Принципы идентификации анаэробных бактерий На первом этапе

• Название: Принципы идентификации анаэробных бактерий На первом этапе
• Дата: 24.03.2022
• Размер: 4.51 Mb.
• Имя файла: MIKRA_6.docx
• Тип: Занятие; #413699

Занятие 6

Анаэробные бактерии. Выделение чистой культуры и идентификация анаэробных бактерий. Особенности культивирования и идентификация грибов.

1. 
   Принципы идентификации анаэробных бактерий
   

На первом этапе (И день исследования) изучают макроскопические особенности клинического материала, делают мазок и окрашивают его за методом Грама. После этого материал засевают на среду Китта-Тароцци и молоко. Предварительно среду регенерируют на кипящей водяной бане в течение 10-20 мин и охлаждают. Непосредственно после посева материала среду нагревают на водяной бане при 80°С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных неспоровых форм микробов. Среды ставят в термостат и при температуре 37 °С культивируют 1-3 сутки.

На втором этапе изучают проявления роста микроорганизмов (помутнение, образование осадка и газа на среде Китта-тароцци, пептонизация молока). Поскольку среда Китта-тароцци сверху залита слоем вазелинового масла для предотвращения доступа кислорода, у него окунают пастеровскую пипетку, набирают жидкость, из которой готовят мазок, крася его за методом Грамма. Под микроскопом в мазке можно видеть большие граммположительные палочкоподобные бактерии. После этого проводят занял материалу за методами Вейнберга или Цейсслера для получения изолированных колоний.

За методом Вейнберга готовят несколько узких высоких пробирок (3-4) с растопленным и охлажденным до 42-45 °С сахарным мясо-пептонным агаром. Возможно использование среды Вильсон-блера. Материал из среды Китта-тароцци вносят в первую пробирку с помощью пастеровской пипетки и тщательным образом перемешивают, потом переносят в друге, а дальше – в третью. Для застудневания агара их быстро охлаждают под струей холодной водопроводной воды. За счет этого живые микробные клетки фиксируются в определенных участок агара. После застывания агара пробирки культивируют при оптимальной температуре в течение 1‑2 суток для образования изолированных колоний.

Содержание каждой пробирки можно, кроме того, всосать в пастеровские пипетки или трубки Виньяль-Вейона, следя, чтобы не было пузырьков воздуха. Последние имеют длину возле 30 см и диаметр 0,5-0,6 см. Верхний конец их, который закрывается ватой, имеет перетяжку, а нижний вытянут в виде капилляра. После заполнения пипетки ее вытянутый конец запаивают и кладут в термостат для культивирования. Через 1-2 сутки в агаре вырастают колонии анаэробных бактерий. Для того, чтобы их изолировать, трубку надрезают напильником на определенном уровне, разламывают, колонию берут бактериальной петлей или иглой, переносят в соответствующую среду.

Для выделения изолированных колоний за методом Цейсслера материал из среды Китта-тароцци или молока наносят петлей или 1-2 капли пастеровской пипеткой на чашку Петри с сахарно-кровяным агаром и делают посев шпателем за методом Дригальского. Не стерилизуя шпатель, засевают вторую чашку, а затем и третью. Чашки переворачивают вверх дном, подписывают, ставят в анаеростат, в котором создают анаэробные условия, а затем – в термостат при температуре 37 °С на 2-3 сутки. На последней чашке вырастают изолированные колонии.

Третий этап исследования начинается с изучения морфологических особенностей колоний, которые выросли в чашках Петри или трубках Виньяль-вейона. Исследуются их форма, величина, цвет, характер краев, рельеф колонии, консистенция и тому подобное. Из колоний готовят мазки, красят их за методом Грама. После этого колонии отсевают в среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Посевы инкубируют определенное время при оптимальной температуре.

На четвертом этапе обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителей на соответствующих средах, проверяют ее на чистоту и проводят идентификацию. Идентифицируют выделенные чистые культуры анаэробных микроорганизмов подобно аеробних за морфологическими, культуральными, биохимическими и биологическими признаками. Обязательно используют определение токсигенних свойств возбудителей в биологичниий пробе и реакции нейтрализации на лабораторных животных. В некоторых случаях определяют антигенные свойства микроорганизмов.

