Нуклеиновые кислоты- Биорганика. Методичка-Нуклеиновые кислоты. Нуклеиновыекислоты Целое этонечтобольшее, чемсуммачастей
 Скачать 397.55 Kb.
|
219 Г Г Л Л А А В В А А 8 8 НУКЛЕИНОВЫЕКИСЛОТЫ « Целое – этонечтобольшее, чемсуммачастей» АРИСТОТЕЛЬ ИСТОРИЯОТКРЫТИЯИИЗУЧЕНИЯНУКЛЕИНОВЫХКИСЛОТ В 1869 году швейцарский исследователь Ф. Мишер впервые выделил из ядер лейкоцитов человека неизвестное ранее вещество. Он назвал это вещество нуклеином (от лат. nucleus – ядро. Затем в лаборатории под руководством Ми- шера подобные вещества были выделены из эритроцитов птиц, рептилий, из дрожжей и ряда других природных объектов. Позднее Ф. Мишер установил, что открытый им нуклеин представляет собой смесь нуклеиновых кислот. Так были открыты нуклеиновыекислоты и новая группа сложных белков нук- леопротеины, содержащие в качестве простетической группы нуклеиновые кислоты. Таким образом, исследование химического строения нуклеиновых кислот началось с работ Мишера, а далее было продолжено КА. Косселем (1879 г, который обнаружил в нуклеиновых кислотах азотсодержащие гетероциклические основания. Первым выделенным гетероциклическим основанием, присутствующим в нуклеиновых кислотах, был гуанин(ранее выделенный из перуанского гуано – помета птиц, ценного азотистого удобрения. Впоследствии из нуклеиновых кислот были выделены тимин (из клеток тимуса быка, цитозин от греч. с – клетка) и аденин (от греч. aden – железа. В результате проведенных исследований русский химик Ф. Левен установил, что в состав нуклеиновых кислот входят азотсодержащие гетероциклические основания (производные пурина и пиримидина, фосфорная кислота и углеводный компонент – рибоза или дезоксирибоза. Таким образом, нуклеиновыекислоты – это полимерные биомолекулы, мономерами которых служат нуклеотиды, состоящие из азотсодержащих гетероциклических оснований, моносахарида (пентозы) и фосфорной кислоты. В х гг. XX века были получены первые экспериментальные доказательства важнейшей роли дезоксирибонуклеиновойкислоты – ДНК в явлениях наследственности и изменчивости у микроорганизмов. И только входе последующих исследований ДНК были открыты рибонуклеиновыекислоты – РНК, играющие первостепенную роль в биосинтезе белков. Собственно, установление химического строения ДНК и РНК послужило толчком для развития нового направления в биологии – молекулярнойбиологии, решающей задачу исследования на молекулярном уровне таких общебиологических явлений, как наследственность, изменчивость и эволюция. 220 Таким образом, в течение практически целого века (начиная с конца ΧΙΧ и заканчивая серединой ΧΧ века) было доказано, что нуклеиновые кислоты являются важнейшими компонентами всех клеток живых организмов. Выявлено, что с участием нуклеиновых кислот происходит биосинтез белков, являющихся материальной основой всех жизненных процессов ив конечном итоге, формируют фенотипические признаки все организмов. Информация, определяющая особенности первичной структуры белков, записана в молекулах ДНК, с помощью которых и передается от родительских клеток к дочерним. Молекулы РНК служат незаменимыми и обязательными участниками самого механизма биосинтеза белков и других биопроцессов. Исследование нуклеиновых кислот и нуклеопротеинов позволяет понимать механизмы возникновения инфекционных заболеваний, поскольку по химической природе функциональная часть любого вируса есть ничто иное, как нуклеопротеин. Поэтому борьба с многочисленными вирусными заболеваниями невозможна без глубокого познания строения и свойств нуклеиновых кислот. И, наконец, сами мономерные звенья нуклеиновых кислот – нуклеотиды – играют важную самостоятельную роль в метаболизме некоторые из них – коферменты, другие – аккумуляторы энергии в клетке, третьи – циклические нуклеотиды регуляторы обмена веществ. Особенности функционирования нуклеиновых кислот, нуклеотидов и родственных соединений рассматриваются на страницах настоящего пособия. НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ, НУКЛЕИНОВЫЕКИСЛОТЫ При полном жестком кислотном гидролизе (72% С, 100 С или 25% НСООН, 75 С) нуклеиновых кислот образуются пуриновые и пиримидиновые основания(гетероциклическиеазотистыеоснования), моносахарид пентоза рибоза или дезоксирибоза в фуранозной форме) и фосфорнаякислота. Рассмотрим особенности химического