СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ВМС. З. Н. Тарова в пособии рассматриваются вопросы, связанные с классификацией, строением и свойствами высокомолекулярных соединений. Сравниваются свойства растворов вмс со свойствами коллоидных систем и растворов низ
 Скачать 292 Kb.
|
|
1 Министерство сельского хозяйства РФ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Мичуринский государственный аграрный университет Кафедра химии ________________________________________________________ Утверждено Протокол № 5 методической комиссии Плодоовощного института им. ИВ. Мичурина от 19 декабря 2006 Утверждено Протокол № 4 методической комиссии агрономического факультета от 11 декабря 2006 СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Учебное пособие Мичуринск – наукоград РФ 2007 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 2 Е.С. Симбирских. Свойства растворов высокомолекулярных соединений Учебное пособие / Мичуринск-наукоград РФ МичГАУ, 2006.– 25 с. Рецензент к.с.х.наук, доцент кафедры биологии растений и селекции плодовых культур З.Н. Тарова В пособии рассматриваются вопросы, связанные с классификацией, строением и свойствами высокомолекулярных соединений. Сравниваются свойства растворов ВМС со свойствами коллоидных систем и растворов низкомолекулярных веществ. Обращается внимание на то, как свойства растворов ВМС влияют на физиологические процессы в клетке. Приводятся современные методы исследования ВМС, подробно описывается электрофорез белков, показывается значимость этого метода для селекции на качество и выявления иммунных форм растений. В конце даются методики лабораторного практикума, вопросы для самоконтроля знаний студентов. Пособие предназначено для студентов очной, заочной и дистанционной форм обучения вузов агрономического профиля, изучающих курс физической и коллоидной химии. СОДЕРЖАНИЕ Введение 3 1. Классификация ВМС. Особенности строения макромолекул. 4 2. Свойства растворов ВМС …………………………………………… 7 3. Растворы высокомолекулярных электролитов. 13 4. Устойчивость растворов ВМС…………………………………………. 14 5. Электрофорез белков ………………………………………………….. 16 6. Вопросы для самоконтроля ……………………………………………. 19 7. Лабораторный практикум ……………………………………………… 21 Список литературы ………………………………………………………..25 Издательство Мичуринского государственного аграрного университета, 2007 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 3 ВВЕДЕНИЕ Значение высокомолекулярных соединений (ВМС) и их растворов трудно переоценить. Существование жизни на Земле определено такими высокомолекулярными соединениями как белки. Белковые вещества – казеин, желатин, альбумина также крахмалсодержащие вещества – являются основой питания. Их растворы в клетке обеспечивают обменные процессы в живом организме. Невозможно представить себе развитие промышленности и сельского хозяйства без ВМС. Натуральный шелк, хлопковые, льняные волокна, шерсть, кожа, целлюлоза и ряд ее производных нитроцеллюлоза, ацетилцеллюлоза, вискоза, различные синтетические смолы, пластмассы, синтетические волокна, органическое стекло – вот далеко неполный перечень высокополимеров, применяемых в народном хозяйстве. Специфические сложные высокомолекулярные вещества – гумусовые кислоты – играют большую роль в почвообразовании и поддержке плодородия. Из природных неорганических высокомолекулярных веществ значительную роль в формировании структуры земной коры играют различные алюмосиликаты глины, слюды, аллотропные формы углерода (алмаз, графит) и т.д. Изучение свойств, структуры и состава высокомолекулярных соединений – важнейшая задача химии. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 4 1. КЛАССИФИКАЦИЯ ВМС. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ Все ВМС по происхождению можно разделить на две группы природные и синтетические. Первые получаются биохимическим синтезом (биополимеры) в результате жизнедеятельности организмов. Это белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т.д. Синтетические ВМС получают из исходных низкомолекулярных веществ полимеризацией и поликонденсацией. Ими являются синтетические каучуки, волокна, лаки, пластмассы и т.д. По химическому строению ВМС ранее классифицировали как молекулярные лиофильные коллоиды, т.к. молекулы этих веществ имеют размеры коллоидных частиц. Такие молекулы называют макромолекулами. Более поздние исследования, в частности работы Г. Штаудингера, В.