ответы к экзамену биотехнология. 1. Биотехнология как межотраслевая область научнотехнического прогресса и раздел практических знаний 1917 г был введён термин биотехнология
 Скачать 340.74 Kb.
|
|
49. Иммобилизованные клетки в биотехнологии В 70-х годах XX века появились первые публикации об иммобилизации клеток микроорганизмов, а первое промышленное применение иммобилизованных клеток было осуществлено в Японии в 1974 г. С их помощью получали аспарагиновую кислоту. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками: · отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов; · снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции; · более высокая активность и стабильность; · возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов; · способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов. Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Методы иммобилизации клеток схожи с методами иммобилизации ферментов. Химический метод основан на образовании ковалентных связей с активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например, глутаровым альдегидом) К физическим методам относятся адсорбция и агрегация. Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна основана на химических и физических взаимодействиях. Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и волокон. Наибольшее количество исследований по иммобилизации клеток микроорганизмов проведено японскими исследователями. Особые успехи были достигнуты ими в области синтеза аминокислот, органических кислот и антибиотиков. В Московском государственном университете был разработан метод получения аспарагиновой кислоты, который по эфективности не уступает японским. Клетки E.coli, включенные в армированный полиакриламидный гель, были с успехом использованы для получения аспарагиновой кислоты, период полужизни катализатора - 110 суток. Иммобилизовать можно не только клетки микроорганизмов, но и клетки растительных и животных тканей, используя их для синтеза физиологически активных соединений. Интересные возможность открываются и при иммобилизации клеточных органелл как активных полиферментных систем. Все это свидетельствует о перспективности развития одного из направлений биотехнологии, связанного с изучением и применением иммобилизованных клеток. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с преимуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные технологические процессы. Следует отметить, что все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов. В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток: 1. Получение глюкозофруктозных сиропов. 2. Получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей. 3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония. 4. Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты. 5. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты. 6. Получение безлактозного молока. 7. Получение Сахаров из молочной сыворотки. 8. Получение 6-аминопенициллановой кислоты. Иммобилизованные клетки в биотехнологии. - Биосинтез и трансформация аминокислот, органических кислот, антибиотиков, стероидных углеводов, углеводородов, нуклеотидов и нуклеозидов; - пивоварение и виноделие; - очистка сточных и природных вод; - извлечение металлов из сточных вод; - ассимиляция солнечной энергии; - изготовление водородных солнечных элементов; - азотфиксация; - аналитические цели - изготовление электродов. Иммобилизованная глюкозоизомераза используется в США, Японии и Европе для промышленного производства концентрированного фруктозного сиропа путем частичной изомеризации глюкозы, получаемой из крахмала. Миллионы тонн такого сиропа ежегодно выпускаются с помощью этого фермента, который в настоящее время является наиболее широко применяемым из всех иммобилизованных ферментов. Промышленные и коммерческие успехи этого процесса определяются следующими факторами: глюкоза, получаемая из крахмала, относительно дешевая; фруктоза – более сладкая, чем глюкоза; концентрированный фруктозный сироп содержит примерно одинаковые количества глюкозы и фруктозы, а по сладости подобен сахарозе. Другой важной областью применения иммобилизованных ферментов является производство аминокислот с помощью аминоацилазы. Колонки с амино-ацилазой используются в Японии для производства сотен килограммов L-метионина, L-фенилаланина, L-триптофана и L-валина. Ферментно-полимерные коньюгаты широко используются в аналитической и клинической химии. Иммобилизованные на колонках ферменты могут использоваться повторно в качестве специфических. Огромным преимуществом иммобилизованных клеточных систем является замена ими сложных ферментационных процессов, таких, как получение вторичных продуктов микробного метаболизма (производство синтетических антибиотиков), в постоянно контролируемых химических процессах с использованием ферментных электродов, водных анализах и обработках отходов, непрерывных солодовых процессах, азотфиксации, синтезе стероидов и других. 50. Получение рекомбинантных белков с помощью прокариотических систем Генетическая инженерия – ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности и способы создания лабораторным путем генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм. Рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК , полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке . Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные вне клетки два компонента: - вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии; - фрагмент клонируемой ДНК, содержащие интересующие исследователя генетические элементы. Наиболее важные методы биотехнологии рекомбинантных ДНК: 1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различиных генов и манипуляции с ними. 2. Быстрое секвенирование(установление последовательности азотистых оснований ДНК) всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида; 3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания. 4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерии. 5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы. Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. Coli. Достоинства E. Coli.: высокий уровень экспрессии, низкая цена, быстрый рост, индотоксины отсуствуют, простые условия культивирования. Недостатки E. Coli.: Плохо формируют дисульфидные связи, возможность нарушения формирования белка, неэффективность рефолдинга, отличие кодонов от соответсвующих эукариот, минимальные пострансляционные модификации. Дрожжи. Их преимущество заключается прежде всего в "технологичности": дрожжи легко выращивать в условиях производства. Они характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания, легко отделяются, не загрязняют воздух спорами. Клетки дрожжей содержат до 25% сухих веществ. Наиболее ценный компонент дрожжевой биомассы - белок, который по составу аминокислот превосходит белок зерна злаковых культур и лишь немного уступает белкам молока и рыбной муки. Биологическая ценность дрожжевого белка определяется наличием значительного количества незаменимых аминокислот. По содержанию витаминов дрожжи превосходят все белковые корма, в том числе и рыбную муку. Кроме того, дрожжевые клетки содержат микроэлементы и значительное количество жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты. При скармливании кормовых дрожжей коровам повышаются удои и содержание жира в молоке, а у пушных зверей улучшается качество меха. Интерес представляют и дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов. 51.Особенности производства белков продуктов медицинского назначения Синтез инсулина Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей. 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов). 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В). 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид. 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь. 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи. 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей. 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин. Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин. Интерфероны - это группа белковых веществ, вырабатываемых зараженными вирусами. Они индуцируют локальные и системные противовирусные реакции в других клетках.Используются как противовирусные препараты. Виды интерферонов: 1.L-группа (лейкоцитарный интерферон) 2.В-группа (интерфероны фибробластов) 3.G-группа (иммунный интерферон Т-лимфоциты) Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возможных) принципиально сводится к следующему: 1. Индукция синтеза и выделение интерфероновой м. РНК из клеток; 2. Получение к. ДНК, комплементарной интерфероновой м. РНК из лейкоцитов; 3. Встраивание к. ДНК в плазмиду; 4. Введение реконструированной плазмиды в клетки E. coli; 5. Размножении бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в культуральной среде; 6. Сепарирование клеток E. coli; 7. Дезинтеграция и экстракция клеток E. coli; 8. Осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифугированием; 9. Высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфатом; 10. Диализ осадка интерферона; 11. Растворение интерферона, пропусканием раствора через колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами); 12. Элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике. Из указанных стадий, только 8 последних фактически реализуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии выполняются в лабораторных условиях. Именно эти первые 4 этапа являются наиболее трудными и сложными. Гормон роста (соматотропин). В клинике испытан еще один рекомбинантный белок, полученный методом микробиологического синтеза, — гормон роста человека, который секретируется передней долей гипофиза и содержит 191 аминокислотный остаток. По способу получения выделяют: • гомологичные, добываемые из гипофизов трупов; • синтетические, имеющие в своем составе на одну аминокислоту (метионин) больше, чем человеческий гормон роста; • рекомбинантные, получаемые с помощью генной инженерии. Получение соматотропина • На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию м. РНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. • Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от первой до 23 -й. • Далее два фрагмента объединяли, затем подстроили к паре промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составляет 2, 4 млг на мл культуры Е. соli. Весь технологический цикл состоит из пяти функционально различных этапов: 1. ферментация 2. первичная очистка белка 3. хроматографическая очистка 4. изготовление лекарственной формы 5. анализ качества субстанции и лекарственной формы соматогена. 52.Использование достижений биотехнологии в сельском хозяйстве и охране окружающей среды Защита окружающей среды – это комплексная проблема, которая может быть решена только совместными усилиями специалистов различных отраслей науки и техники. Экобиотехнологические проблемы окружающей среды: переработка отходов, очищение воды, устранение загрязнения среды. Многие из созданных человеком в-в устойчивы и не разлагаются микроорганизмами. Для их утилизации нужны новые технологии. В воде и почве биотрансформация ксенобиотиков идет под воздействием микроорганизмов, и некоторые могут преобразоваться в еще более опасные соединения. Бытовые и промышленные сточные отходы содержат разнообразные питательные вещества. В сточных водах содержится сложная смесь твердых и растворимых в-в. Переработка сточных вод: 1.Отделение тв влажных конц в-в ( первичная переработка) 2. При вторичной обработке обр акт клеточный ил 3. Полное отделение всех оставшихся примесей (третичная переработка) Неприятный запах обусловлен разложением белков в анаэробных условиях. Вбытовых сточных водах часто присутствуют и патогенные вирусы, поэтому пищевые трубопроводы должны быть изолированы. Получение экологически чистой энергии одно из направлений экобиотехнологии. Биогаз — это смесь из 65 % метана, 30 % С02, 1 % сероводорода и незначительных примесей азота, кислорода, водорода и угарного газа. Энергия, заключенная в 28 м 3 биогаза, эквивалентна энергии: 16,8 м 3 природного газа; 20,8 л нефти; 18,4 л дизельного топлива. В основе получения биогаза лежит процесс метанового брожения, или биометаногенез — процесс превращения биомассы в энергию. В основе получения лежит процесс метанового брожения – биометаногенез – сложный микробный процесс, в котором органическое вещество разлагается в анаэробных условиях до метана и углекислого газа. Получение биогаза широко распространено в Индии, Китае и Японии. Реактор для переработки может быть непрерывным или полупериодическим. В реакторе остается сапропель – естественное удобрение. Стадии анаэробного синтеза( используется 190 микроорганизмов) 1. Энзиматический гидролиз белков, липидов, сахаридов. 