Таким образом, на основании изучения разнообразных свойств микроорганизмов делается вывод о принадлежности их к тому или другому виду.

6. Методы создания анаэробных условий для культивировния облигатных анаэробов

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инер­тными газами в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал.





Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вейнберга.

Метод Фортнера – посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80 °С (для уничтожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем проводят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вейнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на сё месте делают распил, колонию быстро отбирают и засевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры)

+Физ методы –

Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1. Посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества; В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

2. Посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред. Посев микроорганизмов в глубину питательных сред производят по методам Вейнберга и Виньяль-Вейона.

3. Механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы. Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический или пластиковый цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабжённый отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

4. Заменой воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом. Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, С0₂) можно производить в анаэростатах вытеснения его газом из баллона.

Приборы и среды для культивирования анаэробов:

Микроанаэростат — используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабженный нанометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают термостат.

(Метод Аристовского) Эксикатор — стеклянный лабораторный сосуд с притертой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или, гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Газ-пак (Generbag anaer). Для создания анаэробных условий используются газогенераторные пакеты с реагентами — GasPak, GasPak Plus (газогенераторный пакет с палладиевым катализатором) и другие.

Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых емкостей, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. (рис. 9). При применении GasPak Plus необходимо увлажнить таблетку боргидрида натрия, при этом выделяется водород и в присутствии палладиевого катализатора он соединяется с кислородом с образованием СО₂. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета (анаэростата), затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и закрыть пакет (анаэростат). Инкубация при 37°С.

Анаэробный бокс — прозрачная плексиглассовая камера со шлюзом, отверстиями для рук с рукавами, заканчивающимися резиновыми перчатками. В нем создаются стерильные условия, его заполняют газовой смесью и поддерживают температуру 37°С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции СЬ помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6—7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 45 полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

7. Анаэростат, принцип его работы

АНАЭРОСТАТ — прибор для культивирования микроорганизмов в анаэробных условиях. Для создания анаэробных условий из прибора выкачивают воздух. Остаток воздуха удаляют, заполняя прибор инертным газом (азот, смесь азота с углекислым газом), а затем в приборе либо снова создают вакуум, либо повторно заполняют азотом. Процедура «промывания» анаэростата азотом повторяется два-три раза. Существует два вида анаэростата: макроанаэростат (рис. 1) и микроанаэростат (рис. 2).

Макроанаэростат представляет собой термостат с водяным обогревом, внутри него находится толстостенный металлический герметически закрывающийся котел цилиндрической формы. В крышку анаэростата Вставлено стекло, через которое наблюдают за ростом микроорганизмов. Внутри котла имеются съемные металлические полочки для штативов и чашек Петри, а также электрическая лампочка.

Между наружной стенкой анаэростата и внутренним котлом находится полость, куда заливают воду для обогрева. Уровень воды определяют с помощью поплавка, вмонтированного в металлическую трубку, выведенную через верхнюю стенку анаэростата. На задней стенке внизу имеется кран для слива воды. Нагревается анаэростат электричеством. На верхнюю стенку анаэростата из внутреннего цилиндра, в котором создается вакуум, выведен металлический отросток с двумя игольчатыми кранами и вакуумметром. Вакуум в анаэростате создается с помощью вакуумного насоса, соединенного с кранами шлангом из вакуумной резины. В то время как один кран открывают для отсасывания воздуха, другой закрывают. Затем закрывают первый кран, а через второй впускают азот. Вакуум в анаэростате может быть доведен до 3—10 мм рт. ст. В условиях анаэростата можно выращивать как факультативные, так и облигатные анаэробы (см.).

Для этого устанавливают в анаэростат нужную температуру (26—37°), на полочки ставят засеянные анаэробами пробирки, флаконы или чашки Петри с питательными средами, герметически закрывают крышку. Через кран из анаэростата откачивают воздух, кран закрывают. При выращивании строгих анаэробов полость анаэростата «промывают» азотом. Выращивание производят в течение 2—5 суток.

Микроанаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр. Сверху он герметически закрывается крышкой с резиновой вакуумной прокладкой. На крышке имеются вакуумметр и кран для откачивания воздуха вакуумным насосом. После выкачивания воздуха микроанаэростат можно заполнить азотом. Для выращивания анаэробов анаэростатом после загрузки и создания в нем вакуума помещают в термостат с заданной температурой.

РАБОТА – с использованием насоса удаляется воздух и накачивается бескислородная газовая смесь, содержащая 80% N2, 10% CO2, 10% H2. Палладиевые или платиновые катализаторы обеспечивают удаление остатков кислорода, катализируя связывание O2 c H2. Создание анаэробных условий возможно с помощью химических газогенерирующих пакетов.

8. Среда Китта-Тароцци, ее назначение

Среда Кита-Тароцци. Мясо или печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6) и 30 минут кипятят. Также может состоять из МПБ, глюкозы и кусочков печени, мяса для абсорбции кислорода. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водо­проводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3-4 кусочка мяса (печени) помещают в пробирку, наливают 7-8 мл бульона, покрывают слоем вазелинового масла (чтобы предохранить посев от проникновения кислорода) и стерилизуют при 120° С 20 минут. Перед исполь­зованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлаждением). Жидкая питательная среда для культивирования анаэробных микроорганизмов (клостридий). Выросшие анаэробы вызывают помутнение среды и образование пузырьков газа. Для выявления облигатных анаэробов в пищевых продуктах, восстановление анаэробов из лиофилизированного состояния или со среды хранения. Эффект – рост в виде диффузного помутнения. Глюкоза – редуцирующий фактор.

9. Среда Вильсон-Блера, ее применение

Среда Вильсона — Блера — это плотная селективная питательная среда для анаэробных бактерий, содержащая МПА, глюкозу, сернистокислый натрий и хлорное железо; анаэробные бактерии образуют колонии чер­ного цвета в результате восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который соединяясь с хлоридом железа, образуют сернистое железо (осадок).

Среду используют для выявления CI. perfringens. Состав ее следующий: 20%-ный раствор безводного сульфита натрия 10 мл, 20%-ный раствор глюкозы 5 мл, 8%-ный раствор кристаллического железосульфата (ферросульфата) 1 мл, 3%-ный питательный агар 100 мл.

Железо-сульфитный агар готовят следующим образом: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 60—80° 3% мясо-пептонного агара с 1% глюкозы (pH 8,0) добавляют 10 мл 20% свежеприготовленного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8% раствора хлорного железа. Раствор сернистокислого натрия предварительно стерилизуют текучим паром в течение 1 часа, а раствор хлорного железа готовят на стерильной дистиллированной воде. Приготовленную среду, не стерилизуя, разливают в пробирки и для контроля стерильности помещают на сутки в термостат при t° 37°. В процессе роста анаэробов сернистокислый натрий восстанавливается с образованием сернистого железа. Cl. perfringens, Cl. oedematiens, С1. sporogenes, Cl. fallax, Cl. chauvoei на этой среде образуют интенсивночерные колонии. Колонии Cl. tetani и Cl. histolyticum окрашиваются в зеленовато-черный цвет.

Висмут-сульфитный агар по прописи Иванова, Плоскирева, Битковой и Саватеева готовят следующим образом: к 100 мл расплавленного питательного агара (pH 7,5) добавляют при помешивании 2 г индикатора, взвешенного в 10 мл воды, кипятят 2 мин., остужают, взбалтывают и разливают в чашки. Готовая среда имеет коричнево-зеленоватый цвет. Индикатор готовят, смешивая в ступке 2 г лимоннокислого висмута, 8,5 г безводного сернистокислого натрия, 1 г соли Мора [Fe(NH₄)₂(SO₄)₂•6H₂O], 4 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, 5 г глюкозы и 0,055 г бриллиантового зеленого. Хранят индикатор в герметичной упаковке. На этой среде тифо-паратифозные бактерии восстанавливают сульфит до сульфида, образуя в присутствии соли железа черные колонии. Рост кишечной палочки и сопутствующей кишечной флоры на среде подавляется. В. — Б. с. не следует заготовлять впрок, т. к. под действием света и воздуха она приходит в негодность.