А. Каргина, СМ. Липатова показали, что эти системы, вопреки господствовавшей ранее точке зрения об их коллоидной природе, являются истинными растворами. Следовательно, макромолекулы находятся в таких растворах в виде кинетически самостоятельных частиц. Молекулярная масса высокомолекулярных соединений ≈ от десяти тысяч до нескольких миллионов (табл. 1). Таблица - Молекулярная масса и размеры ВМС Макромолекула Молекулярная масса Длина, мм Диаметр, м ДНК, выделенная из рыбьего пузыря 69·10 12 34,7·10 3 ДНК бактерии 2,5·10 9 1,3 Амилоза пшеничного крахмала 2·10 6 1,0 Полиэтилен 3·10 6 2,7·10 -2 Некоторым ВМС соответствует цепное строение, например, каучуки целлюлоза (риса. Встречаются также разветвленные и пространственные (или трехмерные) полимеры (рис. 1, 6, в. Макромолекулы разветвленных полимеров имеют вид длинных цепей с боковыми ответвлениями, число, длина и взаимное расположение которых могут меняться в широких пределах, оказывая существенное влияние на свойства полимеров. Примером разветвленного природного полимера является амилопектин крахмала Рис. 1- Схематическое изображение различных видов полимеров а – линейный б – разветвленный в – пространственный. Пространственные полимеры обычно состоят из макромо- лекулярных цепей, соединенных между собой непосредственно при помощи поперечных (мостиковых) химических связей, либо PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 6 мостиков из атомов или групп атомов. Различия в пространственной структуре ВМС можно установить по такому их свойству, как текучесть – переход полимера в жидкое состояние без нарушения структуры. Пространственные полимеры, в отличие от линейных, не обладают этим свойством и переходят в жидкое состояние только после разрушения их структуры, К сетчатым полимерам относят шерсть, алмаз, кварц, резину. От формы и строения макромолекул зависит поведение вы- сокополимера, в частности его растворимость и свойства растворов. На линейные молекулы высокомолекулярных веществ В. Кун, Х. Марки Е. Гут перенесли представления о внутреннем вращении групп атомов относительно друг друга, если они связаны связями. Было установлено, что каждое звено цепи полимера может свободно вращаться относительно соседнего звена. Поэтому линейные макромолекулы рассматриваются как совершенно гибкие нити, которые могут принимать любые формы, совместимые с неизменными длиной звеньев и величиной валентных углов (109°28'). Гибкость макромолекул хорошо согласуется с поведением высокомолекулярных соединений, например, сих эластичностью и процессом набухания. Линейные полимеры представляют большой практический интерес, так как с формой их молекул связаны ценные свойства различных волокнистых материалов хлопчатобумажное, шерстяное, шелковое, синтетическое волокна возможность их прядения, кручения, гибкость, механическая прочность. Линейные полимеры бывают и жесткими, когда в них содержатся полярные группы, сильно ограничивающие вращение звеньев и дополнительно создающие межмолекулярное взаимодействие между соседними макромолекулами. К полимерам с жесткими линейными макромолекулами относятся эфиры целлюлозы. Жесткое строение имеют молекулы таких сильноразветвлен- ных полимеров, как крахмал и гликоген. Особое место занимают белки и нуклеиновые кислоты, имеющие спиральную конфигурацию макромолекул. Спиральные макромолекулы являются жесткими благодаря внутримолекулярным химическими водородным связям. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 7 2. СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Для получения растворов молекулярных коллоидов достаточно привести сухое вещество в контакт с подходящим растворителем. Неполярные макромолекулы растворяются в углеводородах (например, каучуки – в бензоле, а полярные макромолекулы в полярных растворителях (например, некоторые белки – вводе и водных растворах солей. Растворы высокомолекулярных соединений часто рассматриваются в коллоидной химии в разделе Лиофильные золи. Однако эти растворы, обладая рядом свойств, сближающих их с типичными коллоидными растворами, имеют много признаков истинных растворов. Основной признак коллоидной системы – ее гетерогенность и наличие высокоразвитой поверхности раздела между дисперсной фазой и дисперсионной средой. В противоположность коллоидным, растворы высокомолекулярных соединений образуются самопроизвольно, они гомогенны и равновесны. Их свойства не изменяются со временем, если в них не протекают химические реакции, они термодинамически устойчивые. Как и все равновесные системы, растворы полимеров обладают свойствами обратимости. Если изменить условия, в которых находится раствора потом создать первоначальные условия, то и свойства растворов станут прежними. Так, например, если й водный раствор желатина выпарить на водяной бане, а затем разбавить водой до прежней концентрации, то все его свойства восстановятся. Несмотря на большие размеры макромолекулу растворов высокомолекулярных соединений (особенно линейных) отсутствует такой признак, как гетерогенность, те. поверхность раздела между дисперсной фазой и дисперсионной средой. Это связано стем, что молекулы ВМС в основном цепные, нитевидные. В них большое несоответствие диаметра и поперечного сечения (10 3 …10 4 раза. И хотя их длина достигает размеров коллоидных частиц (10-9… 10 -7 м, поперечное сечение остается в пределах молекулярных размеров (м. Поэтому, несмотря на огромные размеры, такая