Занятие 1 промышленные способы биотрансформации органических соединений
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
2. Типы иммобилизованных биокаталитических систем. Методы иммобилизации, первоначально разрабатывавшиеся для использования ферментных систем, в настоящее время все шире используются для фиксации клеток микроорганизмов-продуцентов, клеточных органелл, комбинированных биообъектов. Рассмотрим особенности функционирования иммобилизованных биокаталитических систем. Иммобилизованные ферменты. При иммобилизации снижается вероятность изменения нативной конформации под действием внешних факторов (температуры, рН, органических растворителей). В связи с этим повышается стабильность фермента, диапазон рабочих значений температура и рН. Даже если происходит денатурация, при определенных условиях иммобилизованный фермент ренатурирует быстрее свободного. Повышение стабильности также обуславливает увеличение устойчивости ферментных препаратов к микроорганизмам, возможность длительного хранения при температуре до - 15°С. Стабилизация фермента достигается при правильном подборе условий и метода стабилизации. В противном случае наступает дестабилизация вплоть до необратимой денатурации. Наряду со стабилизацией часто наблюдается снижение активности препарата, что обусловлено искажением структуры, ограничением доступа кофакторов и субстрата, особенно, если фермент со всех сторон «экранирован» носи гелем. В то же время, иммобилизация приводит к снижению эффектов ингибирования ферментов. 11 Одностадийные реакции, не требующие кофакторов, относятся к биокаталитическим процессам первого поколения. При переходе к процессам второго поколения5зависящим от кофакторов (ATP, NAD, NADP, FPr), возникает проблема регенерации кофакторов. В настоящее время предложены два способа ее решения: -сшивка кофактора с ферментом или носителем; - увеличение массы кофактора за счет присоединения к интенсивно набухающим в водяной среде полимерам, что позволяет удерживать полученные агломераты при ультрафильтрации кулътуральной жидкости и рециклировать кофактор в биореактор. Иммобилизация клеток. Применение иммобилизованных клеток имеет следующие преимущества: - не требуется проведение выделения и очистки ферментного препарата; - клетки могут осуществлять многостадийные биокаталитические процессы, при наличии всех необходимых кофакторов. В то же время, применение иммобилизованных клеток целесообразно, когда речь идет об «эксплуатации» внутриклеточных ферментных систем. В промышленности часто используют инактивированные клетки, способные осуществлять одностадийные процессы; кроме того, компоненты цитоплазмы, не несущие каталитических функций, являются балластом и даже разрушают фермент или целевой продукт (протеазы). Живые клетки, иммобилизованные различными способами, характеризу¬ются нестабильностью и непостоянством во времени каталитических свойств. Они, как правило, не прекращают рост и размножение при иммобилизации, что приводит к уходу делящихся клеток с поверхности носителя, разрушению структуры гелей, капсул. Использование подобных биокаталитических систем наиболее целесообразно при непрерывном культивировании биомассы дрожжей, бактерий. Иммобилизация клеток микроорганизмов, как правило, приводит к утрате ими жизнеспособности. Например, глутаровый альдегид, проникая внутрь клетки, образует многочисленные сшивки между органеллами, ферментами клетки, блокируя основные функции жизнедеятельности. В то же время происходит стабилизация нативной конформации и повышение каталитической активности. В других случаях при иммобилизации вводят агенты, ингибирующие рост микроорганизмов (антибиотики), клеток растений (фитогормоны). При иммобилизации микробных клеток в ряде случаев параллельно проводят пермеабилизацию - повышение проницаемости клеточных мембран, в результате чего клетки выделяют в культуральную жидкость максимальное количество целевого продукта. Иногда сама процедура иммобилизации вызывает повышение проницаемости мембраны; однако, нередко требуется дополнительное регулирование рН, обработка клеток органическими растворителями. При использовании клеток растений радикальным методом является удаление клеточной стенки с последующей иммобилизацией протопласта. Иммобилизация клеточных органелл. Изолированные клеточные органеллы (хлоропласты, митохондрии, микросомы, лизосомы, пероксисомы и др.) содержат ферменты или полиферментные системы и свободны от других компонентов клетки. Выделение органеллы или группы органелл с технологической точки зрения проще, чем выделение и очистка ферментного препарата. 