строения и физико-химических свойств данных соединений как главных компонентов нуклеиновых кислот и их предшественников нуклеозидов и нуклеотидов. Моносахариды. Все нуклеиновые кислоты в зависимости от входящего в их состав моносахарида можно подразделить на два основных типа. Если в состав нуклеиновой кислоты входит рибоза, то она называется рибонуклеиновой кислотой(РНК), а если дезоксирибоза, то дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК). Пентозы в нуклеиновых кислотах всегда присутствуют в β-D- фуранозной форме (см. главу 6 настоящего Раздела ОН H ОН H H O H O H CH 2 ОН H H ОН Рибоза 2-Дезоксирибоза 1 ' 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 2 ' 1 ' 3 ' 4 ' 5 ' 221 Атомы углерода в структурных формулах пентоз нумеруются цифрами со знаком штрих, чтобы отличить их от атомов углерода, входящих в состав азотистого основания (например, й атом углерода обозначают С или 5′). Замена атома водорода на гидроксильную группу при С рибозы является одной из основных причин существенных различий в свойствах ДНК и РНК. Очевидно, вследствие таких изменений в природе заместителя происходит упрочнение связи между мим атомами углерода в пентозе, что приводит к увеличению устойчивости молекулы ДНК как хранителя наследственной информации. Кроме того, отсутствие кислорода у С дезоксирибозы способствует более компактной упаковке молекулы ДНК в пространстве, что позволяет ей, несмотря на относительно большие размеры, занимать малый объем в клетке и ядре (особенности пространственной организации молекул ДНК и РНК рассматриваются далее. Азотистыеоснования. Химическое строение и физико-химические свойства азотистых оснований определяют особенности пространственной организации молекул нуклеиновых кислот в условиях живых клеток и, что особенно важно, их биологическое поведение, те. способность хранить и передавать наследственную информацию. Входящие в состав нуклеиновых кислот азотистые основания по химическому строению являются либо производными пурина – пуриновыеоснования, либо пиримидина – пиримидиновыеоснования. Напомним, что молекула пурина представляет собой два сконденсированных кольца пиримидина и имидазола. В зависимости от распространенности оснований в нуклеиновых кислотах выделяют главные и редкие или минорные пуриновые и пиримидиновые основания. К главным пуриновым основаниям относятся аденин(А) и гуанин(Г); а к главным пиримидиновым – цитозин (Ц, урацил (У) и тимин (Т. Главные азотистые основания имеют следующее химическое строение N N 1 2 3 4 5 6 Пиримидин N N NH N NH 2 Аденин ( А) HN N NH N O H 2 N Гуанин ( Г) Цитозин ( Ц) Урацил ( У) Тимин ( Т) NH N O NH 2 NH N O O NH N O CH 3 O N N NH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Пурин Аденин, гуанин, цитозин и тимин входят в состав молекул ДНК. В отличие от ДНК, в РНК вместо тимина присутствует урацил. Одинаковые и отличающиеся структурные компоненты молекул ДНК и РНК приведены в таблице 20 Таблица 20.ОдинаковыеиотличающиесякомпонентыДНКиРНК Одинаковые компоненты Отличающиесякомпоненты вДНК: вРНК: 2-Дезоксирибоза Рибоза А Г Ц Т У Как было отмечено выше, кроме главных азотистых оснований в нуклеиновых кислотах присутствуют редкие, или минорные основания, содержащиеся в небольших количествах. К настоящему времени обнаружено свыше 60 минорных оснований. Например, в ДНК высших организмов присутствует 5- метилцитозин, а в некоторых бактериальных ДНК, наряду с 5- метилцитозином, встречаются небольшие количества 6-метиладенина. В ДНК Т-четных фагов E. coli цитозин заменен на 5-гидроксиметилцитозин. Особенно много минорных оснований (4-тиоурацил, 5,6-дигидроурацил, 2,6-диоксипурин, 6- оксипурин, ацетилцитозин и др) содержится в транспортных РНК N N NH N HN CH 3 NH N O NH 2 СН 3 5- Метилцитозин 6- Метиладенин 5- Гидроксиметил- цитозин NH N O NH 2 СН 3 NH НN S O 4- Тиоурацил NH НN S O 4- Дигидроурацил HN N NH N O О 2,6- Диоксипурин HN N NH N O 6- Оксипурин Ацетилцитозин NH N O NHСОСН 3 Из азотистых оснований неприродного происхождения можно отметить 5- бромурацил (сильный мутаген) и 6-меркаптопурин (противоопухолевое средство NH НN O Br О 5- Бромурацил N N NH N SH 6- Меркаптопурин 223 В отличие от аминокислот, свободные азотистые основания не встречаются в живых организмах в больших количествах и не выполняют