молекула поверхности раздела со средой не имеет В связи стем, что растворы высокомолекулярных веществ являются гомогенными и равновесными, их считают истинными растворами и термин лиофильные золи к ним применить можно только условно. Тем не менее, по ряду свойств, из-за больших размеров макромолекул, растворы ВМС приближаются к коллоидным растворам, поэтому изучаются в курсе коллоидной химии. Подобно коллоидным частицам, молекулы полимеров обладают малой скоростью диффузии, рассеивают свети неспособны проникать через полупроницаемые мембраны. В табл. 2 приведены некоторые свойства растворов ВМС в сопоставлении со свойствами истинных и коллоидных растворов. Таблица 2 - Свойства растворов высокомолекулярных соединений Растворы Показатель ВМС коллоидные истинные Образование самопроизвольное несамопроиз- вольное самопроизвольное Термодинамическая устойчивость устойчивы неустойчивы устойчивы Обратимость обратимые необратимые обратимые Гетерогенность гомогенные гетерогенные гомогенные Размеры частиц радиус, м 10 -9 …10 -7 10 -9 …10 -7 Оптические свойства светорассеяние светорассеяние Поглощение и пропускание Диффузия меленная медленная быстрая Отношение к диализу не диализуется не диализуется диализуется Растворение макромолекулярных коллоидов проходит через стадию набухания, являющуюся характерной качественной особенностью веществ этого типа. При набухании молекулы растворителя проникают в твердый полимер и раздвигают макромолекулы. Последние, из-за своего большого размера, медленно диффундируют в раствор, что внешне проявляется в увеличении объема полимера. Набухание может быть неограниченным, когда PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 9 конечным его результатом является переход полимера в раствори ограниченным, если набухание не доходит до растворения полимера. Ограниченно набухают полимеры, имеющие химические связи-мостики между молекулами, которые лишают полимер свойства текучести, не позволяют его молекулам оторваться друг от друга и перейти в раствор. Примером ограниченно набухающего полимера с мостичными связями между молекулами является вулканизированный каучук, в котором мостиками служат атомы серы или полярные группировки. Неограниченное набухание – это набухание, заканчивающееся растворением, когда высокополимер сначала поглощает жидкость, а затем при той же температуре переходит в раствор, образуя однофазную гомогенную систему. Так набухают каучуки в углеводородах, биополимеры вводе. При набухании объем и масса полимера увеличивается в результате поглощения низкомолекулярной жидкости. Если обозначить массу полимера до набухания m 0 , а его массу после набухания, то можно рассчитать степень набухания а по формуле Процесс набухания сопровождается значительным увеличением давления массы высокополимера на стенки сосуда — до 505,15... 1101,32 кПа. Поскольку давление создается в результате односторонней диффузии растворителя в полимер, то оно аналогично осмотическому давлению. Процессы набухания имеют место при прорастании зерен растений. Сначала зерна набухают, и возникающее давление разрушает подчас очень прочную оболочку зерна. Корни растений, произрастающих на каменистой почве, проникают в мельчайшие трещины породы, набухают в почвенной воде, способствуют разрушению горных пород. Процессы набухания активно протекают в почвах, особенно мелкоземи- стых, с большим количеством коллоидов. Величина набухания зависит от количества и качества коллоидных частиц. Сильное набухание наблюдается на глинистых почвах и черноземах, а также на почвах, насыщенных основаниями, особенно натрием. При насыщении почвы одновалентными основаниями набухание может достигать 120...150%, тогда как при насыщении двух и PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 10 трехвалентными катионами значительного увеличения объема почвенных частиц не происходит. Механизм процесса набухания состоит их двух этапов. На первом этапе поглощается немного жидкости, которая идет на сольватацию полярных групп полимера. Измерения показали, что с одной полярной группой полимера связывается лишь одна молекула растворителя, и на поверхности частиц ВМС образуется мономолекулярная сольватная оболочка, поэтому выделяется тепло и происходив объемное сжатие. На втором этапе набухания поглощается много жидкости без выделения тепла. Поглощенная жидкость никак не связывается с макромолекулами полимера, а диффузно проникает в пространство между молекулами ВМС. Набухание, а затем и растворение высокополимера происходят самопроизвольно, что подтверждает и термодинамика этих процессов. Самопроизвольные процессы, согласно второму закону термодинамики, должны сопровождаться уменьшением свободной энергии. Изменение свободной энергии Гельмгольца складывается из изменения внутренней энергии и энтропии : Поскольку при набухании выделяется тепло, то , те. происходит уменьшение внутренней энергии системы. Процесс