физа. 1. Белки высокомолекулярныеорганические вещества, состоящие из соединённых в цепочку
 Скачать 1.3 Mb.
|
|
Оксидоредуктаза . катализируют окислительно-восстанов реакц(перенос электронов) Название- «донор: акцептор-оксидоредуктаза» Подклассы: дегидрогеназа. Реакции отщепления H. Испол коферменты: над, надф,фад, фмн. Оксидаза. Акцептром служит молекул кислород. Оксигеназа. Атом кислорода присоединяется к субстрату. Трансфераза. Перенос функц гр от одного соедин к другому. Подразделяют в зависимости от переносимой гр. Название- «донор:акцептор-транспортируемая гр.-трансфераза» Гидролаза. Реакция гидролиза.(расщепление ковал связей с присоединением воды к месту разрыва.) Название- «субстрат-гидролаза» Лиазы. Ферменты, отщепляющие определ гр.(SH2, NH2, H2O,CO2) или присоедин воды по двойной связи. :название – «субстрат-отщепл гр или присоед гр» изомеразы. Внутримолекулярные превращения.подразделяют в зависимости от типа р-ции изомеризации. Лигазы. Катализируют р-ции присоединение друг к другу 2 молекул с образованием ковал связей. Этот процесс чвязан с разрывом связ в атф.- это лигазы, а если вместо атф выступает другое вещ, то это синтеазы. 38 Специфичность действия ферментов и ее вида Биологическая функция фермента, как и любого белка, обусловлена наличием в его структуре активного центра. Лиганд, взаимодействующий с активным центром фермента, называют субстратом. В активном центре фермента есть аминокислотные остатки, функциональные группы которых обеспечивают связывание субстрата, и аминокислотные остатки, функциональные группы которых осуществляют химическое превращение субстрата. Условно эти группы обозначают как участок связывания субстрата и каталитический участок, однако следует помнить, что не всегда эти участки имеют чёткое пространственное разделение и иногда могут "перекрываться" (рис. 2-1). В участке связывания субстрат при помощи нековалентных связей взаимодействует (связывается) с ферментом, формируя фермент-субстратный комплекс. В каталитическом участке субстрат претерпевает химическое превращение в продукт, который затем высвобождается из активного центра фермента. Схематично процесс катализа можно представить следующим уравнением: Е + S ↔ ES ↔ ЕР ↔ Е + Р, где Е - фермент (энзим), S - субстрат, Р - продукт. Данные обозначения общеприняты и происходят от английских слов enzyme, substrat, product. Специфичность - наиболее важное свойство ферментов, определяющее биологическую значимость этих молекул. Различают субстратную и каталитическую специфичности фермента, определяемые строением активного центра (рис. 2-2). 1. Субстратная специфичность Под субстратной специфичностью понимают способность каждого фермента взаимодействовать лишь с одним или несколькими определёнными субстратами. Различают: абсолютную субстратную специфичность; групповую субстратную специфичность; стереоспецифичность. Абсолютная субстратная специфичность Активный центр ферментов, обладающих абсолютной субстратной специфичностью, комплементарен только одному субстрату. Следует отметить, что таких ферментов в живых организмах мало. Пример фермента с абсолютной субстратной специфичностью - аргиназа, катализирующая реакцию расщепления аргинина до мочевины и орнитина: Другой пример фермента с абсолютной субстратной специфичностью - уреаза, катализирующая гидролиз мочевины до диоксида углерода и аммиака. Групповая субстратная специфичность Большинство ферментов катализирует однотипные реакции с небольшим количеством (группой) структурно похожих субстратов. Так, фермент панкреатическая липаза катализирует гидролиз жиров в двенадцатиперстной кишке человека, катализируя превращение любой молекулы жира (триацилглицерола) до молекулы моноацилглицерола и двух молекул высших жирных кислот. Панкреатическая липаза гидролизует эфирную связь у α-атомов углерода глицерола, независимо от того, какие жирные кислоты входят в состав молекулы жира (см. схему на с. 4). Большинство протеолитических ферментов, осуществляющих гидролиз белков, имеет групповую субстратную специфичность, гидролизуя пептидные связи, образованные разными аминокислотами. Стереоспецифичность При наличии у субстрата нескольких стерео-изомеров фермент проявляет абсолютную специфичность. к одному из них. В организме человека наблюдают специфичность ферментов к следующим стереоизомерам. 2. Каталитическая специфичность Фермент катализирует превращение присоединённого субстрата по одному из возможных путей его превращения, Это свойство обеспечивается строением каталитического участка активного центра фермента и называется каталитической специфичностью, или специфичностью пути превращения субстрата. Так, молекула глюкозо-6-фосфата в клетках печени человека - субстрат 4 различных ферментов; фос-фоглюкомутазы, глюкозо-6-фосфатфосфатазы, фосфоглюкоизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Однако из-за особенностей строения каталитических участков этих ферментов происходит различное превращение этого соединения с образованием 4 различных продуктов (см. схему ниже). \ 39. механизм действия ферментов 1. Формирование фермент-субстратного комплекса Тот факт, что ферменты обладают высокой специфичностью, позволил в 1890 г. выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как "ключ замку". После взаимодействия субстрата ("ключ") с активным центром ("замок") происходят химические превращения субстрата в продукт. Активный центр при этом рассматривался как стабильная, жёстко детерминированная структура. В 1959 г. был предложен другой вариант гипотезы "ключ-замок", объясняющий события в активном центре фермента. По этой гипотезе активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса, благоприятного для химических модификаций субстрата. При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции. Эта "гипотеза индуцированного соответствия" впоследствии получила экспериментальное подтверждение. 