12 Соиммобилизация биообъектов. Соиммобилизация нескольких ферментов, видов микроорганизмов; ферментов и клеток проводят для осуществления многостадийных биохимических процессов. При использовании нескольких ферментов проведение основной реакции может быть сопряжено с регенерацией кофактора (трансформация кетокиелот в аминокислоты); соиммобилизация клеток нескольких микроорганизмов проводится для реализации многоступенчатых микробиологических трансформаций (получение L-аскорбиновой кислоты). Наиболее распространена соиммобилизация ферментов и клеток микроорганизмов. При этом используются два варианта: - клетки имеют ту же каталитическую активность, что и фермент; - использование системы позволяет ускорить процесс и повысить выход целевого продукта; - клетки и фермент катализируют разные реакции поэтапной трансформации субстрата в целевой продукт. При использовании подобных систем важным показателем является функциональная совместимость биообъектов (оптимум температуры, рН, потребность в специфических факторах и т.д.). 3. Аппаратурное оформление биотехнологических процессов с использованием иммобилизованных ферментов и клеток. При иммобилизации биообъекты из разряда гомогенных катализаторов переходят в разряд гетерогенных, что накладывает отпечаток на аппаратурное оформление ферментационных процессов; управление процессами в биореакторе: - в нужный момент времени реакция может быть прекращена; - биообъект должен быть многократно использован в биотехнологическом процессе при условии его регенерации; - целевой продукт может быть получен без примеси фермента, что особенно важно для фармацевтической и пищевой промышленности. Иммобилизованные ферментные системы функционируют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую протекает среда с субстратом, подлежащим химическому превращению (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерывным режимом используется и периодический. Наиболее целесообразным является использование непрерывной ферментации. Для реализации процессов биосинтеза и биотрансформации с использованием иммобилизованных биообъектов используют следующие типы оборудования. Реакторы с механическими мешалками (одно- и многоступенчатые). Для указанных целей нашли применение реакторы, функционирующие по принципу хемостата. Если иммобилизованные биокатализаторы имеют вид гранул, то большое значение имеет их плотная упаковке в реакторе. Недостатком реакторов с механическим перемешиванием является опасность повреждения гранул или капсул. Повреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, закрепляя определенным образом его гранулы. Например, в биореакторе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен иммобилизованный фермент. Также используются биореакторы, в которых сетчатая вставка образует полое пространство с внутренней стенкой емкостного аппарата. 13 Аппараты с упакованной насадкой биокатализатора. Представляют собой аппараты колонного типа с подводом раствора субстрата в нижней части, в которых слой биокатализатора располагается по всему объему аппарата между двумя фильтрующими сетками. Недостатком таким систем является отсутствие перемешивания среды и, как следствие, затрудненная диффузия растворенных веществ и кислорода. Аппараты с псевдоожиженной насадкой. Представляют собой аппараты колонного типа, в которых гранулю иммобилизованного биообъекта зафиксированы между двумя фильтрующими сетками. Под воздействием протекающего раствора и воздуха создается псевдоожиженный слой гранул биокатализатора, что обеспечивает хорошие условия аэрации и диффузии растворенных веществ. Аппараты с биообъектами, иммобилизованными путем включения в полупроницаемые мембраны. В данном случае конструкция аппарата определяется типом используемых мембран и способом их компоновки в мембранном модуле. По аналогии с процессами мембранной фильтрации используют аппараты типа фильтр-пресс, реакторы с полыми волокнами, трубчатые, рулонные. 4. Применение процессов биотрансформации и иммобилизованных биообъектов в пищевой биотехнологии. Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с преимуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные технологические процессы. Следует отметить, что все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов. Основными направлениями использования иммобилизованных биообъектов в пищевой биотехнологии являются: 1. Гидролиз олиго- и полисахаридов (производство глюкозо-фруктозных сиропов, патоки, глюкозы, глюкозо-галактозных сиропов и низколактозных молочных продуктов). 2. Синтез непереваримых олигосахаридов-пребиотиков (лактосахароза. галкто- и фруктоолигосахариды). 3. Получение оптически активных L-аминокислот (выделение из рацемических смесей, синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония, синтез L-аланина из L- аспарагиновой кислоты). 4. Производство интенсивных подсластителей на основе реакций поликонденсации аминокислот с образованием сладких дипептидов (аспартам). 5. Синтез пищевых кислот (биотрансформация фумаровой кислоты в L-яблочную кислоту). 14 Практическое занятие 2. ПОЛУЧЕНИЕ НУТРИЕНТОВ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ 1. Направления получения пищевого белка методами биотехнологии. 2. Особенности технологии белково-витаминных и белково-липидных концентратов на основе биомассы дрожжей. 3. Биотехнологические процессы получения пищевых кислот (лимонной, уксусной, молочной). 1. Направления получения пищевого белка методами биотехнологии. В настоящее время в мире существует дефицит пищевого белка. При суточной норме потребления 70 г/сутки среднее потребление составляет 60 г/сутки. По данным РАМН в России начиная с 1992 года потребление белков животного происхождения снизилось на 25-35 % и составляет около 49 % от общего рациона белковой пищи при рекомендуемом соотношении животных и растительных белков 55 : 45. Общий дефицит пищевого белка на планете по данным ФАО/ВОЗ оценивается в 15-20 млн. тонн в год. Пути решения проблемы белкового дефицита: - повышение хранимоспособности сырья и пищевых продуктов, в первую очередь, животного происхождения; - повышение производительности в животноводстве и растениеводстве методами селекции, генетической и клеточной инженерии; - корректировка аминокислотного состава пищевого сырья и продуктов питания; - вовлечение в производство продуктов питания белка микроорганизмов, микро- и макромицетов, гидробионтов, получаемого методами биотехнологии. Одним из перспективных путей получения белковых веществ является микробный синтез - это реальное решение проблемы снятия дефицита белка в пище и кормах. Сырье, которое непосредственно не может идти на изготовление пищевых продуктов, с помощью микроорганизмов превращается в богатую белками биомассу. В этом случае необходимый азот в форме дешевых неорганических соединений (мочевины, солей аммония, нитратов) может почти без потерь использоваться для построения белков. Микроорганизмы способны накапливать до 60 - 70 % белка от АСБ. Существуют три основных направления использования белка одноклеточных для пищевых целей: 1. цельная биомасса микроорганизмов; 2. частично очищенная от балластных веществ (облагороженная) биомасса; 3. изолированные из биомассы очищенные белки. К микробным белкам, предназначенным для пищевых целей, предъявляются следующие требования: - безопасность по санитарно-гигиеническим и токсикологическим показателям; - высокая пищевая и биологическая ценность; - соответствие органолептических показателей аналогам растительного и животного происхождения; - низкая себестоимость. В настоящее время можно выделить четыре основных направления получения пищевого белка биотехнологическими методами: 15 1. получение биомассы дрожжей с высоким (не менее 50 % от АСБ) содержанием белка; 2. направленный синтез белков микромицетами; 3. выращивание макромицетов в условиях биореактора; 4. искусственное культивирование водорослей и других гидробионтов, богатых белком. Применение цельной необлагороженной биомассы микроорганизмов как пищевого продукта вызывает наибольшие возражения, связанные с медико-биологическими аспектами. В настоящее время Министерством здравоохранения РФ разрешено использование в пищевых целях лишь биомассы высших базидиальных грибов. В США Управлением по контролю за пищевыми продуктами было дано разрешение на применение цельноклеточной биомассы дрожжей, выращенных на этаноле в стерильных условиях. В России и за рубежом проводятся исследования по получению и применению в пищевых целях облагороженной биомассы