набухания заканчивается растворением полимера, беспорядок в системе увеличивается. Следовательно, возрастает энтропия, Таким образом, свободная энергия при набухании уменьшается. Растворы высокомолекулярных соединений имеют значительную вязкость, которая быстро возрастает с увеличением концентрации растворов. Повышение концентрации макромолеку- лярных растворов, добавки веществ, понижающих растворимость полимера, изменение рН раствора и часто понижение температуры приводят к застудневанию, те. превращению сильно вязкого, но текучего раствора в сохраняющий форму твердообразный студень. Студень – гомогенная система, состоящая из ВМС и растворителя. При образовании студней между макромолекулами полимера возникают молекулярные силы сцепления, приводящие к образованию пространственного сетчатого каркаса, ячейки которого заполнены жидким раствором. Образование студня можно рассматривать как начальную стадию коагуляции или как начало процесса разделения раствора ВМС на две фазы. Студни преимущественно образуются высокополимерами с гибкими макромолекулами. Благодаря гибкости пространственной сетки студень при высушивании легко деформируется, сжимается, так что можно высушиванием получить совершенно сухой полимер, который сохраняет эластичность. Он снова способен набухать в подходящем растворителе. Процесс обратим и может быть повторен неоднократно. Студни и студнеобразование имеют большое практическое значение и играют важную роль в биологии, медицине, различных производствах. Живые организмы состоят из студней различной степени оводнения. Даже костная ткань имеет некоторую упругость и эластичность благодаря входящему в нее студню – оссеину. Кости становятся к старости более хрупкими из-за того, что в них увеличивается содержание твердых минеральных веществ. Важны студни в производстве продовольственных товаров, хлебопечении, сыроварении, кондитерском производстве. В изготовлении многих пищевых блюд студнеобразование – одна из стадий технологического процесса. Застудневание является важной стадией получения волокнистых материалов из растворов полимеров. В отличие от студней, гели — это двухфазные гетерогенные системы, образованные из высокополимеров с жесткими макромолекулами. Благодаря жесткости частиц и всего каркаса геля его объем при высушивании сокращается сравнительно немного. По мере удаления растворителя макромолекулы сближаются, но до известного продела из-за большой жесткости. Постепенно растворитель в ячейках заменяется воздухом, после чего остается пористая масса, которая пронизана тончайшими капиллярами и полостями, заполненными воздухом — твердая пена. После высушивания гели теряют способность вновь образовывать растворы, те. являются необратимыми системами. Значение гелей исключительно велико в процессах почвообразования и жизни почвы, так как часть почвы находится преимущественно в состоянии геля. К гелям относятся различные PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 12 пористые и ионообменные адсорбенты (силикагель, ультра- фильтры, искусственные мембраны. Многие гелии студни под влиянием механических воздействий при перемешивании, встряхивании способны разжижаться, переходить в золи или растворы полимеров, а затем, при хранении в покое, опять застудневать. Подобное превращение может происходить несколько раз, оно протекает изотермически и называется тиксотропией. Тиксотропия – одно из доказательств того, что структурообразование в студнях и гелях происходит за счет в основном сил Вандер-Ваальса, которые сравнительно легко разрушаются. Полная изотермическая обратимость перехода гель золь (студень раствор) – это то, что отличает тиксотропию от процессов застудневания и плавления, которые идут неизотермично, те. только при изменении температуры. Тиксотропия играет отрицательную роль в земледелии, так как тиксотропные почвы влаго- и воздухонепроницаемы, в них преобладают процессы восстановления. Улучшения таких почв можно достичь высушиванием и внесением коагуляторов (соли кальция и магния. При хранении гелей и студней, в системах происходят изменения, связанные с агрегацией частиц, В результате каркас студня постепенно сжимается в более плотную массу и отслаивается подвижная жидкая фаза. На поверхности студней вначале появляются отдельные капли жидкости, которые со временем превращаются всплошную массу сам же студень сокращается в объеме и становится менее эластичным. Такой процесс самопроизвольного расслаивания студней получил название синерзиса. Для гелей синерзис – процесс необратимый, для студней повышением температуры можно приостановить синерзис и вернуть студень в исходное состояние. Синерезис имеет практическое значение. Расслоение вискозы, черствение хлеба, разжижение киселя, крахмального клейстера, отыскание кондитерских изделий (мармелада, желе, джема) – все это примеры синерзиса. Существует определенная связь синерезиса с проблемой старения. Ткани молодого организма эластичны, содержат больше воды, ас возрастом эластичность и содержание воды в них уменьшаются. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 13 3. РАСТВОРЫ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭЛЕКТРОЛИТОВ Высокомолекулярные электролиты или полиэлектролитами содержат ионогенные группы, по которым могут проходить процессы электролитической диссоциации. Белковые молекулы как продукты конденсации аминокислот содержат основные группы - NH 2 и кислотные -СООН. Такие соединения называются амфолитами, те. они способны диссоциировать и по кислотному, и по основному типу в зависимости от р среды. Вводном растворе аминокислоты и белки находятся преимущественно в виде биполярных ионов (внутренних солей В кислой среде, когда в результате избытка водородных ионов подавлена ионизация карбоксильных групп, молекула белка ведет себя как основание, приобретая положительный заряд В щелочной среде, наоборот, подавлена ионизация аминогрупп, и молекула белка ведет себя как кислота Однако при определенной величине р степень диссоциации амино- и карбоксильных групп приобретает одинаковое значение, и тогда макромолекулы белка становятся электронейтральными. Подобное состояние белковой молекулы называют изоэлектрическим В таком состоянии свойства белковых растворов резко меняются уменьшается вязкость, снижается растворимость белка, изменяется даже форма макромолекул. Значение рН, при котором наступает изоэлектрическое состояние белков, называют изоэлектрической точкой (ИЭТ). У разных белков изоэлектрическая точка соответствует различным значениям рН. У большей части растительных белков она принимает значение при рН несколько выше 7,0, вследствие чего они несут отрицательный заряд. Как уже отмечалось, раствор белка является одним из компонентов протоплазмы клетки. Изоэлектрическое состояние белковой молекулы приводит к резкому снижению устойчивости и подвижности белковых коллоидных частиц. Такие частицы обладают минимальной адсорбционной способностью, плохо набухают. В результате в ИЭТ наблюдаются слипание частиц, коагуляция и разрушение коллоидной системы, что в конечном итоге сказывается на обменных процессах в клетке. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 14 4. УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТВОРОВ ВМС Все процессы нарушения устойчивости растворов ВМС связаны с переходом от полного к ограниченному растворению или нерастворению ВМС при добавлении к ним других растворителей или электролитов. При этом снижается либо растворяющая способность растворителя, как в случае добавления ацетона к раствору каучука в бензоле, либо добавляемый электролит оттягивает на себя растворитель, как в случае водных растворов биополимеров. Выделение ВМС из раствора наступает при добавлении к нему электролита, количество которого на 3...5 порядков превышает порог коагуляции, и не подчиняется правилу Шульце- Гарди. Процесс является обратимыми после удаления диализом из осадка электролита ВМС снова способно к растворению. Нарушение устойчивости растворов ВМС под действием электролитов получило название высаливание. Высаливающее действие электролита не связано с зарядом иона, а определяется лишь его дегидратирующей функцией. Чем больше воды требуется для гидрации иона, тем меньше ее остается на растворимость ВМС и легче происходит высаливание. Высаливающая способность электролита характеризуется главным образом анионами, которые по силе высаливающего действия располагаются в соответствующие ряды Эти ряды получили название лиотропных рядов Гофмейстера. В аналогичный рядно с меньшим воздействием на высаливание, располагаются и катионы Высаливающая активность ионов связана сих радиусом и способностью к сольватации. Чем меньше радиус иона, тем больше его сольватирующая способность из-за большей плотности заряда на поверхности иона. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 15 Высаливание белков концентрированными растворами солей является одним из методов их фракционирования на альбумины и глобулины. Понижения растворимости белков можно достичь также добавлением спирта или снижением температуры. В некоторых случаях при высаливании наблюдается коацервация. Она заключается в расслоении раствора полимера на два слоя раствор ВМС в растворителе и раствор растворителя в ВМС. Раствор, более богатый высокомолекулярным веществом, обычно выделяется в виде мельчайших капелек, которые уже затем могут образовывать сплошной слой. Физико-химические свойства коацерватов во многом напоминают свойства протоплазмы. Согласно теории Опарина, коацервация имела большое значение в истории возникновения первых живых организмов на Земле. Под влиянием высокой и низкой температур, при действии концентрированных кислот и щелочей, лучистой энергии, ультразвука, механического воздействия, высокого давления в растворах белков происходит их специфическое необратимое осаждение, называемое денатурацией. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 16 5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ Биологические макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, являясь полиэлектролитами, находятся в растворе в виде заряженных частиц. Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление называется электрофорезом. На способности биополимеров к электрофорезу основан скоростной высокочувствительный метод их исследования. С помощью электрофореза можно разделить белковые смеси, а также охарактеризовать чистоту белковых препаратов. В последнее время этот метод широко применяется для препаративного выделения ферментов. Принцип электрофореза состоит в том, что молекулы белка, содержащие кислые и основные ионизированные группы, имеют определенный свободный электрический заряд. Поскольку его величина у молекул различных белков неодинакова, то скорость перемещения их в электрическом поле при рН, несоответствующем изоэлектрической точке, будет различна. Вследствие этого под действием электрического тока смесь белков разделяется на несколько отдельных зон, или фракций. Скорость движения частицы в электрическом поле называют электрофоретической подвижностью (ЭП) и по ее величине идентифицируют белковые фракции. ЭП зависит не только от суммарного электрического заряда, но и от р, ионной силы среды, а также молярной концентрации буферных растворов, которые являются средой для перемещения белковых молекул. Существенное влияние на подвижность молекул в электрическом поле оказывает и их молекулярная масса. В настоящее время наиболее широкое применение нашел дискэлектрофорез в полиакриламидном геле, разработанный в 1959 г. Л. Орнстейном и Б.Дэвисом. При этом применяют прерывистую разделяющую систему из пары буферов и разных слоев геля, отличающихся друг от друга по размерам пор. Гелями заполняют цилиндрические трубки или покрывают пластинки. При разделении белковая смесь сначала концентрируется в узкой полосе крупнопористого полиакриламидного геля, а затем в мел created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 17 копористом геле ее компоненты распределяются по величине, форме и заряду молекул. Как известно, гели отличаются большой вязкостью и вследствие этого более высоким сопротивлением трения. Этими свойствами объясняются высокая эффективность электрофореза в полиакриламидном геле и хорошая четкость разделения компонентов смеси. По окончании электрофореза гели помещают в инкубационную среду с красителем, который окрашивает белковые зоны с интенсивностью, соответствующей концентрации компонента. Окрашенные гели называют электрофореграммами. Компоненты смеси характеризуют через электрофоретическую подвижность Rf, которую определяют как отношение где х – путь, пройденный компонентом смеси, 1– путь, пройденный индикаторным красителем. Широкое применение электрофорез нашел при исследовании ферментных систем растений. В настоящее время установлено, что ферменты молекулярно гетерогенны. Они состоят из нескольких молекулярных форм – изоферментов. Каждая изоформа фермента катализирует одну и туже реакцию, но отличается от других форм молекулярной массой, суммарным зарядом молекулы, оптимумом рН. Особенно гетерогенны ферменты окислительного обмена клетки. Так, у пероксидазы обнаружено до 20 изоформ, у каталазы – 5, у полифенолоксидазы – 6. Высокая гетерогенность ферментов обеспечивает способность живого организма быстро адаптироваться к постоянно изменяющимся внешним условиям. Вследствие этого электрофорез нашел широкое применение в биологии, в частности для диагностики различных заболеваний у растений. Ряд исследователей использовали этот метод для выяснения природы устойчивости растений к различным фитопатогенам на основании изучения спектра изопероксидаз. Так, например, было установлено, что у устойчивых к патогенам форм люцерны в спектре присутствуют изопероксидазы си с высокой активностью фермента. В спектрах восприимчивых сортов такие изоформы выявлены небыли (рис. 2). При искусственном заражении патогеном как устойчивые, таки восприимчивые формы в ответ на заражение синтезировали изопероксидазу с Р = 0,26. Таким образом, изучая электрофоретические спектры изопороксидаз растений, можно не только выявлять устойчивые сорта, но и давать оценку совместимости патогена с растением-хозяином. Рис. 2 - Электрофоретические спектры изопероскидаз люцерны (здоровые и пораженные микоплазмозом 31 — здоровый устойчивый 32 — здоровый восприимчивый Б — больной устойчивый Б — больной восприимчивый. Активность фермента - - - низкая -средняя- высокая PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 19 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Какие соединения относят к высокомолекулярным Какую роль играют макромолекулы В живых организмах и технике. Каковы особенности структуры ВМС, в каких пределах лежат размеры их молекул 3. В