10. Методы выделения чистой культуры облигатных анаэробов.

Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы:

Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.

Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлаж­денным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.

Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель меж­ду краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла.

11. Какие свойства изучают у облигатных анаэробов для определения их видовой принадлежности?

Для определения вида анаэробов необходимо изучать такие их признаки:

Морфологические ,культуральные, патологические и серологические с учетом их возможностей к изменчивости.
Морфологические особенности – характеризуются выраженным многообразием. Формы микробов в мазках, приготовленных из органов, резко отличаются от форм микробов, полученных на искусственных питательных средах. Чаще им присуща форма палочек или нитей и реже кокков. 
Среди анаэробов большинство спорообразующих микроорганизмов. Споры располагаются по разному в этих микроорганизмов.

Споры образуются по одной в клетке. Споры, как правило, образуются после гибели животного. Эта особенность состоит с функциональным назаченим спор как сохранение вида в неблагоприятных условиях.
Некоторые анаэробы подвижные и жгутики расположены по перетрическому типу.

Капсула обладает защитной функцией и имеет запасные питательные вещества.
Культуральные – характер роста на жидких и плотных питательных средах
Патологические - способность микроорганизмов приживаться в тканях организма хозяина, размножаться в них, вызывая патологические изменения.



Биохимические. Дифференцируют анаэробы друг от друга по характеру роста на молоке с кусочками печени и мозговой среде, а также на среде ПЖА с углеводами и индикатором ВР

Серологические - свойства и признаки идентифицируемого микроорганизма, основанные на специфических реакциях взаимодействия антигенов (компоненты капсул, клеточных стенок, жгутиков, ДНК и токсинов) с антителами, содержащимися в сыворотках. При росте на средах анаэробы выделяют токсины, которые дифференцируют в РН (реакции нейтрализации токсина). Сыворотки на каждый тип токсина получают на биофабриках. При постановке РН токсина животные (мыши) опытной группы остаются живы и не заболевают.

Ориентировочная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится по следующим критериям: рост в присутствии желчи (диски 5 мг, BioMerioux), бриллиантового зеленого (диски 100 мкг, BioMerioux) и канамицина (диски 1000 мкг, BBL, Becton Dickinson), ферментация глюкозы, наличие черного пигмента. Используя эти тесты, бактерии делят на 4 группы:
1 группа - Bacteroides fragilis. Все бактерии этой группы сбраживают глюкозу и способны расти в присутствии желчи и канамицина, бриллилантовый зеленый подавляет их рост;
2 группа – бактерии рода Prevotella. Бактерии этой группы растут в присутствии канамицина, но не растут в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, обладают сахаролитической активностью – сбраживают глюкозу. Некоторые виды могут образовывать черный пигмент на кровяных средах после 5-7 дней инкубации;
3 группа – род Porphyromonas. Асахоролитические бактерии, не растущие в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, но растущие в присутствии канамицина, образуют черный пигмент. Бактерии этой группы чувствительны еще и к ванкомицину (диски 5 мкг, BBL, Becton Dickinson).
4 группа – бактерии рода Fusobacterium. Эти бактерии не растут в присутствии желчи и канамицина, но растут в присутствии бриллиантового зеленого.

12. Грибы как особое царство микроорганизмов. Систематика и классификация грибов.

Грибы представляют собой многочисленную груп­пу микроорганизмов, относящихся к доминиону Еикагуа, цар­ству Mycota. Классификация внутри царства основана на мор­фологии, характере и способах размножения, физиологических особенностях и других признаках. Клетка гриба имеет ультра­структуру, типичную для эукариот. Все грибы способны к бесполому размножению, совершенные грибы могут также раз­множаться половым путем. Представители одного вида в по­ловой (телеоморфной) и бесполой (анаморфной) фазах разви­тия могут существенно различаться по морфологии, экологии и в случае патогенных видов способности вызывать заболева­ния. Грибы подразделяются на две основные морфологические группы: плесени (нитевидные грибы) и дрожжи.

