Занятие 1 промышленные способы биотрансформации органических соединений
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
Регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений. Регенерация взрослых растений из трансформированных клеток зависит от тотипотентности клеток (способности части клеток или протопластов развиваться в целое 45 растение) и не всегда возможна. Тотипогентность хорошо выражена у клеток двудольных растений, таких как табак, картофель, свекла, соя, рапс, люцерна, томаты, морковь, капуста, некоторые плодовые. У однодольных, особенно злаков, этот признак выражен очень слабо, в связи с чем процесс регенерации клеток в целое растение проходит с большими трудностями. В настоящее время разработаны методы регенерации трансформированных клеток некоторых основных зерновых культур, таких как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. Однако необходимо отметить, что с каждым годом методы регенерации разрабатываются для все большего числа растений. 3. Современные направления получения трансгенных растений. Улучшение качества и повышение продуктивности растений методами генной инженерии. Одной из основных задач улучшения растений является повышение качества синтезируемых продуктов: белков, жиров, полисахаридов и других веществ, определяющих их питательную и техническую ценность. У злаков наибольший интерес представляют запасные белки эндосперма. Запасные белки, в основном, кодируются несколькими, сходными по своей структуре и по нуклеотидному составу, генами, объединяемыми в мультигенные семейства. Улучшение аминокислотного состава белка методами традиционной селекции довольно затруднительно в связи с тем, что гены, определяющие эти важные сельскохозяйственные признаки, часто бывают сцеплены и наследуются вместе с генами, вызывающими нежелательные признаки (например повышение содержание лизина приводило к уменьшением синтеза основных запасных белков зеина и гордеина и, в конечном итоге, с уменьшением продуктивности растений и урожайности посевов). В связи с этим наиболее перспективным является использование генно- инженерных методов при создании новых сортов, что позволяет ввести в геном только полезный признак, без сцепления с отрицательными свойствами. Так, например, введение дополнительных кодонов лизина в гены проламинов может привести к синтезу белков, обогащенных лизином, и улучшению кормовой и питательной ценности белка. Помимо получения трансгенных растений с модифицированными запасными белками зерновых и бобовых проводятся работы по улучшению состава жирных кислот ряда масличных культур, и в первую очередь рапса. Семена рапса характеризуются высоким содержанием масла, однако, из-за большого количества в нем специфической длинноцепочечной эруковой кислоты, а также глюкозинолатов вкусовые и питательные качества рапсового масла резко снижаются. С помощью генетической инженерии и последующей селекции были получены сорта рапса, содержащие гены, контролирующие длину молекулы жирных кислот, что привело к снижению доли эруковой кислоты и улучшению качества рапсового масла. Аналогичные работы ведутся по получению модифицированных жирных кислот с повышенным содержанием ненасыщенных связей, что позволит получать растения, синтезирующие новые ценные жирные кислоты. Кроме того, в последнее время было показано, что изменение состава жирных кислот может приводить к повышению устойчивости растений к ряду насекомых, а также к действию пониженных температур. Одним из приоритетных направлений в селекции является повышение урожайности новых сортов. Генно-инженерные разработки активно ведутся в следующих 46 направлениях: увеличение фотосинтетической активности и увеличение синтеза отдельных веществ. Другое направление проводимых работ касается возможностей изменения метаболизма у трансгенных растений. Введение гена сахарозофосфатсинтетазы кукурузы (SPS-гена), являющегося ключевым ферментом в регуляции углеводного метаболизма, в геном других растений приводило к изменению углеводного обмена и повышению продуктивности растений. В настоящее время получены такие трансгенные растения томата, картофеля, рапса, хлопчатника. Получение трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям. Экстремальное влияние окружающей среды, такое как засуха, избыточное увлажнение, воздействие высоких или низких температур, засоление и кислотность почв приводит к значительным потерям сельскохозяйственной продукции. Поэтому использование сортов растений, толерантных к стрессовым воздействиям, имеет большое экономическое значение. Многие из адаптивных реакций растений на стресс обусловливаются синхронным взаимодействием множества генов. Поэтому более доступными для генно-инженерных исследований оказываются биохимические