Занятие 1 промышленные способы биотрансформации органических соединений
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
4 . Направления использования БАД в технологии продуктов функционального питания. В настоящее время могут быть выделены следующие направления использования БАД в технологии продуктов питания: - молочные продукты (аскорбиновая кислота, витамины группы В, -каротин, витамин Е, макро- и микроэлементы, пробиотические микроорганизмы, пребиотики, пептиды, линолевая кислота); - зернопродукты (пищевые волокна, витамины А, В, Е, кальций, фитодобавки); - хлебопродукты (йодказеин, витамины группы В, пищевые волокна и непереваримые олигосахариды, пробиотики); - жировые эмульсионные продукты и растительные масла (полиненасыщенные жирные кислоты, жирорастворимые витамины); - мясопродукты (молочно-белковые концентраты, белковые гидролизаты и концентраты незаменимых аминокислот, олигосахариды-пребиотки, пищевые волокна, пробиотические микроорганизмы); 39 - натуральные соки и напитки (аскорбиновая кислота и витамины группы В, - каротин, пищевые волокна, фитодобавки). ИП РАМН был разработан ассортимент продуктов лечебно-профилактического назначения, обогащению микро- нутриентами, а именно: витаминами и бета-каротином; витаминами, минеральными веществами и бета-каротином; лечебно-профилактические соли, обогащенные калием, магнием и йодом, а Министерством здравоохранения и Госкомитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ утверждены соответствующие инструкции и методические рекомендации по употреблению этих продуктов. Институтом питания совместно с ГУ ВНИИ молочной промышленности проведены исследования по использованию поливитаминного премикса 730/4 для обогащения молока и молочных продуктов. Премикс представляет собой смесь 12 основных необходимых человеческому организму витаминов с лактозой. Добавление премикса к молоку в соответствии с разработанной нормативно-технической документацией в количестве 750 г на 1 т молока обеспечивает удовлетворение одним стаканом молока половины средней суточной потребности человека практически во всех витаминах В МГУПБ разработана технология сухой витаминно-минеральной добавки, предусматривающая получение молочно-белкового концентрата методом ультрафилътрации с последующим внесением в него глицерофосфат железа, жиро- и водорастворимых витаминов. Добавку получают в сухом виде с содержанием белка - 52- 55 %; железа - 1,0-1,5 г, витаминов B1 - 0,15-0,2; В 2-0,2-0,23; А - 0,1-0,12; С - 10,0-10,5; Е - 1,4-1,5г на 1 кг сухого продукта. Добавка позволяет повысить биологическую и пищевую ценность обогащаемого продукта, так как содержит такое количество витаминов и минеральных веществ, которое составляет половину суточной потребности детей школьного возраста. В нашей стране на протяжении ряда лет ведется работа по адаптации культур бифидобактерий к молоку и разработке напитков, содержащих живые культуры бифидобактерий. В последние годы разработан ряд технологий напитков с использованием комбинированных заквасок, обогащенных биомассой бифидобактерий: бифидокефир, биойгурт, биопростокваша, бифилайф, бифилюкс и др. Примером является кефир, обогащенный биомассой бифидобактерий «Бифидок», выпускаемый с м.д. жира 1,0; 2,5; 3,2 %; с витамином С. Кефир «Особый». Биологическая ценность продукта повышена за счет обогащения белками молока (м.д. белка в готовом продукте составляет 3,4–3,5%). В рецептуру продукта введены молочно-белковые концентраты: казеинат натрия из казеина и творога (м.д. СВ 94%), казеинат натрия влажный творожный (м.д. СВ 18%), копреципитат растворимый (м.д. СВ 94%), концентрат натурального казеина сухой (м.д. СВ 92%) и жидкий (м.д. СВ 17 %). В Кемеровском технологическом институте пищевой промышленности разработана технология молочно-белковой пасты «Бодрость» с использованием минерально-пищевой биодобавки «Нектарин». Она представляет собой смесь цветочной пыльцы с медом. БАД содержит в своем составе все необходимые для жизнедеятельности человека вещества: белки - до 3,1 %; липиды - до 1,6 %; редуцирующие сахара - до 15,63 %; жиро- и водорастворимые витамины: токоферолы - до 14,87; каротиноиды - до 3,76 %; аскорбиновую кислоту до 16,54; биофлавоноиды - до 179,11 мг и др.; микро- и 40 макроэлементы, основными из которых являются: фосфор - до 93,4; калий до 61, кальций - до 46,8; магний - до 433 мг. Важно отметить присутствие в БАД цинка (до 1 мг/100 г), который редко встречается в пищевых продуктах, и необходим для обменных процессов. Внесение; 10 % БАД «Нектарин» в творог позволило создать продукт с высоким содержанием витаминов и минеральных веществ, обладающих нежным вкусом цветочно- медовым ароматом и пастообразной консистенцией. Биопаста «Бодрость» рекомендуется для детей и взрослых. Во ВНИМИ проведены работы по созданию низкохолестериновых молочных продуктов. Так, разработана сметана «Здоровье», в которой на 50 - 55 % по сравнению с исходными сливками снижено содержание холестерина. Для производства сметаны используется закваска «ТОН», представляющая собой симбиоз молочнокислых и пропионовокислых бактерий, которая продуцирует витамины группы В и обладает холестеринразрушающим действием. При определении состава сметаны «Здоровье» учтена потребность в витаминизации продукта, так как обогащение диеты витаминами оказывает благотворное влияние на функцию миокарда и состояние сосудистой стенки. Продукт дополнительно обогащен биологически активными добавками: аскорбиновой кислотой и циклокаром (препарат бета-каротина). 