2. Последовательность событий в ходе ферментативного катализа Процесс ферментативного катализа условно можно разделить на следующие этапы (рис. 2-12). Первый, второй и четвёртый этапы катализа непродолжительны и зависят от концентрации субстрата (для первого этапа) и констант связывания лигандов в активном центре фермента (для первого и третьего этапов). Изменения энергетики химической реакции на этих стадиях незначительны. Третий этап наиболее медленный; длительность его зависит от энергии активации химической реакции. На этой стадии происходят разрыв связей в молекуле субстрата, образование новых связей и формирование молекулы продукта. 3. Роль активного центра в ферментативном катализе В результате исследований было показано, что молекула фермента, как правило, во много раз больше молекулы субстрата, подвергающегося химическому превращению этим ферментом. В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть молекулы фермента, обычно от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции. Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это комплексная молекулярная "машина", использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт. В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра называют эффектом сближения и ориентации реагентов. Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, снижение энергии активации (Еа), что определяет каталитическую эффективность ферментов. Активный центр фермента также способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации субстрата (рис. 2-12).  Рис. 2-12. Этапы ферментативного катализа. I - этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента; II - образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия; III - деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР); IV- распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента. 40. Пищеварительные ферменты находятся в пищеварительной системе человека и животных. Кроме этого, к таким ферментам можно отнести внутриклеточные ферменты лизосом. Основные места действия пищеварительных ферментов в организме человека и животных — это ротовая полость, желудок, тонкая кишка. Эти ферменты вырабатываются такими железами, как слюнные железы, железы желудка, поджелудочная железа и железы тонкой кишки. Часть ферментативных функций выполняется облигатной кишечной микрофлорой Ротовая полость. Слюнные железы секретируют в полость рта альфа-амилазу (птиалин), которая расщепляет высокомолекулярный крахмал до более коротких фрагментов и до отдельных растворимых сахаров (декстрины, мальтоза, мальтриоза). Желудок Ферменты, секретирующиеся желудком называются желудочными ферментами. Пепсин — основной желудочный фермент. Расщепляет белки до пептидов. Желатиназа расщепляет желатин и коллаген, основные протеогликаны мяса. Амилаза желудка расщепляет крахмал, но имеет второстепенное значение по отношению к амилазам слюнных желез и поджелудочной железы. Липаза желудка расщепляет трибутирины масла, играет второстепенную роль. Тонкий кишечник Ферменты поджелудочной железы Поджелудочная железа является основной железой в системе пищеварения. Она секретирует ферменты в просвет двенадцатиперстной кишки. Протеазы: Трипсин является протеазой, аналогичной пепсину желудка. Химотрипсин — также протеаза, расщепляющая белки пищи. Карбоксипептидаза Несколько различных эластаз, расщепляющих эластин и некоторые другие белки. Нуклеазы, расщепляющие нуклеиновые кислоты ДНК и РНК. Стеапсин, расщепляющий жиры. Амилазу, расщепляющую крахмал и гликоген, а также другие углеводы. Липаза поджелудочной железы является важнейшим ферментом в переваривании жиров. Она действует на жиры (триглицериды), предварительно эмульгированные желчью, секретируемой в просвет кишечника печенью. Ферменты тонкой кишки Несколько пептидаз, в том числе: энтеропептидаза — превращает трипсиноген в трипсин; аланинаминопептидаза — расщепляет пептиды, образовавшиеся из белков после действия протеаз желудка и поджелудочной железы. Ферменты, расщепляющие дисахариды до моносахаридов: сахараза расщепляет сахарозу до глюкозы и фруктозы; мальтаза расщепляет мальтозу до глюкозы; изомальтаза расщепляет мальтозу и изомальтозу до глюкозы; лактаза расщепляет лактозу до глюкозы и галактозы. Липаза кишечника расщепляет жирные кислоты. Эрепсин, фермент, расщепляющий белки. 41 изменение активности ферментов при заболеваниях. При нормальных физиологических изменениях организма, например при онтогенезе или адаптации к переменным условиям среды, может изменяться не только каталитическая активность ферментов (в результате действия регуляторных механизмов), но и их количество. Активность ферментов, их количество, а также компартментализация изменяются и при болезнях. Эти проявления болезней называют энзимопатиями; они являются частным случаем протеинопатии.