Классификация грибов

Грибы можно разделить на 7 классов: хитридиомицеты, гифохитридиомицеты, оомицеты, зигомицеты, аскомицеты, бази­диомицеты, дейтеромицеты.

Среди фикомицетов различают:

1) хитридиомицеты, или водные грибы, ведущие сапрофитический образ жизни или поражающие водоросли, (Chytridiomycota) — гаплоидный многоядерный синцитий (плазмодий), клеточная стенка отсутствует, вегетативное размножение не обнаружено, одножгутиковые зооспоры, полового спороношения нет, гаметы подвижны, изо- или гетерогамия, все представители-паразиты;

2) зигомицеты включают представителей рода Мисоr, распро­страненных в почве и воздухе и способных (например гри­бы рода Мисоr) вызывать мукоромикоз легких, головного мозга и других органов. При бесполом размножении на плодоносящей гифе-спорангиеносце образуется споран­гий — шаровидное утолщение с оболочкой, содержащее многочисленные споры (спорангиоспоры). Половое раз­множение (оогамия) у зигомицетов осуществляется пу­тем образования зигоспор, или ооспор. Зигомицеты (.Zygomycota) — гаплоидный синцитий (иногда с неболь­шим количеством перегородок), у наиболее примитивных в виде голого комочка протоплазмы — амёбоида или в виде одной клетки с ризоидами; помимо хитина в клеточной стенке много пектина, способность к почкованию, беспо­лое размножение спорангиоспорами, зигогамия.

3) оомицеты — паразиты высших растений и водяные плесени;

4)гифохитридиомицеты, имеющие сходство с хитридиомицетами и оомицетами;

Эумицеты представлены аскомицетами и базидиомицетами (совершенные грибы), а также дейтеромицетами (не­совершенные грибы)

Аскомицеты (или сумчатые грибы) объединяют группу грибов, имеющих септированный мицелий и отличающих­ся способностью к половому размножению. Свое назва­ние аскомицеты получили от основного органа плодоно­шения — сумки, или аска, содержащего 4 или 8 гаплоид­ных половых спор (аскоспор). К аскомицетам относятся представители родов Aspergillus, Penicillium и др., отлича­ющиеся особенностями формирования плодоносящих гиф. У Aspergillus (леечная плесень) на концах плодонося­щих гиф-конидиеносцев имеются утолщения — стеригмы, на которых образуются цепочки спор — конидии. Неко­торые виды аспергилл могут вызывать аспергиллезы и афлатоксикозы.

Плодоносящая гифа у грибов рода Penicillium (кистевик) напоминает кисточку, так как из нее (на конидиеносце) образуются утолщения, разветвляющиеся на бо­лее мелкие структуры — стеригмы, на которых находятся цепочки конидий.

Пенициллы могут вызывать заболева­ния (пенициллинозы). Многие виды аскомицетов явля­ются продуцентами антибиотиков. Представителями ас­комицетов являются и дрожжи — одноклеточные грибы, утратившие способность к образованию истинного мице­лия. Дрожжи имеют овальную форму клеток, диаметр которых 3—15 мкм. Они размножаются почкованием, бинарным делением (делятся на две равные клетки) или половым путем с образованием аскоспор.

Дрожжи исполь­зуют в биотехнологических процессах. Заболевания, вы­зываемые некоторыми видами дрожжей, получили назва­ние дрожжевых микозов.

Базидиомицеты — шляпочные грибы с септированным ми­целием. Базидиомицеты (Basidiomycota) — многоклеточ­ный, как правило, дикариотический мицелий, могут об­разовывать хламидоспоры; соматогамия или автогамия с образованием базидий с базидиоспорами.

Дейтеромицеты — несовершенные грибы (Fungi imperfectt) — являются условным классом грибов, объединяющим гри­бы с септированным мицелием, не имеющие полового раз­множения. Они размножаются только бесполым путем, образуя конидии.

