физа. 1. Белки высокомолекулярныеорганические вещества, состоящие из соединённых в цепочку
 Скачать 1.3 Mb.
|
11.АмфотерностьТак как белки содержат кислые и основные аминокислоты, то в их составе всегда имеются свободные кислые (СОО–) и основные (NH3+) группы. Заряд белка зависит от соотношения количества кислых и основных аминокислот. Поэтому, аналогично аминокислотам, белки заряжаются положительно при уменьшении рН, и отрицательно при его увеличении. Если рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка, то заряд белка равен 0. Если в белке преобладают кислые аминокислоты (глутамат и аспартат), то при нейтральных рН заряд белка отрицательный и изоэлектрическая точка находится в кислой среде. Для большинства природных белков изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 4,8-5,4, что свидетельствует о преобладании в их составе глутаминовой и аспарагиновой аминокислот. Если в белке преобладают основные аминокислоты (лизин и аргинин) – при нейтральных рН заряд положительный и обусловлен этими, положительно заряженными, аминокислотами. Амфотерность имеет значение для выполнения белками некоторых функций. Например, буферные свойства белков, т.е. способность поддерживать неизменным рН крови, основаны на способности присоединять ионы Н+ при закислении среды или отдавать их при защелачивании. С практической стороны наличие амфотерности позволяет разделять белки по заряду (электрофорез) или использовать изменение величины рН раствора для осаждения какого-либо известного белка. Наличие как положительных, так и отрицательных зарядов в белке обуславливает их способность к высаливанию, что удобно для выделения белков в нативнойконформации. Влияние рН на заряд белка При смещении рН в растворе изменяется концентрация ионов Н+. При закислении среды (при снижении рН) ниже изоэлектрической точки ионы Н+ присоединяются к отрицательно заряженным группам глутаминовой и аспарагиновой кислот и нейтрализуют их. Заряд белка при этом становится положительным. При увеличении рН в растворе выше изоэлектрической точки концентрация ионов Н+ снижается и положительно заряженные группы белка (NH3+-группы лизина и аргинина) теряют протоны, их заряд исчезает. Суммарный заряд белка становится отрицательным. Растворимость. Так как большинство белков несет много заряженных групп, то в целом они водорастворимы. Растворимость объясняется: наличием заряда и взаимоотталкиванием заряженных молекул белка, наличием гидратной оболочки – чем больше полярных и/или заряженных аминокислот в белке, тем больше гидратная оболочка. Например, 100 г белка альбумина связывает 30-50 г воды 12. Денатурация белков Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной конформации. Так как разрыв связей под действием различных факторов носит случайный характер, то молекулы одного индивидуального белка приобретают в растворе форму случайно сформировавшихся беспорядочных клубковПотеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков. В денатурированном белке гидрофобные радикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой концентрации белка и отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование осадка. Компактная, плотная пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах и становится легко доступной для расщепления пептидных связей протеолитическими ферментами. Факторы, вызывающие денатурацию белков высокая температура (более 50 °С), увеличивающая тепловое движение атомов в молекуле и приводящая к разрыву слабых связей; интенсивное встряхивание раствора органические вещества (например, этиловый спирт, фенол и его производные) способны взаимодействовать с функциональными группами белков, что приводит к их конформационным изменениям. кислоты и щелочи, изменяя рН среды, вызывают перераспределение связей в молекуле белка; соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют прочные связи с важными функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изменяя их конформацию и активность; детергенты - вещества, содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функциональную группу (такие вещества называют амфифильными). Пример денатурации - свертывание яичных белков при варке яиц. Денатурация бывает обратимой и необратимой. Необратимая денатурация может быть вызвана образованием нерастворимых веществ при действии на белки солей тяжелых металлов — свинца или ртути. РЕНАТУРА́ЦИЯ — процесс восстановления структурной организации биополимера (белковой молекулы или молекул нуклеиновых кислот). Ренатурация возможна только при обратимой денатурации. Ренатурация лежит в основе многих биологических механизмов. Нужно отметить, что не все белки способны ренатурировать; у большинства белков денатурация необратима. Ренатурация возможна только если затронута третичная или вторичная структура. При этом восстанавливаются функции данного белка. Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности,гидрофобны взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры. 13.Свойства белковых растворов определяются большими размерами молекул, т.е. белки являютсяколлоидными частицамии образуютколлоидные растворы. К свойствам белковых растворов относятся: 1. Рассеивание света вследствие дифракции на коллоидных частицах – опалесценция. Особенно это заметно при прохождении луча света через белковый раствор, когда виден светящийся конус (эффект Тиндаля). 2. Белковые растворы в отличие от истинных обладают малой скоростьюдиффузии. 3. Неспособностьбелковых частиц проникать через мембраны, поры которых меньше диаметра белков (полунепроницаемые мембраны). Это используется в диализе. Очистка белковых препаратов от посторонних примесей лежит в основе работы "искусственной почки" при лечении острой почечной недостаточности. 4. Создание онкотическогодавления, то есть перемещение воды в сторону более высокой концентрации белка, что проявляется, например, как формирование отеков при повышении проницаемости сосудистой стенки. 5. Высокая вязкость в результате сил сцепления между крупными молекулами, что проявляется, например, при образовании гелей и студней. Главными факторами устойчивости белка в растворе служат заряд молекулы и гидратная оболочка. Общий поверхностный заряд белковой молекулы при растворении в воде определяется суммой зарядов отдельных аминокислотных остатков, из которых построен белок. Если в составе протеина преобладают "щелоч¬ные" аминокислоты (аргинин, лизин), то молекула в целом заряжается по-ложительно; при преобладании дикарбоновых аминокислот - отрицатель¬но. Одноименно заряженные белковые молекулы в растворе отталкивают¬ся друг от друга, что препятствует их осаждению. Важной особенностью белка является способность менять величину и даже знак заряда при изменении рН среды, что связано с обратимостью диссоциации ионогенных групп в аминокислотных остатках (см. выше). Так, при добавлении кислоты к раствору белка часть СОО^-групп, связы¬вая избыток протонов, рекомбинирует до СООН-групп; при этом их отри¬цательные заряды исчезают, а все положительные заряды сохраняются. Это ведет к сдвигу общего заряда белка в положительную сторону. Для каждого белка можно подобрать такое значение рН среды, при котором количество положительных зарядов в молекуле сравняется с ко¬личеством отрицательных, а их алгебраическая сумма будет равна нулю. Это значение рН (не обязательно нейтральное!) называется изоэлектриче-ской точкой белка (ИЭТ). При сдвиге рН в кислую или щелочную сторону  Рис. 2.4. Изменение заряда белковой молекулы при сдвигах рН среды С локальными поверхностными зарядами белка связано наличие гидратной оболочки: молекулы-диполи воды "облепляют" белок в один или несколько слоев в зависимости от величины заряда. Одно из основных качеств гидратной оболочки - упругость; при столкновении гидратирован-ных молекул белка в растворе они не слипаются, а отскакивают друг от друга, что препятствует их выпадению в осадок. Для осаждения белков нужно нейтрализовать заряд молекулы, доведя рН среды до ИЭТ, и "снять" гидратную оболочку действием концентрированных растворов солей (вы¬саливание) или спирта. Реакции осаждения белков Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора. |