Занятие 1 промышленные способы биотрансформации органических соединений
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
1 2 Практическое занятие 1 ПРОМЫШЛЕННЫЕ СПОСОБЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ 1. Определение и классификация процессов микробиологической трансформации (биотрансформации) органических соединений. 2. Общие принципы проведения биотрансформаций органических соединений. 3. Применение процессов биотрансформации в пищевой биотехнологии. 1. Определение и классификация процессов микробиологической трансформации (биотрансформации) органических соединений. Биосинтезпредусматривает получение целевых продуктов на основе реализации тех или иных метаболических путей биообъекта. В процессах биотрансформации имеет место видоизменение молекулы – предшественника целевого продукта или превращение одного продукта в другой. Большинство процессов микробиологической трансформации приводит к незначительной химической модификации субстрата под действием одного или нескольких экзоферментов клетки. Однако разработаны биотехнологические процессы, существенно изменяющие структуру трансформируемого соединения под действием сложных ферментных комплексов. К биотрансформациям также относят синтез метаболитов из предшественников, если при этом структура целевого продукта определяется химическим строением присутствующих в среде молекул предшественников (например, синтез нуклеотидов). В настоящее время процессы микробиологической трансформации органических соединений являются реальной альтернативой традиционным методам химического синтеза пищевых добавок, БАД к пище и других практически важных продуктов. Преимуществами биотрансформации органических соединений по сравнению с химическим синтезом являются: - специфичность микробных ферментных систем к трансформируемому субстрату и, как следствие, высокая химическая чистота получаемых продуктов; - способность микроорганизмов осуществлять в одну стадию многоступенчатые химические превращения; - возможность тонких перестроек сложных органических молекул; - простота аппаратурного оформления и экономичность процессов биотрансформации; - перспектива получения целевых продуктов, синтез которых химическими методами затруднен или не осуществим в настоящее время. Процессы микробиологических трансформаций принято классифицировать по типу присоединения функциональных групп к продукту или их отщепления от предшественника: окисление, восстановление, декарбоксилирование, аминирование и дезаминирование, образование гликозидов, гидролиз, метилирование и деметилирование, этерификация, конденсация, галогенирование др. 2. Общие принципы проведения биотрансформаций органических соединений. Общая схема проведения процессов биотрансформации включает следующие этапы: 3 - подготовка питательной среды, внесение специфических факторов, активизирующих биотрансформационную способность продуцента, стерилизация питательной среды; - установление оптимальных для получения целевого продукта значений температуры и рН среды, интенсивности аэрации; - введение в среду трансформируемого соединения в виде стерильных растворов, эмульсий или суспензий; - подготовка посевного материала при условиях, обеспечивающих максимальный выход биомассы, и инокуляция питательной среды; - культивирование продуцента при температуре, рН и интенсивности аэрации, обеспечивающих максимальный выход продукта реакции биотрансформации; - отделение биомассы продуцента от культуральной жидкости, выделение и очистка целевого продукта, получение товарной формы препарата. В настоящее время в лабораторных и промышленных условиях реализованы процессы получения лекарственных препаратов, витаминов, других биологически активных веществ, основанные на микробиологических трансформациях различных органических соединений. В ряду этих процессов особое место занимают методы биотрансформации стероидов, углеводов и гетероциклических соединений, приводящие к получению продуктов, не имеющих биосинтетических аналогов. Для пищевой биотехнологии наибольший интерес представляют процессы микробиологической трансформации углеводов (реакции окисления, восстановления, изомеризации и эпимеризации), которые будут рассмотрены более подробно. 3. Применение процессов биотрансформации в пищевой биотехнологии. Микробиологические трансформации углеводов по типу осуществляемой ферментативной реакции можно разделить на три группы: 1. Окислительные трансформации. 2. Восстановление углеводов. 3. Изомеризация и эпимеризация. Наиболее широко распространены и изучены окислительные трансформации; практическое применение нашел процесс окисления полиолов. В промышленных масштабах реализованы два процесса окисления полиолов: 1. Превращение глицерина в диоксиацетон. Разработан метод с многократным использованием клеток Acetobacter suboxydans, в т.ч. иммобилизованных, в среде содержащей глицерин, КН 2 РО 4 и 10% дрожжевого экстракта. Процесс осуществляют при 28 о Св течение 36 ч. 2. Трансформация D-сорбита в L-сорбозу. В промышленности используется метод глубинного культивирования Acetobacter suboxydans. Посевной материал выращивают на среде, содержащей сорбит, глюкозу, дрожжевой экстракт и СаСО 3 Полученную культуру бактерий вносят в 15-20% растворы D-сорбита, содержащие необходимые ростовые факторы. Процесс проводят при 30 о С с интенсивной аэрацией в течение 24 ч. Выход L-сорбозы составляет 93% от исходной концентрации D-сорбита. 