микроорганизмов. В этом отношении наиболее исследованным микробиологическим объектом являются дрожжи. Дрожжи содержат 40 - 55 % белка и усваиваются организмом человека на 85 - 88 %, занимая по этому показателю промежуточное положение между белками растительного и животного происхождения. Белок дрожжей обычно беден метионином и цистеином, но богат лизином и треонином. Отсюда очевидна целесообразность его переработки вместе с белками зерновых культур. В Великобритании, Франции, США, Нидерландах получают белковые экстракты из дрожжей в виде паст или порошкообразных продуктов. Дрожжевые экстракты содержат от 30 до 55 % белка и используются при производстве консервов, пищевых концентратов первых и вторых блюд, хлебобулочных, кондитерских и колбасных изделий, плавленых сыров. Добавление дрожжевых паст и порошков обычно не превышает 1,5 - 10 % массы пищевого продукта. В нашей стране были также разработаны технологии белковых пищевых добавок на основе хлебопекарных и пивных осадочных дрожжей, ферментативных гидролизатов и белковых изолятов из дрожжевой и бактериальной биомасс, выращенных на пищевых и непищевых питательных средах (меласса, этанол, метанол, природный газ, н-парафины). На основе исследований, проводившихся во ВНИИСинтезбелок, была разработана технология высокомолекулярных белковых изолятов из дрожжей и бактерий. Технологическая схема включает следующие основные этапы: дезинтеграция клеток микроорганизмов в водной суспензии на установке, основанной на принципе декомпрессии, щелочная экстракция клеточных белков, нейтрализация, отделение остатков клеточных структур от белкового экстракта, очистка и сгущение последнего на ультрафильтрационных установках и обезвоживание. Белковые изоляты из микроорганизмов содержат около 80 % белка, 2 - 3 % нуклеиновых кислот и имеют молекулярную массу в диапазоне от 50000 до 300000 Д. Теоретической предпосылкой использования микроскопических грибов в пищевой биотехнологии является способность многих видов к окнверси углеводов и других углеродных субстратов в вещества белковой природы. В качестве продучентов пищевого белка могут быть использованы грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Mucor. Ценным источником пищевого белка являются съедобные шляпочные грибы. Производство спорофоров и мицелия базируется на совершенно различных технологиях. 16 Шляпочные грибы выращивают в питомниках, а производство мицелия является промышленным процессом ферментации. При выращивании шляпочных грибов мицелий является отходом, тогда как в процессе промышленного производства нитчатых грибов методом ферментации подбираются такие условия, при которых спорообразования не происходит. Выращивание шляпочных грибов в промышленных условиях связано с определенными трудностями и существенными затратами. Эти грибы используют непосредственно как пищевой продукт или как вкусовую приправу к различным блюдам. В последнем случае приемлемо использование мицелиальных форм грибов. Мицелиальные массы в промышленных условиях начали получать в 40 - 50-х годах ХХ столетия. В настоящее время во многих странах производят в промышленных условиях съедобные грибы. Для выращивания грибов используются практически любые отходы, особенно при поверхностном способе ферментации. На основе соломы, початков, кочерыжек, стеблей кукурузы, опилок с добавлением органических удобрений готовят твердые питательные среды, которые засевают мицелием гриба. После снятия урожая грибов остатки компоста, обогащенные мицелиальной массой, используют в кормопроизводстве. Приемлемым субстратом для биотехнологического процесса культивирования базидиальных съедобных грибов, удовлетворяющим требованиям безопасности и качества, предъявляемым к питательным средам для культивирования с целью получения пищевого продукта, является молочная сыворотка. Важным источником пищевого белка являются зеленые (Chlorella vulgaris) и сине- зеленые (Spirulina platensis, Synechococcus elongatus, Coccopedia) водоросли. Потенциально могут также использоваться водородные бактерии (Hydrogenomonas eutropha Z-1). Эти микроорганизмы характеризуются высоким содержанием белка по сумме аминокислот (45 - 60 % - водоросли, 65 - 70 % - водородные бактерии). По содержанию аминокислот белки водородных бактерий превосходят данные стандартной шкалы ФАО по всем аминокислотам, кроме цистеина и триптофана. Белки хлореллы