозова (1988) советуют наливать в пробирку 0,25–1,0 мл насыщенного сульфата аммония (в зависимости от количества ликвора) и осторожно наслаивать на него равный объем ликвора. При положительной реакции на месте соприкосновения появляется беловатое кольцо. Результат определяют через 2–3 минуты. Заметив наличие кольца, пробирку встряхивают и оценивают степень образования мути. Регистрацию результатов реакции производят в течение 3 мин после смешивания ликвора с реактивом, так как в последующем помутнение может произойти и в нормальной СМЖ. Сравнение опыта с контролем производят на темном фоне. Для выражения результатов пользуются системой 4 плюсов:
Реакция дает относительное представление о нормальном и патологическом содержании глобулинов в ликворе. Слабую опалесценцию иногда находят и в нормальной спинномозговой жидкости при небольшом повышении содержания общего белка (больше 0,2 г/л). Наиболее достоверное представление о содержании глобулинов и их фракций можно получить при электрофоретическом исследовании ликвора, которое целесообразно проводить при положительной реакции Нонне–Апельта. Определение глобулинов реакцией Панди. Реакция основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором карболовой кислоты. Готовится насыщенный раствор карболовой кислоты: 100 г карболовой кислоты растворяют в 1 л воды, встряхивают и оставляют в термостате при 37°С на 6—8 ч. После пребывания при комнатной температуре в течение 7 дней надосадочную жидкость сливают и используют в качестве реактива. На часовое стекло, помещенное на черную бумагу, наливают 1 мл реактива и по краю наслаивают 1–2 капли ликвора. В случае положительного результата в месте соприкосновения реактива с СМЖ образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть. Для обозначения результатов реакции Панди пользуются системой четырех плюсов:
Реакция Панди осаждает такие белковые фракции, которые остаются неосажденными в реакции Нонне—Апельта, поэтому целесообразно ставить обе реакции одновременно. Определение белка полуколичественным методом (с помощью тест-систем). Диагностические полоски можно использовать в качестве ориентировочного метода определения белка ликвора, так как эти тест-системы позволяют определить практически только альбумин (АльбуФАН, Урискан, Урибел). Индикатор бромтимоловый синий в присутствии альбумина меняет исходно желтоватый цвет на бледно-зеленый, насыщенно-зеленый или темно-зеленый в зависимости от содержания альбумина в ликворе. Для проведения анализа тест-полоску погружают в ликвор до отмеченной линии строго на тот временной промежуток, который указан производителем в инструкции (для теста АльбуФАН он составляет 2-3 секунды). Излишки жидкости удаляют постукиванием ребра полоски о край пробирки. Результат считывают спустя 45-60 секунд в помещении с температурой воздуха от +15 до +30 градусов С. Цвет индикаторной зоны сравнивают с цветами, указанными на тубе с тест-полосками, он меняется в зависимости от концентрации альбумина в ликворе. Через 5 минут от проведения исследования результаты считаются недостоверными и считывать их нельзя. Реагентные зоны соответствуют концентрации альбумина: 0,15, 0,3, 1,0; 3,0 и ≥10,0 г/л. Если цвет реактивной зоны оказывается между цветами двух соседних этикеток, то результат определяется по наиболее близкой цветной зоне шкалы. Определение белка фотоколориметрическим методом (Белур 600). Метод основан на изменении оптической плотности ликвора после добавления в него реагента, связывающего белок (пиррагололового красного, сульфосалициловой кислоты, бриллиантового синего). Учет реакции проводится при помощи аппарата Белур 600 – миниатюрного и простого в эксплуатации фотоколориметра. В него помещают прозрачную кювету с реакционной смесью, через которую аппарат пропускает оранжевый свет с длиной волны 600 нм. С противоположной стороны световые волны воспринимает фотоэлемент, таким образом определяется количество поглощенного раствором волн света. Существует прямая связь между количеством белка и изменением оптической плотности раствора, по которой аппарат расчитывает концентрацию общего белка в растворе. Реакция Фридмана–Ференца. Используется для ранней диагностики менингита. Метод основан на окислительно-восстановительной реакции раствора перманганата калия и осаждении белка трихлоруксусной кислотой. Реактивы:
К 1 мл СМЖ прибавляют 0,05 мл (1 каплю) реактива 1, смесь хорошо взбалтывают. В нормальном ликворе наблюдается яркое фиолетовое окрашивание, которое долго сохраняется. Цвет не меняется от прибавления 2–3 капель реактива 2. В ранней стадии менингита при смешивании ликвора с раствором перманганата калия фиолетовый цвет очень быстро (в течение 1–2 мин) переходит в красно-желтый и коричнево-желтый цвет. При добавлении трихлоруксусной кислоты (реактив 2) в случаях гнойного менингита цвет доходит до светло-желтого или наступает полное обесцвечивание с одновременным помутнением и осаждением белка. Изменения цвета по описанному типу не наступает при других органических поражениях мозга: травме, опухолях мозга, сифилисе мозга, рассеянном склерозе, протекающих без менингеальных симптомов. Метод относится к качественным реакциям. В настоящее время постановка реакции Фридмана–Ференца нецелесообразна в КДЛ, поскольку основной реактив перманганат калия включен в список препаратов ограниченного использования. Метод определения белка с сульфосалициловой кислотой. Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации. Реактивы:
Для анализа применяют свежеприготовленную смесь равных объемов этих реактивов (рабочий раствор) 3. Стандартный раствор альбумина – 1 % раствор: 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9% раствора хлорида натрия в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствором хлорида натрия до метки. Реактив нестойкий. Для стабилизации к стандартному раствору прибавляют 1 мл 5% раствора азида натрия (NaN3) В этом случае при хранении в холодильнике реактив годен к употреблению в течение 2 мес. 1 мл раствора содержит 10 мг альбумина 4. 0,9% раствор хлорида натрия. Для учета результата реакции использую фотоколориметр. В пробирку наливают 5 мл свежеприготовленного рабочего раствора и 0,5 мл ликвора. Тщательно перемешивают. Через 10 мин интенсивность помутнения измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля, длина волны 410–480 нм (сине-фиолетовый светофильтр). В контроль вместо реактива берут 0,9% раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику. Недостатками метода при определении белка в СМЖ сульфосалициловым методом являются:
Перед опытом целесообразно поставить реакцию Панди (качественная проба на белок), и если результат реакции оценивают 3+ или 4+, то перед количественным исследованием ликвор надо развести изотоническим раствором хлорида натрия и при расчете учесть степень разведения. Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 0,6 г/л, поэтому при более высоких концентрациях белка ликвор следует разводить. Обязательно колориметрировать опытную пробу против холостой, так как выраженная окраска СМЖ может приводить к ошибкам при определении концентрации белка (завышение результатов) при колориметрии против воды. Если муть начинает оседать, перед измерением на фотоэлектроколориметре пробирку следует тщательно встряхнуть. 2.4.4. Биохимическое исследование ликвора Определение глюкозы. Для определения глюкозы в ликворе применяют те же методы, что и для выявления глюкозы в крови. Чаще всего — ферментативный (глюкозооксидазный) и ортотолуидиновый методы. Во избежание гликолиза определять содержание глюкозы нужно не позднее чем через 3–4 ч после пункции. Определение глюкозы с помощью тест-систем. Используются преимущественно для выявления гипергликоархии. Детекция глюкозы основывается на специфической глюкозо-пероксидазной реакции, способствующей окислению индикатора, который изменяет свою окраску. В ходе реакции отмечается последовательное изменение цвета от желтого (норма) через светло-зеленый до темно-зеленого. рН образца не влияет на результаты анализа. Практический лимит чувствительности составляет 2,2 ммоль/л. У здорового человека содержание глюкозы в СМЖ колеблется в пределах 2,8–3,9 ммоль/л. В субокципитальном и вентрикулярном ликворе концентрация глюкозы на 12–15% выше, чем в люмбальном ликворе. Содержание глюкозы в ликворе у новорожденных и недоношенных несколько выше, что обусловлено недостаточностью гематоэнцефалического барьера. Источником ее является глюкоза крови. Проникновение