3. Препараты витамина С получают в промышленных условиях комбинированным способом, включающим каталитическое гидрирование глюкозы с образованием D-сорбита, микробиологическую трансформацию D-сорбита в L-сорбозу 4 культурами Acetobacter suboxydans и Ac.xylinum и далее L-сорбоза может быть трансформирована в кетогулоновую кислоту (КГК) через стадию образования L- сорбозона. Первую реакцию осуществляют клетки Gluconobacter melanogenum; вторую – Pseudomonas putida. Полученная КГК трансформируется в L-аскорбиновую кислоту химическим путем. Разработан способ, предусматривающий окисление глюкозы до D-глюконовой кислоты и дегидрирование последней с образованием 5-кето-D-глюконата Са; процессы катализируются клетками Acetobacter suboxydans, 5-кето-D-глюконата Са каталитически гидрируется с образованием эквимолярной смеси L-глюконата и D-глюконата Са. L- глюконат трансформируется в КГК культурой Xanthomonas translucens. Получение витамина С методом Крафта предусматривает гидролиз лактозы препаратами β-галактозидазы; анаэробную ферментацию сыворотки культурами дрожжей не ассимилирующих галактозу; выделение этанола перегонкой; содержащуюся в барде галактозу трансформируют культурой дрожжей Candida norvegensis с образованием витамина С в количестве более 1 г/л. Практический интерес представляют восстановительные биотрансформации углеводов, заключающиеся в превращении альдегидной или кетонной группы в спиртовую. Данный метод получил широкое распространение для промышленного производства ксилита. В качестве трансформирующей культуры используют дрожжи C. utilis. Биомассу дрожжей выращивают на среде с ксилозой и добавками фосфатов. Процесс биотрансформации осуществляют в растворах ксилозы с добавками минеральных солей, при температуре 29-33 о С, рН 7,0. Выход ксилита составляет до 60%. Использование иммобилизованных продуцентов позволяет повысить выход до 90-92%. Технология получения концентратов и препаратов триптофана. Концентраты и препараты триптофана получают 2 способами: одностадийным (биосинтез) и двухстадийным (биотрансформация антраниловой кислоты). Первый способ основан на культивировании штаммов-сверхпродуцентов Bac.subtilis при 37 0 С; рН 7,0-7,2; интенсивности аэрации 5-6 м 3 /м 3 *ч на среде следующего состава: сахароза – 10%; кукурузный экстракт – 2%; мочевина – 0,5%; с добавлением K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NaCl. Продолжительность предферментации – 20ч; главной ферментации – 48 ч. При производстве кормового концентрата культуральную жидкость без отделения клеток сгущают до 40% СВ и высушивают. Процесс получения технического препарата триптофана предусмат-ривает отделение клеток и нерастворимых примесей; подкисление фильтрата НС1; адсорбцию триптофана на катионитах; десорбцию 5% водно-изопропа-нольным раствором аммиака; концентрирование вакуум-выпариванием; кристаллизацию триптофана; промывку кристаллов этанолом, сушку кристаллов. Второй способ получения триптофана предусматривает культивирование дрожжей Candida utilis на среде, содержащей мелассу (6-6,5%); мочевину (0,5%); добавки KH 2 PO 4 , СаС1 2 ; MgSO 4 . На первой стадии при температуре 28-30 0 С; рН 7,5-8,0; интенсивности аэрации 8-10 м 3 /м 3 *ч в течение 24 ч происходит рост культуры; далее вносят раствор антраниловой кислоты и мочевины. На второй стадии осуществляют подпитку 25%-ного раствора мелассы. Продолжительность стадии биотрансформации – 120 ч. Последующие операции получения концентрата или препарата триптофана аналогичны описанным выше. 5 Препараты глутаминовой кислоты и глутамата натрия Их получают методами биосинтеза и биотрансформации. Биосинтетический способ основан на культивировании Corynebacterium glutamicum при 28-30 0 С, рН 7,0-7,2; интенсивности аэрации 6-8 м 3 /м 3 *ч в течение 48-52 ч на среде, содержащей мелассу (20%), мочевину (2%), мел (1%), с добавками KH 2 PO 4 , MgSO 4 , пеногасителя. Концентрация глутаминовой кислоты по завершении ферментации – 40-45 г/л. Клетки продуцента отделяют с предварительной флокуляцией (внесением Са(ОН) 2 и Н 3 РО 4 ); фильтрат осветляют от пигментов на активированных углях или анионитах; концентрируют, подкисляют до рН 3,2 (ИЭТ глутаминовой кислоты) и охлаждают до 14- 15 0 С; кристаллы отделяют, промывают дистиллированной водой и высушивают. Для получения глутамата натрия влажные кристаллы растворяют и обрабатывают NaOH до рН 6,8; раствор фильтруют, отделяя примеси; фильтрат концентрируют до 60% СВ, кристаллизуют глутамат натрия, кристаллы высушивают. Биотрансформацию проводят 2 методами: - переаминирование, которое заключается в культивировании продуцентов α- кетоглутаровой кислоты, например Candida utilis на н-алканах (первая стадия); проведение биотрансформации α-кетоглутаровой кислоты культурами E.coli, в качестве доноров аминогруппы выступают аспарагиновая кислота или аланин; - восстановительное аминирование полученной аналогичным способом α- кетоглутаровой кислоты культурами Pseudomonas