К несовершенным грибам относятся грибы рода Candida, по­ражающие кожу, слизистые оболочки и внутренние органы (кандидоз). Они имеют овальную форму, диаметр 2—5 мкм; делятся почкованием (бластоспоры), образуют псевдомицелий (почку­ющиеся клетки из ростковой трубочки вытягиваются в нить), на концах которого находятся хламидоспоры. Эти грибы называют дрожжеподобными. Истинные дрожжи (аскомицеты) образуют аскоспоры, не имеют псевдомицелия и хламидоспор. Подавля­ющее большинство грибов, вызывающих заболевания у человека (микозы), относятся к несовершенным грибам.

Грибы используются в молочной промышленности, в произ­водстве витаминов, аминокислот, антибиотиков, спиртов, орга­нических кислот, в процессах хлебопечения, приготовления вина и пива, получения белковых кормов и очищения окружающей среды от различных загрязнений, в разложении отходов нефти, при получении ферментов. При получении кормового белка ис­пользуют Candida utilis. Человек широко использует грибы для получения препаратов, подавляющих развитие вредителей и воз­будителей болезней растений, при получении органических кис­лот, в генной инженерии и биотехнологии, при изучении физи­ологических, генетических, цитологических, биохимических и других процессов (одной из используемых моделей является Blastocladiella emersonii).

Актиномицеты — это лучистые грибы, относящиеся к прока­риотам. Свое название они получили благодаря лучистому стро­ению их колонии и образованию лучисто расположенных зерен (друз) в гное, хорошо видимых под микроскопом. По своей фи­зиологии актиномицеты занимают промежуточное положение между несовершенными грибами и бактериями.

К бактериям они более близки — у актиномицетов имеются те же структур­ные элементы, что и у бактерий. Подавляющее большинство ак­тиномицетов — сапрофиты, широко распространенные и оби­тающие в почве, воде и в воздухе, принимающие активное учас­тие в круговороте веществ.

Актиномицеты являются активными продуцентами метаболитов, в том числе и антибиотиков, исполь­зуемых с лечебной целью. Среди актиномицетов есть виды, вхо­дящие в состав нормальной микрофлоры человека и животных. Они входят в состав микрофлоры кишечника, постоянно при­сутствуют в зубном налете, в кариозных зубах. Но наряду с этим имеются и патогенные виды, способные вызвать заболевания у растений, птиц, рыб, животных и человека.

У человека и живот­ных патогенные виды актиномицетов вызывают заболевание актиномикоз, протекающее в хронической форме и по клинике очень сходное с микозом. При актиномикозе как у людей, так и у животных могут поражаться все ткани и органы. У людей болезнь встречается спорадически, а у животных могут возникать и эпизо­отии. Болезнь встречается у людей и животных всех возрастов.





13. Структура и химический состав клеток грибов.





14. Морфология и строение грибов.

Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это мно­гоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофилльные) эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой. Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, цитоплазматическую мембрану и многослойную ригидную клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов, а также белка, липидов и др. Некоторые грибы образуют капсулу.

Цитоплазматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы. Грибы являются грамположительными микробами, вегетативные клетки — некис­лотоустойчивые.

Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф), сплетающихся в грибницу, или мицелий. Гифы низших грибов — фикомицетов — не имеют перегородок. У высших грибов — эумицетов — гифы разделены перегородками; их мицелий многокле­точный. Различают гифальные и дрожжевые формы грибов.

Гифальные (плесневые) грибы образуют ветвящиеся тонкие нити (гифы), сплетающиеся в грибницу, или мицелий (плесень). Гифы, врастающие в питательный субстрат, называются вегета­тивными гифами (отвечают за питание гриба), а растущие над поверхностью субстрата — воздушными, или репродуктивными гифами (отвечают за бесполое размножение). Гифы низших грибов представлены многоядерными клетками и называются ценоцитными.

Дрожжевые грибы (дрожжи), в основном, имеют вид отдель­ных овальных клеток (одноклеточные грибы). По типу полового 'размножения они распределены среди высших грибов аскомицет и базидиомицет. При бесполом размножении дрожжи образуют почки, или делятся, что приводит к одноклеточному росту. Могут образовывать псевдогифы и ложный мицелий (псев­домицелий) в виде цепочек удлиненных клеток — «сарделек».