41 Практическое занятие 5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ГЕННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕНРИИ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ И ЖИВОТНОВОДСТВЕ 1. Основы биотехнологии рекомбинантных ДНК. 2. Методы генетической инженерии растений. 3. Современные направления получения трансгенных растений. 4. Генная и клеточная инженерия в животноводстве. 1. Основы биотехнологии рекомбинантных ДНК. Под рекомбинантными понимают молекулы ДНК, образованные объединением в искусственных условиях двух или более фрагментов ДНК, выделенных из разных биологических источников. Получение р-ДНК стало возможным благодаря развитию экспериментальных методов генетической инженерии, позволяющих проводить направленное конструирование генетических систем на молекулярном уровне вне организма с последующим введением в живой организм. При этом рДНК становятся частью генетического аппарата организма-реципиента, сообщая ему уникальные генетические, биохимические и физиологические свойства. Ферменты генетической инженерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т. д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии. ДНК-полимеразы. Одним из наиболее часто используемых в генетической инженерии ферментов является ДНК-полимераза I, выделенная из Е coli или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5'->3' путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи. Использование специфических термостабильных ДНК-полимераз позволило проводить амплификацию – множественную наработку любого фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из некоторых вирусов была выделена специфическая ДНК-полимераза — РНК-зависимая ДНК-полимераза, названная обратной транскриптазой, или ревертазой Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК на РНК-матрице. ДНК-лнгаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Наиболее часто для лигирования в генной инженерии используют ДНК-лигазу фага Т4. С помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми». Нуклеазы – это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых 42 кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом). Рестриктазы. Отдельную группу, особенно с утилитарной точки зрения ее применения в генной инженерии, представляют специфические эндонуклеазы – рестриктазы. Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. coli, введенная в клетки другого штамма, не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами – рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются около 200. Рестриктазы представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы III типа похожи на рестриктазы 1 типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20-35 н. п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются практических целей. Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул – рестриктазы II типа. У них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями – палиндромами. Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК: 1) мелкощепящие – сайт рестрикции которых представлен четырьмя нуклеотидными парами; 2) среднещепящие – сайт рестрикции – 6-8 н. п.; 3) крупнощепящие – сайт рестрикции – 10-14 н. п. Рестриктазы II типа можно отнести к двум группам по тому, как они расщепляют последовательность ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие – со сдвигом, с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие», т. е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки. Ферменты рестрикции позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера (10 6 - 10 11 н. п.) в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований. С помощью метода электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Метод электрофореза основан на разделении (фрагментов) молекул ДНК, движущихся с различной скоростью в электрическом поле. 43 Использование электрофореза для разделения рестрикционных фрагментов дает возможность получать рестрикционные карты – последовательности ДНК с нанесенными на них сайтами разрезания для различных рестриктаз. Определение нуклеотидной последовательности – секвенирование. Методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение. Но они также способствовали разработке исключительно эффективных новых методов секвенирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 350-1000 нуклеотидных пар и более, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Существует два основных принципа секвенирования: химический и ферментативный сиквенс. Химический сиквенс основан на избирательной химической деградации нуклеотидов. Наиболее широко сейчас применяется