ovalis. Ферментативное разделение оптических изомеров аминокислот. Перспективным методом получения L-аминокислот является разделение рацематов аминокислот путем ассиметричного гидролиза их производных с использованием микроорганизмов, обладающих специфической L-ацилазной, L- амидазной, L- эстеразной активностью. Ферментативное разделение рацематов аминокислот с L-ацилазами основано на избирательном гидролизе ацилированных производных L-аминокислот. При отщеплении ацильной группы L-аминокислоты становятся более растворимыми и легко отделяются от малорастворимых ацилированных D-аминокислот. Некоторые протеолитические ферменты, например, химотрипсин, проявляют высокую L-эстеразную активность. Амидазы гидролизуют амиды аминокислот с образованием L-аминокислот. Не прореагировавшие производные D-аминокислот могут быть подвергнуты рацемизации и вновь использованы для ферментативного разделения. При культивировании микроорганизмов с ацилазной, амидазной и эстеразной активностью для повышения выхода целевого продукта необходимо вводить в среду культивирования индукторы синтеза соответствующих ферментов. Индукторами в ряде случаев являются вещества, близкие по природе к субстрату действия ферментов. Например, для ацилазы лизина – ε-ацетил-L-лизин. У многих микроорганизмов, прежде всего грибных и дрожжевых культур, ацилазы являются внутриклеточными ферментами. Поэтому для их использования клетки необходимо предварительно подвергать дезинтеграции. 6 Практическое занятие 2. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ БИООБЪЕКТЫ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ 1. Материалы, применяемые для иммобилизации ферментов и клеток. Методы иммобилизации биообъектов. 2. Типы иммобилизованных биокаталитических систем. 3. Аппаратурное оформление процессов с применением иммобилизованных ферментов и клеток. 4. Применение процессов биотрансформации и иммобилизованных биообъектов в пищевой биотехнологии. 1. Материалы, применяемые для иммобилизации ферментов и клеток. Методы иммобилизации биообъектов. Иммобилизация - ограничение подвижности молекул ферментов, позволяющее закрепить их активный центр, сохраняя максимальную работоспособность в течение длительного времени, не подвергаясь структурным изменениям. Материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму). Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечисленным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носителей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях. В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы. Органические полимерные носители. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических - полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные. К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам. 7 Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген, желатин. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К синтетическим носителям относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функциональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов. Носители неорганической природы. В качестве носителей наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - простота регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости. Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами. Используемые в настоящее время физические способы иммобилизации делят на 3 группы: - адсорбция на нерастворимых носителях; - включения в полимерную структуру; - инкапсулирование (включение в полупроницаемую мембрану). Иммобилизация путем адсорбции. Биообъект фиксируют на поверхности неорганических (силикагели, алюмогели, керамика, бентонит, гидрокеиды титана, циркония, железа) и органических (целлюллоза, хитин и хитозаи, ионообменные смолы, полимерные волокна) носителей. В зависимости от используемого инертного материала и типа иммобилизуемого биообъекта взаимодействие между ними может осуществляться за счет сил физической адсорбции, ковалентных и координационных химических связей, полярных, ионных и гидрофобных взаимодействий. Для иммобилизации без химической сшивки характерно слабое влияние носителя на свойства и каталитическую активность иммобилизуемого фермента, в то же время, слабая связь фермента с матрицей приводит к десорбции, вымыванию из биореактора. 8 Более прочными являются ионные взаимодействия биокатализатора и носителя, при которых адсорбция поддерживается при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Важно, чтобы в ионном взаимодействии не участвовал активный центр фермента. Изменение рН или ионной силы раствора может привести к десорбции фермента; изменению ионообменных характеристик носителя. Иммобилизация путем включения в полимерную структуру. Данные метод основан на участии молекул фермента в реакции сополимеризации (поликонденсации) с молекулами полимеризующегося мономера. Т.