Энзимопатии, как и вообще протеинопатии, бывают наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные). Например, врожденное отсутствие фермента гистидазы проявляется как наследственная болезнь гистидинемия. Вследствие нарушения метаболизма гистидина его концентрация в крови и моче больных значительно больше, чем у здоровых людей. Это, в свою очередь, ведет к нарушению обмена и других веществ и, как следствие, к нарушению физического и умственного развития, обычно настолько резкому, что больные не доживают до взрослого состояния. Таким образом, недостаточность даже одного фермента может оказаться несовместимой с жизнью. Приобретенные энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, сопровождают любую болезнь. Например, при воспалении, характерном для очень многих болезней, из поврежденных клеток в очаге воспаления освобождаются протеолитические и другие ферменты, которые могут разрушать окружающие ткани. В этом случае имеет место нарушение компар-тментализации ферментов. Причины и проявления ряда других энзимопатии подробнее рассматриваются в последующих разделах. В плазме крови здоровых людей имеется небольшой по сравнению с клетками набор ферментов, и их концентрация значительно ниже, чем в клетках. При повреждении и нарушении компартментализации ферменты из клеток могут попадать в кровь. Изменения ферментного состава крови при разных заболеваниях различны, поэтому определение ферментов в сыворотке крови используется как метод диагностики болезней и метод контроля эффективности лечения . Причины, приводящие к увеличению количества ферментов в крови Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы. Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плазму крови определёнными органами. Например, печень синтезирует неактивные предшественники ферментов свёртывающей системы крови. Ко второй относят большую группу ферментов, высвобождающихся из клеток во время их. нормального функционирования. Обычно эти ферменты выполняют свою функцию внутри клетки и не имеют физиологического значения в плазме крови. У здорового человека активность этих ферментов в плазме низкая и достаточно постоянная, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток и скоростей разрушения. При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь. К причинам, вызывающим высвобождение внутриклеточного содержимого в кровь, относят нарушение проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе). Определение в крови активности ряда ферментов хорошо налажено в биохимических лабораториях, что используют для диагностики заболеваний сердца, печени, скелетной мускулатуры и других тканей. Уровень активности ферментов в плазме коррелирует со степенью повреждения клеток. Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов. Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе. Однако повышение концентрации ферментов не всегда связано с повреждением тканей. При избыточной клеточной пролиферации, например при онкопролиферативных процессах, при повышенной скорости синтеза некоторых ферментов в клетках или при нарушенном клиренсе (способности вьпюдиться почками) наблюдают повышение концентрации в крови определённых ферментов. Врачам следует учитывать, что нормальные значения активности ферментов в крови детей и беременных женщин отличаются от показателей, характерных для взрослых здоровых людей. 42. Определение ферментов плазме крови диагностических целях. Происхождение ферментов плазмы крови. Энзимодиагностика – развивается по двум путям. Один путь – использование ферментов в качестве избирательных реагентов для открытия и количественного определения нормальных или аномальных химических веществ в сыворотке крови, моче, желудочном соке и др. (например, выявление при помощи ферментов глюкозы, белка или других веществ в моче, в норме не обнаруживаемых). Другой путь – открытие и количественное определение самих ферментов в биологических жидкостях при патологии. Оказалось, что ряд ферментов появляется в сыворотке крови при распаде клеток (отсюда их название «некротические ферменты»). Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью. Известно около 20 тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изоферментов), главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии). Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500), открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.). Так, уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной железы, болезнях печени и др. Резко повышается в сыворотке крови уровень двух аминотрансфераз, креатинкиназы (и ее изо-форм) и лактатдегидрогеназы (и ее изоформ) при инфаркте миокарда; умеренно повышено их содержание при поражениях тканей мозга и печени. Определяют, кроме того, активность кислой фосфатазы (уровень повышен при карциноме предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэсте-разы и некоторых других органоспецифических ферментов (например, гистидазы, уроканиназы, глицинамидинотрансферазы) в сыворотке крови при патологии костной ткани, печени, метастатических карциномах и т. д. Доказано, что органы и ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации ферментов между внутриклеточными и внеклеточными частями тела. Поэтому любые, даже незначительные, повреждения клеток (иногда функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперферментации (повышенное содержание ферментов в крови) до конца не расшифрован. Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в индивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.