глюкозы из крови в ликвор происходит не только через сосудистое сплетение, но и через оболочки мозга по всей его поверхности. Определение глюкозы в ликворе желательно проводить одновременно с исследованием ее в крови через 4–6 час после приема пищи. При нормальном уровне глюкозы в крови, в люмбальном ликворе концентрация глюкозы составляет примерно 60% уровня в плазме. При гипергликемии разница между ликвором и кровью возрастает значительно, в ликворе глюкоза достигает только 30–35% уровня плазмы. Концентрация глюкозы в ликворе является результатом активного транспорта через ГЭБ, утилизации клетками паутинной оболочки, эпендимы, глии, нейронами и выхода в венозную систему. Уровень глюкозы в ликворе является одним из важных индикаторов функции ГЭБ и широко используется для его оценки. Глюкоза является основным субстратом для нейронов. Несмотря на то, что большинство нейронов получают глюкозу из кровотока, тем не менее, у части из них, прилегающих к желудочкам мозга, может нарушаться трофика при изменении концентрации глюкозы в ликворе. Исследование электролитов. В СМЖ обнаружены электролиты, которые установлены и в плазме крови, но в различной концентрации. В нормальных условиях концентрация электролитов в ликворе постоянна и мало зависит от изменений в крови. Определение концентрации хлоридов, калия, натрия в ликворе производят так же, как при исследовании крови. У здорового человека содержание хлоридов в СМЖ варьирует в пределах 120–130 ммоль/л. Хлор является основным анионом в СМЖ. Содержание хлора в ликворе зависит от его уровня в плазме крови. Нормальное содержание хлоридов наблюдаются при энцефалите, полиомиелите. Понижение содержания хлоридов в ликворе (гипохлорархия) является постоянным признаком менингита, особенно туберкулезного. Снижение содержания хлоридов часто наблюдается параллельно уменьшению количества глюкозы. Какой-либо зависимости между содержанием в СМЖ хлоридов и белка, а также плеоцитозом при менингитах не установлено. Понижение содержания хлоридов отмечается при нейросифилисе, бруцеллезе, компрессионных синдромах с выраженной гиперпротеинархией, при мозговых опухолях, вовлекающих мозговые оболочки; повышение — в спорадических случаях при прогрессивном параличе, заболеваниях почек (особенно уремии), сердечной декомпенсацией, рассеянном склерозе, опухолях мозга, абсцессе мозга, эхинококкозе. Субарахноидальное кровотечение в первые сутки дает легкую гиперхлорархию, после чего наступает гипохлорархия. Повышение содержания хлоридов в СМЖ, патогномоничного для какого-либо заболевания не наблюдается. Причины изменения содержания хлоридов до конца не ясны, очевидно, лишь, что оно обусловлено не только физико-химическими закономерностями, а имеет сложный генез. Содержание калия у здорового человека 2,6–2,9 ммоль/л. Повышение концентрации калия в СМЖ наблюдается при атеросклерозе, геморрагии, уремических энцефалитах, после эпилептических припадков. Незначительное уменьшение содержания калия отмечается при опухолях, вовлекающих оболочки мозга. Особенно характерно значительное увеличение концентрации калия в цистернальном ликворе непосредственно перед смертью — уровень калия может достигать 40 ммоль/л. Нормальные величины натрия 139,9–156,1 ммоль/л и находится в прямой зависимости от его уровня в плазме крови. Скорость ликворообразования определяется скоростью переноса натрия через хориоидальное сплетение и доставки путем транскапиллярного обмена с мозгом при экстрахориоидальном ликворообразовании. Повышение концентрации натрия наблюдается при тяжелых почечных, эндокринных заболеваниях, систематических погрешностях в диете, у больных эпилепсией непосредственно перед припадком и после него, при суб- арахноидальном кровоизлиянии. Кальций – нормальные величины 1–1,5 ммоль/л. Концентрация кальция незначительно повышается при гнойных менингитах, туберкулезном менингите, некоторых травмах ЦНС. Уменьшение концентрации кальция в ликворе наблюдается при гипокальциемии и в послеоперационном периоде. Уровень кальция остается практически без изменений при эпилепсии, рассеянном склерозе, нейросифилисе, большей части менингитов и менингоэнцефалитов. Неорганический фосфор – в норме содержание его в ликворе 0,4-0,8 ммоль/л. Существует