о. получают гранулы, пленки, волокна, несущие биокатализатор. Метод перспективен применительно к иммобилизации клеток. Для иммобилизации широко используют агар-агар, альгинаты, каррагинан полиакриламид, желатин. Биокатализатор вносят в раствор, содержащий ионы Са2+, А13+ Fe3+ и др. образуются сферические полимерные частицы, несущие иммобилизованные объект. Для получения однородных гранул раствор пропускают через специальные иглы, распыляющие устройства, вибрационные устройства для разрыва струи жидкости. Данные методы получили название «внешнее гелеобразование». Наряду с ними используют методы «внутреннего гелеобразования»: в раствор полимера вносят солевой раствор (например, цитрат кальция для альгината), вызывающий гелеобразование. Перспективными материалами для иммобилизации ферментов и клеток являются агар-агар. Иммобилизация путем инкапсулирования. При использовании этого метода биообъект покрывают специальными полупроницаемыми оболочками из целлюлозы, полиакриламида, полистирола, полисульфонатов, поликарбонатов, полиэфиров. Размеры пор полупроницаемой мембраны подбирают т.о., чтобы в капсуле удерживался целевой продукт например, белок, а низкомолекулярные примеси вымывались с раствором. Липидные мембраны (липосомы), используемые в качестве капсул, могут выполнять функцию «температурного реле»: при определенной температуре гриишцериды плавятся, что приводит к резкому увеличению проницаемости мембраны и каталитической активности фермента. Инкапсулирование также проводят в биореакторах с полыми волокнами, изготовленными из целлюлозы и других полимерных материалов, Раствор, содержащий биокатализатор, подают во внутренний объем полого волокна. К методу инкапсулирования близок метод обращенных мицелл, применяемый для реализации биокаталитических процессов в неводной фазе. Водный раствор фермента солюбилизируют в органическом растворителе с помощью ПАВ, при этом молекулы фермента включаются в водные мицеллы, стабилизированные ПАВ. Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов. В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения 9 галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность —СН 2 —NH—(СН2) 5 —СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями. Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента участвовали функциональные группы, не существенные для его каталитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента. Ковалентное связывание с носителем предусматривает взаимодействие молекул фермента с функциональными группами линейных полимеров. Иммобилизация путем поперечных сшивок осуществляется при помощи бифункциональных реагентов. Молекулы фермента, свободно перемещающиеся в растворе, соединяются между собой с помощью определенных радикалов сшивающего реагента. В результате образуется полимерная структура, включающая активные молекулы фермента и доступная для диффузии молекул субстрата и продуктов ферментации. Сополимеризация фермента и полимера-носителя. Предусматривает образование ковалентных связей между функциональными группами молекулы фермента и боковыми радикалами полимеризующегося трехмерно сшитого полимера. В данном случае образуется наиболее прочная связь между биообъектом и иммобилизующим агентом из всех рассмотренных методов. В то же время, наиболее высока вероятность снижения активности фермента в процессе иммобилизации. Особое значение метод поперечных сшивок имеет при проведении соиммобилизации двух и более биообъектов, например, микробных клеток и молекул ферментов. В ряде случаев применяют комбинации описанных методов. Например, поперечную сшивку применяют для дополнительной фиксации ферментов, иммобилизованных на поверхности носителя или в структуре полимера; либо в «строящийся» полимер вносят раствор фермента, обработанный сшивающим реагентом. Также используют инкапсулирование объекта, закрепленного на носителе. Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента. Ниже представлен ряд примеров, иллюстрирующих некоторые способы химической иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо-группами. Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциановый метод, который был предложен Р.Аксеном, Дж. Поратом и С. Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов. Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, 10 гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азосоединения, в составе которых белок связан с носителями: Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Реакционная способность производных карбоновых кислот в реакциях ацилирования аминогрупп фермента уменьшается от галогенангидридов до эфиров. Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха: Иммобилизация путем химического присоединения биокатализатора к носителю отличается высокой эффективностью и прочностью связи. Несмотря на это, методы ковалентной иммобилизации ферментов все еще малодоступны для промышленного использования в связи со сложностью и дороговизной их применения. Однако они остаются незаменимыми инструментами в практике проведения научных и лабораторных исследований по созданию энзимов с контролируемыми свойствами. Для прочной химической сшивки фермента с носителем широко используются белки различной природы. Перспективным направлением является иммобилизация на инертных полимерах, которым «привиты» активные функциональные группы (алифатические, ароматические, эфирные, альдегидные, аминосодержащие радикалы). При иммобилизации не должна изменяться нативная конформация белка, активные центр должен быть максимально удален от места сшивки. |