чем особые свойства веществ, состоящих из линейных макромолекул 4. По каким признакам растворы высокополимеров относят к истинным растворам 5. В чем проявляется сходство растворов ВМС с коллоидными растворами В чем их различие 6. Что такое набухание ВМС, чем обусловлен этот процесс Как рассчитывается степень набухания полимера В чем суть ограниченного и неограниченного набухания 7. Какая вода называется связанной В чем биологическая роль связанной воды 8. Какие соединения относятся к полиэлектролитам 9. Что такое изоэлектрическое состояние белков, изоэлектрическая точка 10. В чем причины устойчивости растворов ВМС? Как ее можно нарушить 11. Что такое высаливание В чем его сущность 12. Чем обусловлены различия в высаливающем действии различных электролитов 13. Что такое коацервация В чем сущность этого процесса, чем он отличается от высаливания 14. Какие системы называются студнями Какое практическое значение имеет процесс застудневания 15. Какие структуры называются гелями 16. Что такое тиксотропия Где можно наблюдать этот процесс в природных условиях 17. В чем сущность синерзиса? Привести примеры этого процесса в природе. 18. В чем суть электрофореза белков На каком свойстве белковых молекул основан этот метод PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 20 19. Как метод электрофореза применяют для исследования биологических объектов 20. Определить знак заряда частиц желатины, помещенной в раствор с рН = 3,2. Изоэлектрическая точка желатины соответствует рН=4,2. 21. В буферную ацетатную смесь, приготовленную из 1 мл раствора СН3СООН и 9 мл раствора СН3СООNа одинаковой концентрации, помещен растительный белок глиадин. Его ИЭТ соответствует рН = 4,0, константа диссоциации Определить знак заряда глиадина в этом буфере. 22. В фосфатную буферную смесь, состоящую из 3,5 мл 0,1 Ми мл 0,1 М Na2НРО4 помещен глобулин моркови. Его ИЭТ соответствует р = 4,4. Определить знак заряда глобулина в этом растворе, если 23. Изоэлектрическая точка яичного альбумина находится при рН = 4,8. Белок помещен в раствор с концентрацией ионов водорода 2• 1 0 моль/л. Определить знак заряда альбумина в этом растворе. 24. В карбонатную буферную смесь, приготовленную из 6 мл 0,5 М раствора Na2CO3 и 12 мл 0,1 М раствора Na2CO3, помещен вирус кардиковости томата с ИЭТ при рН = 4,1. Определить знак заряда белка в таком растворе, если. 25. Изоэлектрическая точка фермента рибонуклеазы составляет р = 9,4. Фермент помещен в раствор с концентрацией ионов водорода 3,4*10^-5 моль/л. Определить направление движения частиц фермента при электрофорезе. 26. Белок конопли эдестин имеет ИЭТ при рН = 5,5. Определить знак заряда молекулы эдестина, если его поместить в раствор с концентрацией ионов гидроксила 6,3 10 моль/л. 27. Определить направление движения частиц казеина при электрофорезе в буферном растворе, приготовленном из 4 мл 0,1 М раствора СН3СООН и 8 мл 0,1 М раствора СН3СООNa, если ИЭТ казеина находится при рН = 4,7, а PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 21 7 ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ Опыт 1. Определение изоэлектрической точки белка В изоэлектрическом состоянии белки обладают наименьшей растворимостью. Вследствие этого даже при очень незначительных внешних воздействиях (охлаждении, добавлении электролита, нерастворителя) белки выпадают в осадок. По помутнению раствора можно экспериментально определить значение рН среды, при котором белковые молекулы находятся в изоэлектрическом состоянии. Реактивы и оборудование пипетки на 1 мл, пробирки, штатив, водный раствор яичного белка, буферные растворы. Ход опыта 1. Возьмите 4 пробирки, в каждую из них прилейте 0,5 мл водного раствора белка и добавьте 1 мл буферных растворов со значениями рН, указанными в табл. 3. Содержимое пробирок осторожно перемешайте. 2. В пробирки добавьте по 0,5 мл этилового спирта. При значении рН, равном или близком к ИЭТ белка, последний выпадает в осадок. Величина р буферного раствора, при которой наблюдается наибольшее помутнение, соответствует изоэлектрической точке белка. На основании экспериментально полученных данных сделайте заключение о величине ИЭТ яичного белка и объясните роль спирта для процесса высаливания. Таблица 3 Компоненты № пробирки 1 2 3 4 Буферная смесь, мл 1,0 1,0 1,0 1,0 рН буферной смеси 3,7 4,7 5,6 6,0 Белок, мл 0,5 0,5 0,5 0,5 Спирт, мл 0,5 0,5 0,5 0,5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 22 Опыт 2. Изучение кинетики набухания зерна Зерновые, крупяные и бобовые культуры (пшеница, просо, рис, горох) ограниченно набухают вводе. Различия в кинетике их набухания устанавливают путем наблюдения за увеличением объема зерна, засыпанного в мерные цилиндры и залитого водой. Реактивы и оборудование 4 мерных цилиндра на 25 мл, зерно, дистиллированная вода. Ход опыта 1. Зерно насыпьте в мерные цилиндры на 1/3. Залейте дистиллированной водой до 3/4 объема цилиндра. 