Грибы, аналогичные дрожжам, но не имеющие полового спосо­ба размножения, называют дрожжеподобными. Они размножа­ются только бесполым способом — почкованием, или делением.

Грибы размножаются спорами половым и бесполым спосо­бами, а также вегетативным путем (почкование или фрагмента­ция гиф). Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к совершенным.

Несовершенными называют грибы, у которых отсутствует или еще не описан половой путь размножения. Бесполое размноже­ние осуществляется у грибов с помощью эндогенных спор, со­зревающих внутри круглой структуры — спорангия, и экзоген­ных спор — конидий, формирующихся на кончиках плодонося­щих гиф. Некоторые виды несовершенных грибов являются воз­будителями дерматомикозов: фавуса (.Achorion schoenleinii), трихофитии (Trichophyton violaceum), микроспории (Microsporum lanosum, M. canis), эпидермофитии (Epidermophyton inguinale).

Типы грибов: выделяют 3 типа грибов, имеющих половой спо­соб размножения (так называемые совершенные грибы):

• 
  зигомицеты (Zygomycota),
  
• 
  аскомицеты (Ascomycota) и базидиомицеты {Basidiomycota). Отдельно выделяют условный, формальный тип грибов —
  
• 
  дейтеромицеты (Deiteromycota), у которых имеется только бесполый способ размножения (так называемые несовершенные грибы).
  

15. Размножение грибов. Принцип их культивирования





По-другому:

Существует 3 способа размножения грибов:

1. Вегетативное размножение

Осуществляется кусочком мицелия или отдельными клетками - оидиями, образующимися в результате расчленения гиф и хламидоспорами - толстостенными клетками, устойчивыми к неблагоприятным воздействиям. Оидии и хламидоспоры образуют высшие грибы.

2. Бесполое размножение с образованием спор

В этом случае на определенном этапе вегетативного размножения грибов образуются специальные плодоносящие гифы воздушного мицелия.

У низших грибов споры формируются внутри шаровидных мешочков - спорангиев, внутри которых формируются внутренние споры (эндоспоры). Плодоносящий гиф на котором образуются спорангии называется спорангиеносцем.

У высших грибов на кончике плодоносящего гифа образуются специальные вытянутые клетки - стеригмы, на которых формируются цепочки из спор - конидии. Споры, расположенные на конидиях, находятся снаружи плодоносящего гифа (экзоспоры). Плодоносящий гиф на котором образуются конидии называется конидиеносцем.

3. Половое размножение

Половому размножению (митозу) предшествует слияние двух многоядерных гифов мицелия. Состоит половое размножение из трех этапов:

• 
  плазмогамия - соединение протопластов двух гифов. Возникающая в результате этого клетка имеет два ядра и называется дикарион;
  
• 
  кариогамия - слияние двух гаплоидных ядер с образованием диплоидного ядра (ядра с двойным набором хромосом).
  
• 
  мейоз - редукционное деление. Процесс деления ядер состоит из нескольких стадий.
  

Различают гомо- и гетероталличные грибы. У гомоталличных грибов происходит слияние двух одинаковых гифов, у гетероталличных -оплодотворение может происходить только между мицелиями разных половых знаков ( + и - ).

Существуют грибы, которые не способны размножаться половым путем. Такие грибы называют несовершенными.

16. Культуральные и ферментативные свойства грибов





17. Факторы патогенности грибов



Факторы патогенности грибов:

1.Адгезины – гликопротеины.

2.Пенетрация и инвазия в подлежащие ткани связана с наличие гидролитических и кератолитических ферментов.

3. Экзо- и эндотоксины.

4. Первичные метаболиты – урказа, фосфолипаза – факторы агрессии.

5.Вторичные метаболиты – экзогликан , меланин – факторы агрессии.

Заболевания вызываемые грибами называются микозы.

Основные этапы патогенеза микотической инфекции:

• 
  Период внедрения гриба – чаще всего протекает бессимптомно.
  
• 
  Инкубационный период – длительность этого периода от нескольких дней до нескольких месяцев зависимости от возбудителя и грибкового поражения.
  
• 
  Период разгара заболевания
  

20. Грибы рода кандида, их свойства.