других самостоятельных биофункций кроме предшественников биосинтеза нуклеотидов см. главу 11 Раздела II). Предполагается, что минорные основания представляют собой одну из ветвей развития пуриновых и пиримидиновых оснований входе биохимической, а затем и биологической эволюции. Нов отличие от главных азотистых оснований, минорные основания в процессе эволюции не получили широкого распространения. По-видимому, это обстоятельство связано с особенностями физико-химических свойств данных молекул. Азотистые основания плохо растворимы вводе, однако в составе нуклеозидов и нуклеотидов (см. ниже) их растворимость заметно увеличивается. Пуриновые и пиримидиновые основания характеризуются высокой температурой плавления (С. Рентгеноструктурный анализ пуриновых и пиримидиновых оснований показал, что молекулы пиримидинов имеют плоское, а молекулы пуринов – псевдоплоское строение. Пурины и пиримидины представляют собой слабые основания с рК а 9,5 (для азота шестичленного ароматического кольца. Важной особенностью пуриновых и пиримидиновых оснований (за исключением аденина) является их способность к лактам-лактимной таутомерии. Так, урацил может находится в форме как лактима, таки лактама: HN C NH СН СН С О O Лактам (кето-форма) HN C СН СН С О НO N Лактим (енольнаяформа) Нужно отметить, что в большинстве случаев резонансная энергия амидной группы (или амидных групп) играет более значительную роль, чем резонансная стабилизация ароматического кольца, поэтому лактамная форма превалирует. В составе нуклеиновых кислот все оксопроизводные азотистые основания находятся в форме лактамов. Таутомерное равновесие зависит от температуры, рН среды, свойств растворителя и от степени связывания с белками и другими молекулами. Например, в нейтральной среде при рН = 7,0 преобладает лактамная форма урацила. Таутомерия азотистых оснований имеет важное значение в молекулярных механизмах функционирования нуклеиновых кислот, в частности, она является причиной некоторых мутаций. Пуриновые и пиримидиновые основания интенсивно поглощают свет в УФ-области спектра благодаря наличию электронного сопряжения. Максимум поглощения лежит около 260 нм (для сравнения у белков – около 280 нм. Положение максимума поглощения зависит от химического строения гетероцикла, те. от природы заместителей в гетероциклическом ядре. Важно отметить, что максимум поглощения незначительно зависит от структуры углеводного остатка, поэтому спектроскопические свойства азотистых оснований с успехом используются для количественного определения нуклеиновых кислот в растворах и биосредах, для ультрафиолетовой микроскопии живых тканей и для выявления мутагенных эффектов при УФ-облучении. Нуклеозидыинуклеотиды. В нуклеиновых кислотах пуриновые основания через й атома пиримидиновые – через й атом образуют Ν Ν Ν Ν - гликозиднуюсвязь с пентозой (рибозой в РНК и дезоксирибозой в ДНК. Такие соединения, в которых азотистые основания связаны с рибозой или дезоксирибозой посредством N-гликозидной связи называются нуклеозидами, а их эфиры с фосфорной кислотой – нуклеотидами(рис. 28). N N N N NH 2 Нуклеотиды Аденозин - нуклеозид H 9 \ 5 Аденозин-5 , - монофосфат (АМФ) Аденозин-5 , - дифосфат (АДФ) Аденозин-5 , - трифосфат (АТФ Рис. 28 Химическое строение нуклеозидов и нуклеотидов Например, если аденин присоединен к рибозе, то образовавшееся соединение представляет собой нуклеозид аденозин. Если аденозин этерифицировать фосфорной кислотой в м положении, то образуется 5 ′′′′ -адениловаякислота(аде- нозин-5 ′-монофосфат), если в м положении – то 3′-адениловая кислота (аде- ниозин-3 ′-монофосфат). Фосфорная кислота может также этерифицировать углевод поили- положениям. Кроме того, этерификация фосфорной кислотой приводит к образованию ди- и трифосфорных эфиров нуклеозидов, которые выполняют самостоятельную роль в обмене веществ и энергии в живых организмах. В результате образуются нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфаты. Если в состав нуклеозида входит дезоксирибоза, то перед названием соответствующего нуклеотида ставится приставка дезокси(сокращенно д, например, д- АТФ – это дезоксиаденозин-5 ′-трифосфат. Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов отражена в таблице 21. По сравнению с исходными азотистыми основаниями кислотно-основные свойства нуклеотидов довольно сильно выражены, что объясняется легкой диссоциацией гидроксильных групп остатка (остатков) фосфорной кислоты в случае нуклеозидмонофосфатов (нуклеозидди- и трифосфатов, соответственно. Таблица 21. Номенклатурануклеозидовинуклеотидов Азотистые основания Нуклеозиды Нуклеотиды Сокращенное обозначение нуклеотидов АДЕНИН ГУАНИН ЦИТОЗИН УРАЦИЛ ТИМИН Аденозин Гуанозин Цитидин Уридин Тимидин Аденозинмоно(ди-, три-)фосфат Гуанозинмоно(ди-, три-)фосфат Цитидинмоно(ди-, три-)фосфат Уридинмоно(ди-, три-)фосфат Тимидинмоно(ди-, три-)фосфат АМФ, АДФ, АТФ ГМФ, ГДФ, ГТФ ЦМФ, ЦДФ, ЦТФ УМФ, УДФ, УТФ ТМФ, ТДФ, ТТФ Нуклеиновыекислоты. Нуклеиновыекислоты представляют собой полинуклеотиды, построенные из мономеров – мононуклеотидов, число которых в молекуле колеблется от нескольких десятков до сотен миллионов. С помощью различных методов (химических, ферментативных, спектроскопических и др) было доказано, что нуклеиновые кислоты всех типов живых организмов представляют собой линейные полимеры, имеющие неразветвленное строение. Такое описание нуклеиновых кислот может привести к представлению, будто нуклеиновые кислоты – это длинные одноцепочечные молекулы, однако в действительности их молекулы представляют собой структуры со сложной пространственной организацией (см. ниже. О ОН Т О СН 2 О Р ОН О О ОН Г О СН 2 О Р ОН О О ОН Ц О СН 2 О О А О СН 2 О О Г О СН 2 О Р ОН О О У О СН 2 О Р ОН О 1 , 3 , 5 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 3 , 3 , 3 , 3 , 3 , 5 , 5 , 5 , 5 , 5 , ДНК РНК Рис. 29 Строение участка полинуклеотидной цепи ДНК и РНК Роль соединительного мостика между нуклеотидами в молекулах нуклеиновых кислот выполняет 3 ′,5′-фосфодиэфирная связь, соединяющая С- атом пентозы одного нуклеотида и С-5 ′-атомом пентозы другого нуклеотида 226 рис. 29). Для удобства описания задается определенное направление полинук- леотидной цепи. Поскольку на одном из ее концов остается свободной 5 ′-OH- группа (началоцепи), а на другом группа (конеццепи), то направление полинуклеотидной цепи записывают в виде 5 ′→3′. Нуклеиновые кислоты имеют сходство с белками в том, что из разных нуклеотидов (подобно аминокислотам) можно построить огромное количество нуклеиновых кислотно в природе реализуются далеко не всевозможные варианты. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯОРГАНИЗАЦИЯМОЛЕКУЛДНК Как известно, основная биологическая роль ДНК сводится к хранению и передаче наследственной информации. Поэтому основное требование, которое Природа предъявила к структуре молекул ДНК, заключается в стабильности ее структуры в физиологических условиях, обеспечивающей сохранность генетической информации. Несомненно, это возможно при определенной пространственной организации молекул ДНК, исследование особенностей которой позволяет наиболее четко представлять механизмы функционирования нуклеиновых кислот in vivo. ПервичнаяструктураДНК. Последовательность чередования нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК составляет ее первичнуюструктуру. Для обозначения последовательности первичной структуры полинуклеотидной цепи используют однобуквенные символы образующих ее нуклеотидов, которые идентичны символам соответствующих азотистых оснований. Определение первичной структуры ДНК – крайне сложная и трудная задача, так как размеры молекул огромны, но при этом она построена всего лишь из четырех типов нуклеотидов. Большие успехи в изучении структуры ДНК были достигнуты в результате работ Э. Чаргаффа с сотрудниками, которым впервые с помощью хроматографического метода (1950 г) удалось определить нуклеотидный состав ДНК, выделенной из различных природных объектов. Оказалось, что ДНК, выделенные из разных источников, существенно отличались по количественному нуклеотидному составу (табл. 22), ново всех случаях нуклеотидный состав молекул ДНК подчиняется универсальным закономерностям, которые получили название правилЧаргаффа (табл. 23). Таблица 22. НуклеотидныйсоставДНК, выделеннойизразличныхисточников (в %) Биологическиеобъекты Азотистое основание Печеньчеловека Морковь E. coli А Г Ц* Т А/Т Г/Ц Пурины/Пиримидины 30,0 19,5 19,9 30,3 1,00 0,98 0,99 26,7 23,1 23,2 26,9 0,99 1,00 0,99 23,8 26,0 26,4 23,8 1,00 0,98 0,99 * Включая 5-метилцитозин 227 Таблица 23.ПравилаЧаргаффа |