2. За процессом набухания наблюдайте в течение 40...50 мин. Каждые 10 мин отмечайте условный объем набухшего зерна. Результаты запишите в табл. 4 и сделайте заключение о способности зерна различных культур к набуханию. Таблица 4 -Условный объем набухающего зерна Зерно Время, мин 0 10 20 30 40 50 Пшеница Просо Рис Горох Опыт 3. Электрофорез пероксидазы в полиакриламид- ном геле Пероксидаза - широко распространенный в живых организмах фермент. Будучи по своей природе полифункциональным, этот белок участвует во многих процессах жизнедеятельности растений, таких как рост, морфогенез, защита от стрессов. Известно, что пероксидазная активность может многократно повышаться в инфицированных фитопатогенами растениях. Причем, наиболее существенно повышается активность связанных с клеточной стенкой форм этого фермента, где он может эффективно включаться в синтез полифенольных соединений и лигнина. В связи с этим, некоторые исследователи считают, что пероксидазы, являясь наиболее эффективным протекторным белком, включают механизм наиболее ранних ответных реакций растения на стрессы. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 23 Гистохимические исследования показали, что пероксидаз- ная активность при грибном патогенезе наблюдается в области папилл, которые формируются вместе проникновения патогена что подводит к мысли о наличии на поверхности клеточных стенок гриба векторов способных привлекать к себе пероксидазы. Сравнивая изоферментный состав пероксидаз различных по устойчивости сортов можно выявить иммунные формы растений. Пероксидаза относится к группе железопротеидов, поскольку все компоненты цитохромной системы данного фермента содержат железопорфириновую простетическую группу Обратимое окисление и восстановление цитохромов путем отдачи и присоединения электрона связаны с изменением валентности железа фермента в коферменте. Благодаря этому цитохромы являются переносчиками электронов. Фермент катализирует реакцию окисления некоторых органических соединений фенолов, полифенолов, ароматических аминов) в присутствии перекиси водорода, с которой пероксидаза образует комплексное соединение. Активированная перекись становится акцептором водорода, отщепляемого отсоединения, которое подвергается окислению (донора. Общая схема такова Донор + НО → окисленный донор +НО Например PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 24 Пирокатехин хинон Реактивы и оборудование трис-глициновая буферная смесь (рН = 8,3), 5 й концентрирующий и 6 й разделяющий полиакриламидные гелий раствор бензидина в ацетатном буфере (СН 3 СООН, СН 3 СООNа, рН = 4,7), 3 й раствор перекиси водорода (H 2 O 2 ), аппарат для вертикального электрофореза в тонком слое ПААГ. Ход опыта Для определения изоферментного состава пероксидаз готовят вытяжку из зеленой массы растений с трис-глициновым буфером (рН = 8,3) в соотношении 1:10. Электрофорез проводят в тонком слое ПААГ на пластине размерами 100х160х1,5 мм в м концентрирующем (рН = 6,9) им градиентном разделяющем (рН = 8,48) гелях. 1. Вытяжку нанесите на бороздки в ПААГ. Время электрофореза около 2 ч. 2. После окончания электрофореза гелевую пластинку опустите на мин. в 0,1 й раствор бензидина в ацетатном буфере (рН = 4,7), а затем в 0,3 й раствор Н На электрофореграмме проявляются зоны с пероксидазной активностью. 3. По интенсивности окраски зоны определите активность соответствующей изоформы. 4. Сравнивая спектры изопероксидаз устойчивых и Восприимчивых сортов, выявите изоформы фермента, ответственные за иммунитету данной культуры. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 25 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Болдырев АИ. Физическая и коллоидная химия. М Высш. шк, 1983. 407 с. 2. Гааль Сидр. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М Мир, 1982. 446 с. 3. Евстратова К.И. и др. Физическая и коллоидная химия /К.И. Евстратова, НА. Купина, ЕЕ. Малахова. М Высш. шк, 1990. 487 с. 4. Захарченко В.Н. Коллоидная химия. М Высш. шк, 1989. 234 с. 5. Практикум по физической и коллоидной химии / Под ред. К.И. Евстратовой. М Высш. шк, 1990. 225 с. 6. Хмельницкий РА. Физическая и коллоидная химия. М Высш. шк, 1988. 399 с. 7. IЦур А.Л. Высокомолекулярные соединения. М Высш. шк, 1971. 519 с. 8. Щукин ЕД. и др. Коллоидная химия 1 Ед. Щукин, А.В. Перцов, Е.А. Амелина. М Высш. шк, 1992. с. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 26 Технический редактор – Т.И. Медведева Отпечатано в издательско- полиграфическом центре ФГОУ ВПО МичГАУ Подписано в печать 10.01.07. г. Формат х 1 /16, Бумага офсетная № 1. Усл.печ.л. 1,4 Тираж 155 экз. Ризограф Заказ № _______________________________________________________________ Мичуринский государственный аграрный университет 393760, Тамбовская обл, г. Мичуринск, ул. Интернациональная, 101, тел. +7 (47545) 5-26-35 E-mail: mgau@mich.ru PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com |