содержат меньше изолейцина. Все водоросли дефицитны по серосодержащим аминокислотам и триптофану. Отношение суммы незаменимых аминокислот к общему азоту в продукте близко по величине для водорослей и водородных бактерий, но ниже, чем для стандартных продуктов (коровье молоко, гусиные яйца). Интересна также возможность получения из водорослей одновременно с белком кислых полисахаридов - важного компонента искусственных продуктов питания. Установлено, что при полном обеспечении кислородом за счет фотосинтезирующей деятельности водорослей суточный прирост их составляет 500 - 600 г, в том числе 250 - 300 г белка. Белок водорослей достаточно полноценен, а биомасса одноклеточных водорослей содержит большое количество витаминов и минеральных веществ. В РФ разработана аппаратура и технология для непрерывного культивирования спирулины и хлореллы с целью получения белково-углеводного комплекса кормового и пищевой категории качества. Одной из причин, сдерживающих развитие промышленного производства микроводорослей, является отсутствие эффективной технологии и аппаратуры, обеспечивающих получение продукции, по себестоимости сопоставимой с традиционными растительными продуктами. Большая часть крупных установок 17 рассчитана на использование открытых бассейнов, однако относительно низкие капитальные затраты на их возведение не обеспечивают низкой себестоимости продукции. В основу крупномасштабного микробного фотосинтеза НПО "Биотехника" было предложено использование аппаратов закрытого типа - фотореакторов. Исследование различных типов аппаратов показало перспективность для промышленного использования фотореакторов с трубчатой формой лучеприемника, обеспечивающей максимальную фотоэнергоемкость. Фотореактор включает также теплообменник, газообменное устройство для насыщения суспензии клеток диоксидом углерода и десорбции образующегося кислорода, побудитель расхода суспензии, а также специальное устройство, которое обеспечивает ежедневную очистку внутренних поверхностей без применения ручного труда и остановки аппарата. Производство микроводорослей объединяют с линией комплексной безотходной переработки биомассы. В результате такой переработки получают ряд продуктов (в том числе ценных биологически активных веществ), производство которых обеспечивает экономическую рентабельность производства, а также дешевых полноценных кормовых продуктов. Так, например, при переработке биомассы хлореллы могут быть последовательно получены следующие продукты (в % к массе исходного сырья): липидный концентрат 8 - 13, белковый гидролизат 22 - 35, деструктат клеток (шрот) до 60. Полученный белковый гидролизат содержит (в % СВ): свободные аминокислоты - 60, нуклеотиды - 6,85, остаточный белок - 4,12, углеводы (сумма) - 21,12. В составе гидролизата обнаружено значительное количество водорастворимых витаминов, главным образом группы В. Им могут быть заменены белковые основы, изготавливаемые в настоящее время из пищевого белкового сырья (мяса, рыбы, казеина). Аналогичным образом осуществляется комплексная переработка биомассы некоторых других микроводорослей. Перспективным сырьем для получения серии ценных продуктов, в том числе биологически активных веществ, является биомасса спирулины, в которой содержится 60 - 68 % протеина. В зависимости от условий культивирования в биомассе спирулины обнаруживаются (в мг/100 г): β-каротин 300 - 600, рибофлавин 4 - 6,6, кобаламин 0,1 - 0,18. Клетки спирулины лишены прочной оболочки, что существенно упрощает технологию переработки биомассы. Таким образом, получение пищевых белковых веществ из биомассы микроорганизмов является не только принципиально возможным, но и широко используется во многих станах. Однако белковые вещества микробиологического происхождения, за исключением высших базидиальных грибов, могут быть использованы в питании населения преимущественно в виде концентратов и изолятов. Пищевые белки производят в виде трех основных типов продуктов, которые различаются по содержанию белка (около 50, 70 - 75, 90 % и выше) и его фракционному составу. К первому типу продуктов с содержанием около 50 % белка относят дезинтеграт биомассы дрожжей. Ко второму типу продуктов - концентраты из биомассы микроорганизмов с содержанием белка 70 - 75 %. Изоляты, содержащие 90 % белка, - наиболее дорогой и безопасный тип белковых продуктов на основе микробной биомассы. |