процессы, непосредственно индуцировавшиеся фактором стресса. Так, например, известно, что в растениях, подвергающихся длительному водному стрессу, накапливается ряд органических низкомолекулярных соединений, таких, как пролин, глицинбетаин и ряд других, которые служат осморегуляторами или осмопротекторами. Было показано сходство стрессового ответа у бактерий и высших растений: в обоих случаях в клетках происходит синтез молекул осмопротекторов, механизмом действия которых является установление осмотического баланса между цитоплазмой и окружающей средой и, кроме того, частичная стабилизация белков при стрессовых условиях. Сходные биохимические пути синтеза молекул осмопротекторов позволили использовать гены бактериального происхождения для получения трансгенных растений, устойчивых к стрессам. Получение трансгенных растений, устойчивых к насекомым. Используя генно- инженерные методы, возможно конструирование растений с повышенной резистентностью к атаке насекомыми. Так, было показано, что бактерии Bacillus thurmgiensis экспрессируют инсектицидный белок-прототоксин, который, попадая в кишечник насекомых, расщепляется под действием протеаз до активного токсина, приводящего к гибели вредителей. Препараты на основе этого токсина использовались для обработки растений в поле. Полученные препараты были нестойкими и довольно быстро разлагались, что не позволяло развить у вредителей устойчивость к инсектициду, в то время как продукция таких белков в растительных клетках могла обеспечивать устойчивую резистентность растений к насекомым. Из генома В. thuringiensis был выделен ген токсина и интегрирован в геном растений табака методом агробактериальной трансформации. Эффективность защиты сельскохозяйственных культур от вредителей была показана также на трансгенных растениях томата, трансформированных генами эндотоксина, при этом бактериальный белок, синтезированный в тканях растений, обеспечивал защитный эффект, сравнимый с использованием инсектицидных препаратов. Помимо табака и томата бактериальный был 47 введен в геном многих сельскохозяйственных растений, в том числе в картофель, кукурузу, хлопчатник, рис, сою, брокколи и др. Использование трансгенных растений привело к резкому сокращению применения инсектицидов и повышению урожайности. Получение трансгенных растений, устойчивых к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. При действии фитопатогенов в растениях включается каскад механизмов защитных реакций. При этом активные ответные реакции в растениях могут проходить по двум основным направлениям: во-первых, в ответ на инфекцию начинается синтез соединений, являющихся токсичными и ограничивающих жизнедеятельность патогенов, что в конечном итоге приводит к их гибели. Во-вторых, в качестве защитного ответа могут создаваться структурные барьеры, которые предотвращают повреждение растений и распространение патогенов, что достигается лигнификацией клеточных стенок растений, либо укреплением клеточных стенок за счет гликопротеидов, богатых гидроксипролином и других соединений, так называемых экстенсинов, что приводит к защите тканей от повреждения фитопатогенами. В ответ на инфицирование вирусами, бактериями и грибами индуцируются специфические PR-белки (pathogenesis related proteins), в том числе и наиболее изученные хитиназы и β-1,3-глюканазы. Эти ферменты ингибируют рост грибов, а также некоторых видов бактерий. Экспериментально был доказан фунгицидный эффект белков хитиназ и глюканаз, а также их кодирование одиночными генами. Поэтому гены хитиназы и глюканазы были использованы в генно-инженерных работах по получению трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам. Другую группу соединений, также обладающих фунгицидным эффектом, представляют низкомолекулярные белки (40-50 кДа), к которым относятся цистеиновые белки растений, ингибиторы галактуроназ, растительные дефензины, группа MF-белков. Все эти белки обычно неспецифически повышают устойчивость растений к различным грибным и бактериальным инфекциям. Трансгенные растения, экспрессирующие этот белок, обладают устойчивостью как к грибной, так и к вирусной инфекции. В процессе изучения взаимоотношений вирус – растение было вовлечено большое число различных методов. Только их комбинирование могло принести результаты по получению растений, устойчивых к вирусной инфекции. За последние годы в этом направлении был сделан заметный рывок, что напрямую связано с более детальным пониманием организации генома и функционирования вирусных генов. В настоящее время для получения растений, устойчивых к вирусной инфекции, с помощью генно- инженерных технологий существует ряд подходов, позволяющих получить трансгенные растения, трансформированные геном белка оболочки вируса, что приводит к уменьшению инфицированности и ингибированию размножения вируса. Таким методом были получены растения табака и картофеля, трансформированные геном белка оболочки вируса табачной мозаики, что привело к появлению стойкого антивирусного эффекта у трансгенных растений. Еще одним подходом к получению устойчивых к патогенам растений является трансформация растительных клеток генами, кодирующими ферменты пути биосинтеза фитоалексинов, проявляющих фунгицидное и антимикробное действие. Трансформация этими генами растений томата и картофеля значительно повысила устойчивость к фитофторозу и фузариозу. 