метод ферментативного секвенирования, или метод секвенирования путем терминации (остановки синтеза) цепи, предложенный Ф. Сэнгером в 1977 г. В основе метода Сэнгера лежит принцип репликации комплементарной цепи ДНК на одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах последовательности ДНК обрыве синтеза, т. е. терминации роста цепи. Основным моментом ферментативного секвенирования является терминация синтеза строящейся цепи. Терминирующими агентами, приводящими к остановке репликации, являются 2', 3'-дидезокситрифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ). Эти модифицированные основания не могут образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи терминируется в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид. 2. Методы генетической инженерии растений. Традиционные методы селекции, основанные, главным образом, на половой гибридизации и отборе, позволяют получать новые генотипы растений. Генно- инженерные манипуляции позволяют решать ряд важных задач по повышению устойчивости новых форм, линий, сортов и гибридов сельскохозяйственных растений к патогенам и сокращению продолжительности выведения новых сортов. Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены как про- кариотического, так и эукариотического происхождения, переносить этот ген (или несколько генов) в хромосомы реципиентного растения и обеспечивать его экспрессию. Применение этой технологии делает поиск более целенаправленным и значительно расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом. Важным преимуществом растений по сравнению с животными является возможность получения целого растения из одной клетки, основанная на свойстве тотипотентности. Результаты генетической инженерии растений во многом зависят от разработки методов культуры тканей, особенно методик регенерации различных растений. Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений: 1) выбор гена и его клонирование; 2) подбор генотипа растения-реципиента; 3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента; 4) регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений. Выбор гена и его клонирование. Выбор гена определяется необходимостью передачи растению определенного хозяйственно-полезного признака. В настоящее время 44 для трансформации растений используются в основном гены, определяющие моногенные признаки, такие, как устойчивость к гербицидам и пестицидам, устойчивость к некоторым другим видам стрессов. Большинство генов, определяющих эти признаки, выделены из бактериальных геномов. В последнее время в качестве доноровгенов, определяющих признаки устойчивости растений. Такие гены не могут быть введены в геном растений- реципиентов путем половой гибридизации из-за биологической несовместимости растений, относящихся к разным видам, родам и даже семействам. Еще более сложной является проблема получения признаков, относящихся к группе количественных признаков: качество зерна, устойчивость к засухе, низким и высоким температурам. Подбор генотипа растения-реципиента. В идеальном вариант в качестве реципиента подбираются растения такого сорта или линии, которые отвечали бы требованиям производства по урожайности, качеству плодов, устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам, но имели бы лишь одно отрицательное свойство, например неустойчивость к насекомым. Тогда введение в геном растений этого сорта, например, бактериального гена bt2, экспрессирующего белок прототоксин, вызывающий гибель насекомых, приводил бы к значительному улучшению выбранного сорта. Также выбор генотипа растения-реципиента определяется способностью его клеток к регенерации в целое фертильное растение, так как показано, что это свойство значительно зависит отгенотипа. Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента. Проблема переноса чужеродных генов в геном растений существенно облегчается в связи с обнаружением Ti-плазмид почвенных агробактерий Agrobacterium tumefaciens, позволяющих вводить чужеродные гены в геном двудольных и некоторых однодольных растений. В последнее время довольно широко, особенно для трансформации клеток однодольных растений, используется метод биобаллистической трансформации. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, платины или золота, диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Каллус или суспензия клеток вносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биобаллистическую пушку на расстоянии 10- 15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые или золотые частички с огромной скоростью выбрасываются из пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых или золотых частиц, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра будут находиться трансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Важно обеспечить экспрессию чужеродного гена в геноме растения-реципиента и стабильное наследование признака в поколениях. Экспрессия введенного гена зависит от ряда причин, в том числе от места интеграции гена в геном растения, последующего метилирования промоторной области и введенного гена и т.п. |