положительная корреляционная связь между уровнем фосфора и концентрацией общего белка. Повышение концентрации фосфора наблюдается при острых воспалительных процессах, туберкулезном менингите. Уменьшение содержания фосфора в ликворе встречается крайне редко. Магний – нормальные величины 1,05–1,07 ммоль/л. Снижение концентрации магния наблюдается при менингитах, особенно гнойных, при некоторых опухолях ЦНС, энцефалитах, нейросифилисе, алкоголизме, циррозах, энцефалопатии. Исследование липидов. Нервная ткань имеет достаточно специфичный липидный спектр, который в норме и при патологических состояниях находит свое отражение в СМЖ. Общие липиды – в норме концентрация общих липидов в ликворе очень низкая и составляет 0,01–0,02 г/л. Повышение уровня общих липидов отмечается при рассеянном склерозе, кровоизлияниях в мозг, менингитах (особенно туберкулезном), опухолях и полиневропатии. Достаточно характерно увеличение их содержания у больных с гиперлипидемией, метахромной лейкодистрофией, инфантильной амавротической идиотией, липоидозом (болезнь Ниманна–Пика и Тея–Сакса). Значительное повышение концентрации общих липидов наблюдается при менингиоме, невриномах и бактериальных менингитах. Снижение концентрации может обнаруживаться у детей с гидроцефалией. Холестерин – в норме в СМЖ содержится 12,0–14,0 мкмоль/л. В ликворе обнаружен свободный и эстерифицированный холестерин. На долю последнего приходится 2/3 от общего количества. Увеличение уровня общего холестерина отмечается при гнойном и туберкулезном менингитах, нейросифилисе, невриномах, менингиомах, субарахноидальном кровоизлиянии, мозговом инсульте. Повышение уровня холестерина при нормальной концентрации белка в СМЖ наблюдается у небольшого числа больных с мозговыми травмами, эпилепсией, некоторыми опухолями, спинной сухотке, амавротической идиотией, боковым амиотрофическим склерозом. При рассеянном склерозе количество свободного холестерина увеличивается при нормальном или слегка повышенном уровне общего холестерина. Фосфолипиды – в норме составляют 1,5% от уровня фосфолипидов в плазме крови. Основными составляющими фосфолипидов СМЖ являются сфингомиелин (миелинового и немиелинового типа), лизолецитин, инозитолфосфатид, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин. Разные заболевания приводят к изменениям содержания общих фосфолипидов или их отдельных фракций. Повышение концентрации общих фосфолипидов характерно для некоторых хронических демиелинизирующих заболеваний (боковой амиотрофический склероз, невральная амиотрофия), метахроматической лейкодистрофии, липоидозов, менингиом. Увеличение уровня общих фосфолипидов при гиперпротеинрахии не имеет большого диагностического значения. Увеличение содержания кефалина и сфингомиелинапри одновременном снижении концентрации общих фосфолипидов наблюдается у больных с рассеянным склерозом. Изменения количества этих фракций происходят параллельно с обострением или ремиссией болезни. При метахромной лейкодистрофии также отмечается повышение значений кефалина и сфингомиелина. Исследование активности ферментов ликвора. В СМЖ обнаружены почти все ферменты, принимающие участие в обмене веществ в мозге. Однако вследствие низкого содержания в ликворе определение их активности связано с рядом трудностей. Исследование активности ферментов в СМЖ базируется в основном на методах, используемых для сыворотки. Диагностической ценностью обладает определение следующих ферментов в ликворе:
Исследование ликвора нельзя назвать рутинным – даже в крупных областных центрах его редко делают более 10 раз в сутки. Как правило, в лабораториях определяют макроскопические параметры спинномозговой жидкости, проводят микроскопию, биохимическое исследование при необходимости – бактериологический посев. Биохимия ликвора редко используется на полную мощность, обычно клиницисты довольствуются основными параметрами: хлориды, глюкоза, белок. Врачам клинико-лабораторной диагностики следует расширять диапазон проводимых исследований: внедрять на практике липидный профиль ликвора и определение активности его ферментов. Особенно это касается неврологических центров, так как многие ферменты неразрывно связаны с метаболизмом нервных клеток. Список литературы:
1 2 |