48 Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам. Одним из основных направлений биотехнологии растений является получение культурных растений, устойчивых к воздействию гербицидов. Гербициды широкого спектра действия, уничтожая сорные травы, оказывают угнетающее действие и на посевы. Получение устойчивых к гербицидам растений ведется в двух направлениях: во-первых, прямая селекция устойчивых к гербицидам форм растений (в основном, путем скрещивания с дикими видами растений, устойчивых к гербицидам), во-вторых, получение трансгенных растений путем введения генов, экспрессия которых приводит к гербицидрезистентности. Теоретической основой получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, являются данные о молекулярных механизмах возникновения устойчивости к гербицидам и выделения генов как бактериального, так и растительного происхождения, определяющих этот признак. Действие гербицидов проявляется в подавлении метаболизма растительных клеток: ингибировании биохимических процессов прежде всего фотосинтеза (атразин, симазин, диурон) и синтеза аминокислот (глифосат, сульфонилмочевина, биалафос). Устойчивость к гербициду возникает либо в результате изменения сродства гербицида с его ферментом-мишенью, либо непосредственно ингибированием молекулы гербицида. Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной инженерии прежде всего основывается на изучении молекулярных механизмов толерантности и включает следующие этапы: выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений/бактерий, устойчивых к данному гербициду (в качестве источника генов резистентности), идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. 4. Генная и клеточная инженерия в животноводстве. Методы генной инженерии в животноводстве позволяют решать следующие задачи: -идентифицировать в геноме животных гены, ответственные за передачу важных для животноводства свойств; - модифицировать и клонировать их на основе р-ДНК биотехнологии; - интегрировать в геном животного-реципиента. При этом интегрированный ген определяют как трансген, продуцируемые данным геном белки – трансгенными продуктами, а животное, несущее в своем геноме рекомбинантный ген – как трансгенное животное. Этапы получения трансгенных сельскохозяйственных животных: - приготовление раствора ДНК для микроинъекции; - подготовка донора и извлечение эмбрионов; - идентификация представляющего интерес гена и микроинъекция ДНК; - пересадка инъецированных эмбрионов животному-реципиенту; - доказательство интеграции трансгена у родившихся потомков; - получение трансгенных потомков традиционными методами сельскохозяйственного животноводства. Данная методика реализуется в сельскохозяйственном животноводстве по следующим направлениям. 49 1. Получение трансгенных животных с новыми хозяйственно-полезными свойствами: увеличение скорости роста, повышение надоев, улучшение качества животноводческой продукции и ее биологической ценности. 2. Получение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям: повышение устойчивости к бактериальным и вирусным инфекциям. 3. Получение трансгенных животных, характеризующихся сверхпродукцией биологически активных веществ технологического и медицинского назначения: молоко с повышенным содержанием жира и белков, препараты крови, ферментные препараты. Использование методов клеточной инженерии в животноводстве позволяет решать задачи по повышению продуктивности, устойчивости к заболеваниям, приданию им важных технологически важных свойств. Объектом клеточной инженерии являются эмбриональные клетки на ранней стадии развития, обладающие полной генетической информацией о данном организме и не подверженные дифференциации. Большие возможности благодаря микрохирургии получил метод трансплантации эмбрионов. Применение данного метода в животноводстве позволяет решать следующие задачи: - получение идентичных близнецов путем микрохирургического разделения эмбрионов; - получение трансгенных животных на основе клонирования эмбрионов с модифицированной генетической информацией; - получение химерных животных посредством межвидовых пересадок эмбрионов. |