Морфология, физиология. Аспорогенные дрожжи рода Candida — диморфные грибы, потерявшие фазу телеоморфы и закрепившиеся в гаплоидном состоянии. Они близки к дрожжам — сахаромицетам. В патологическом материале и в культурах образуют овальные почкующиеся дрожжевые клетки и псевдомицелий. С. albicans хорошо растет на обычных питательных средах при 20°С и 37°С. На основании культуральных, микроскопических и биохимических характеристик дифференцируют более 100 видов рода Candida, из которых лишь немногие (менее 10) вызывают кандидозы (C.tropicalis и др.). Антигены. Гликопротеины клеточных стенок дрожжеподобных грибов рода Candida определяют их видовую антигенную специфичность. Штаммы С. albicans подразделяют на 3 серовара — А, В и С. Спорообразующие сахаромицеты и аспорогенные дрожжи рода Candida имеют общие антигены.

Патогенность. Факторами патогенности дрожжеподобных грибов рода Candida являются гемолизины, эндоплазмокоагулаза, липиды, полисахариды, некоторые гидролазы, эндотоксин.

Патогенез и иммунитет.

Дрожжеподобные грибы рода Candida вызывают различные острые и хронические инфекции, имеющие локальный или диссеминированный характер. Заболевания могут развиваться в виде первичных или вторичных инфекций в результате экзогенного или эндогенного инфицирования. Широко распространен кандидоз полости рта, типичный для новорожденных, а также для лиц, страдающих тяжелыми заболеваниями разной этиологии (злокачественные опухоли и др.).

Кроме того, нередко встречаются кандидозный вульвовагинит, развивающийся в период беременности, при диабете; бронхолегочный кандидоз как вторичная инфекция на фоне рака легких, бронхоэктатической болезни, СПИДа и других заболеваний; интертригинозный кандидоз, при котором поражения локализуются в крупных складках кожи (межъягодичных, под молочными железами) или на руках при их частом увлажнении и мацерации; хронический кандидоз кожи и слизистых оболочек. В связи с развитием микробиологической промышленности и, прежде всего, производства белка, основанного на использовании дрожжеподобных грибов рода Candida, заметно возросло число аллергических заболеваний в соответствующих регионах нашей страны. Аллергеном в этом случае является гликопротеин, условно названный паприном, проникающий в организм через дыхательные пути. К более редким поражениям человека относится кандидозный эндокардит. Чаще всего кандидозы возникают и развиваются у лиц, длительно принимающих антибиотики широкого спектра действия и гормональные препараты, с выраженными нарушениями микробных биоценозов полости рта, кишечника, а также иммунной системы организма. При кандидозах накапливаются антитела классов IgG, IgM, IgA.

Экология и эпидемиология. Различные виды Candida широко распространены в природе, а С. albicans является представителем нормальной микрофлоры организма человека. Они достаточно устойчивы к воздействию факторов окружающей среды

21. Лабораторная диагностика кандидозов.

Кандидозы. Возбудителями кандидозов являются различные виды рода Candida. Наиболее часто заболевание вызывает С. albicans

Лабораторная диагностика. Проводят микроскопические, культуральные, биохимические и серологические исследования. Микроскопируют патологический материал в целях обнаружения почкующихся дрожжевых клеток или элементов псевдомицелия.

Культуры из патологического материала получают на агаре Сабуро или суслоагаре при 20 и 37°С. Грибы рода Candida на 2-3-й день после посева образуют мелкие выпуклые колонии, которые сливаются в мощные образования, врастающие в питательную среду. Идентификацию грибов рода Candida проводят на основании данных микроскопии патологического материала, культуральных признаков, биохимической активности, типов роста филаментации. Образование нитей (филаментация) происходит за счет псевдомицелия, который отличается от истинного тем, что не имеет общей оболочки и перегородок, а состоит из длинных и тонких клеток. Псевдомицелий возникает путем последовательного бокового или концевого почкования . Серодиагностику проводят с помощью реакций агглютинации, РСК, преципитации, ИФА, иммуноэлектрофореза и др. Для кожноаллергических проб применяют различные аллергены.