Происхождение ферментов, находящихся в плазме крови, двойственное. Одних ферментов очень много, они выделяются в плазму там выполняют свои функции. Это синтезируемые в печени белки свёртывания крови (тромбин), синтезируемый в гломерулах почек ренин и др. Их называют секреторными ферментами. Концентрации других ферментов очень малы, и они не выполняют своих функций в плазме, поскольку являются органоспецифичными и свои функции выполняют в клетке. Это индикаторные или клеточные ферменты (лактатдегидрогеназа, аминотрансферазы и др.). Когда из-за болезни или травмы поражаются органы или ткани, активность большинства этих ферментов в плазме крови возрастает. Есть также экскреторные ферменты, которые синтезируются в печени (или в других органах) и в физиологических условиях выделяются вместе с желчью (щелочная фосфатаза, γ-глютамилтрансфераза и др.). Когда выделение этих ферментов с желчью нарушается, увеличивается их 43. Применение ферментов в качестве лекарственных средств Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях: заместительная терапия - использование ферментов в случае их недостаточности; элементы комплексной терапии - применение ферментов в сочетании с другой терапией. Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.). В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитов. Ферментные препараты стали широко применять при тромбозах и тромбоэмболиях. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы. Фермент гиалуронидазу (лидазу), катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют подкожно и внутримышечно для рассасывания контрактур рубцов после ожогов и операций (гиалуроновая кислота образует сшивки в соединительной ткани) (см. раздел 8). Ферментные препараты используют при онкологических заболеваниях. Аспарагиназа, катализирующая реакцию катаболизма аспарагина, нашла применение для лечения лейкозов: Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкоз-ных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина (см. схему ниже). Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате - нарушение метаболизма клетки. 44. Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях: при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток; количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения; активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений; ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность); существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов. Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы. Первая активно секретируется в плазму крови определёнными органами. Например, печень синтезирует неактивные предшественники ферментов свёртывающей системы крови. Ко второй относят большую группу ферментов, высвобождающихся из клеток во время их нормального функционирования. Обычно эти ферменты выполняют свою функцию внутри клетки и не имеют физиологического значения в плазме крови. У здорового человека активность этих ферментов в плазме низкая и достаточно постоянная, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток и скоростей разрушения. При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь. (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе). Уровень активности ферментов в плазме коррелирует со степенью повреждения клеток. Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов. Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе. Изоформы лактатдегидрогеназы.Фермент лак-татдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты) Лактатдегидрогеназа- При ряде заболеваний исследуют активность ЛДГ в плазме крови. В норме активность ЛДГ составляет 170-520 ЕД/л. Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Изоформы креатинкиназы.Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата: Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. 3. Энзимодиагностика при инфаркте миокарда При инфаркте миокарда наблюдают достоверные изменения в крови активности ферментов КК, ЛДГ и аспартатаминотрансферазы - ACT, которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от зоны тканевого повреждения. 45. Принципы обнаружения и количественной оценки ферментов. Единицы измерения активности и количества ферментов Ферменты обнаруживают и оценивают по двум критериям: по появлению продуктов реакции или по исчезновению субстратов. Ферменты проявляют специфичность в отношении субстратов и типа реакции. Активность ферментов зависит от температуры, рН среды, концентрации субстрата [S] и концентрации фермента [Е]. Количественная оценка активности ферментов в биологических жидкостях (кровь, моча, слюна) широко используются в клинической практике для диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний. Как правило, активность ферментов увеличивается при заболеваниях печени, инфаркте миокарда и других видах патологии. При диагностике болезней, связанных с врожденной недостаточностью метаболизма, определение активности ферментов становится единственным критерием болезни. Количественная оценка активности ферментов основывается на измерении количества образовавшегося продукта реакции или убыли субстрата в единицу времени, отнесенного к 1 мг белка или 1 мл биологической жидкости. Скорость ферментативной реакции определяется изменением концентрации продукта или субстрата за единицу времени Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (МЕ) Количество единиц активности nME определяют по формуле: nME=  В 1973 г. была принята новая единица активности ферментов: 1 катал (кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. Количество каталов определяют по формуле: n катал =  Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами: 1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/мин = 60х106 мкмоль/мин = 6х107 ME, 1 ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат. В медицинской и фармацевтической практике для оценки активности ферментов часто используют международные единицы активности - ME. Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (пМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани: Уд. ак. =  По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность. Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента. 46 Опыты по изучению pH среды, термолабильности и специфичности ферментов техника выполнения Белковая природа обеспечивает ферментам характерные для белков строение и свойства и, прежде всего, лабильность, т.е. способность изменять активность в зависимости от различных факторов (температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата, активаторов и ингибиторов и т.п.). Степень изменения активности от различных факторов можно определить по скорости ферментативной реакции. Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальные значения. Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность – одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм ингибирующего действия сводится к двум типам торможения (необратимое и обратимое). Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным. Специфичность действия ферментов – это способность катализировать одну или несколько близких реакций, преобразовывать одно вещество или один вид связей. Специфичность ферментов бывает нескольких видов: абсолютная, относительная (групповая), стереохимическая. Ферменты отличаются от катализаторов небиологической природы высокой специфичностью, что обусловлено индивидуальными особенностями строения активных центров различных ферментов. Пространственная структура активного центра предопределяет не только комплементарность субстрату, но и природу последующих превращений субстрата в фермент- субстратном комплексе, приводящих к образованию соответствующего продукта. Будучи высокоспецифичной, ферментативная реакция протекает в 105-1012 раз быстрее, чем самопроизвольная (спонтанная) реакция. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ АМИЛАЗЫ И САХАРАЗЫ Для изучения специфичности этих ферментов используем амилазу слюны и сахаразу хлебопекарных дрожжей. Амилаза слюны (3.2.1.1) по механизму действия является a-амилазой. Катализирует гидролиз a-1,4-гликозидных связей в молекуле крахмала (и гликогена) без определенного порядка. Процесс гидролиза происходит как бы ступенчато и может быть выражен в виде схемы: Крахмал ® Амилодекстрины ® Эритродекстрины ® Ахродекстрины ® Мальтодекстрины ® Мальтоза. Глубину гидролиза крахмала можно контролировать по цветной реакции с раствором йода (см. табл. 8). Сахараза из дрожжей имеет более правильное рабочее название b-фруктофуранозидаза (3.2.1.26). Катализирует гидролиз b-гликозидных связей в молекулах как сахарозы, так и раффинозы, при этом сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, которые обнаруживаются реакцией Троммера. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ (на акт ферментов) Скорость ферментативной реакции зависит от температуры. Оптимальным считается то значение ее, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Для большинства ферментов, выделенных из организма теплокровных и многих микроорганизмов оптимальная температура составляет 37-40 °С, для ферментов растительного происхождения – 40-50 ˚С. Повышение температуры сверх оптимальной приводит к уменьшению, а затем прекращению действия фермента, что связанно с денатурацией. При переходе от оптимальной к низким температурам скорость ферментативной реакции падает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, достигая минимальной величины при 0 °С и приостанавливается при отрицательных её значениях (минус 18 ˚С). Причиной является снижение скорости движения молекул субстратов и ферментов, что замедляет образование фермент-субстратного комплекса и проведения реакции. При повышении температуры от отрицательных значений действие ферментов восстанавливается, скорость катализируемых реакций возрастает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, до оптимальной температуры. Принцип снижения активности ферментов при понижении температуры используется при консервировании сырья и готовой продукции низкими температурами. Инактивация ферментов высокой температурой необратима, используется в пищевой промышленности для консервирования многих продуктов растительного и животного происхождения. ВЛИЯНИЕ рН НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ Ферменты при постоянной температуре работают наиболее эффективно в пределах рН (от 2 до 10) . Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Отклонение в любую сторону от этого значения сопровождается снижением скорости ферментативной реакции. Это объясняется тем, что ферменты имеют большое число полярных, положительно и отрицательно заряженных групп, участвующих в поддержании нативной конформации, образовании фермент-субстратного комплекса и проведении реакции. Во многих случаях субстраты являются электролитами, и реакция осуществляется лишь с определенными (ионизированными или неионизированными) их формами, возникающими при оптимуме рН. Многие ферменты являются двухкомпонентными (сложными белками), небелковый компонент которых слабо связан с белком ионными, водородными связями в условиях оптимума рН. Сдвиги рН за пределы оптимума вызывают диссоциацию кофактора и разрушение структуры активного центра. Например, пероксидаза диссоциирует в кислой среде на два компонента, однако при рН 7,0 её структура и активность восстанавливаются. При очень низких и очень высоких значениях рН ферменты денатурируют. |