2. Образование ацетата, может идти 2 путями : ацетогенные организмы, галлоацетатные организмы. 3. Образование метана, который синтезируется через восстановление угл газа, или из метильной группы ацетата. Энергию можно получать из растений, богатых углеводами, превращая их в спирт (этанол). К ним относятся меласса, картофель, маниок, стебли кукурузы, злаки, топинамбур (земляная груша). Большое количество этанола получают из гидролизатов древесины лиственных пород или из сульфитных щелоков — отходов бумажных фабрик. Полученный спирт можно смешивать с бензином в соотношении 1:9 (или даже 1:4) и заправлять им машины. Рост производства этанола связан с широтой его применения в химической промышленности. Он прекрасный растворитель, антифриз, экстрагент. Этанол служит также субстратом для синтеза многих растворителей, красителей, лекарственных препаратов, смазочных материалов, клеев, моющих средств, пластификаторов, взрывчатых веществ и смол для производства синтетических волокон. Его используют в двигателях внутреннего сгорания либо в безводном виде, либо в форме гидратированного этанола. Среди растений, продуцирующих этиловый спирт, следует выделить маниок, злаки (особенно кукурузу) и топинамбур, у которого запасным углеводом является инулин. Используются также сахарный тростник, ананас, сахарная свекла, сорго, у которых основной углевод — сахароза 53. Получение и использование трансгенных растений для повышения продукции сельского хозяйства и качества продуктов питания Трансгенными могут называться те виды растений, в которых успешно функционирует ген (или гены) пересаженные из других видов растений или животных. Делается это для того, чтобы растение реципиент получило новые удобные для человека свойства, повышенную устойчивость к вирусам, к гербицидам, к вредителям и болезням растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Также часто такие растения дают более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги. Генетически измененный продукт - это когда выделенный в лаборатории ген одного организма пересаживается в клетку другого. Вот примеры из американской практики: чтобы помидоры и клубника были морозоустойчивее, им "вживляют" гены северных рыб; чтобы кукурузу не пожирали вредители, ей могут "привить" очень активный ген, полученный из яда змеи; чтобы скот быстрее набирал вес, ему вкалывают измененный гормон роста (но при этом молоко наполняется гормонами, вызывающими рак); чтобы соя не боялась гербицидов, в нее внедряют гены петунии, а также некоторых бактерий и вирусов. Соя - один из основных компонентов многих кормов для скота и почти 60% продуктов питания. Получение трансгенных растений является на данный момент одной из перспективных и наиболее развивающихся направлений агропроизводства. Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция, кроме того, что на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет получать растения с заданными хозяйственно ценными признаками, а также обладающих свойствами, не имеющими аналогов в природе. Примером последнего могут служить полученные методами генной инженерии сорта растений, обладающих повышенной устойчивостью к засухе. Создание трансгенных растений в настоящее время развиваются по следующим направлениям: 1. Получение сортов с/х культур с более высокой урожайностью 2. Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год (например, в России существуют ремантантные сорта клубники, дающие два урожая за лето) 3. Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей (например, в России ведутся разработки, направленные на получение сортов картофеля, листья которого являются остро токсичными для колорадского жука и его личинок) 4. Создание сортов с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона) 5. Создание сортов растений, способных синтезировать некоторые белки животного происхождения (например, в Китае получен сорт табака синтезирующий лактоферрин человека) Таким образом, создание трансгенных растений позволяет решить целый комплекс проблем, как агротехнических и продовольственных, так и технологических, фармакологических и т.д. Кроме того, уходят в небытие пестициды и другие виды ядохимикатов, которые нарушали естественный баланс в локальных экосистемах и наносили невосполнимый ущерб окружающей среде. Создание конструкции для генетической трансформации растений 1) выделение либо синтез (химический, ПЦР) целевого гена (анализ его структуры, выделение кодирующей части, удаление ненужных частей); 2) присоединение к целевому гену регуляторной части – промотора; Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детёныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения. Трансформация-изменение генетических свойств клетки в резеультате проникновения в нее чужеродной ДНК. Этапы получения трансгенных растений: 1 этап – выбор гена и его клонирование; 2 этап – подбор генотипа растения-реципиента; 3 этап – создание генной конструкции, содержащей выбранный ген и векторную молекулу-переносчик ДНК 4 этап – перенос векторной молекулы в геном растения с помощью наиболее приемлемого метода 5 этап – регенерация растений из трансформированных клеток и отбор трансгенных растений Создание конструкции для генетической трансформации растений 1) выделение либо синтез (химический, ПЦР) целевого гена (анализ его структуры, выделение кодирующей части, удаление ненужных частей); 2) присоединение к целевому гену регуляторной части – промотора; Методы трансформации растений 1)Баллистический метод Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4-1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной хлоридом кальция или ПЭГ, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300-600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, интегрируется в растительную ДНК. Частота трансформации повышается при использовании линейной, а не кольцевой ДНК. Баллистический метод позволяет встраивать нужные гены не только в хромосомы растений, но и в геном их органелл – пластид. 2) Конструирование векторных систем на основе Ti-плазмид • гены биосинтеза ауксинов и цитокининов должны быть удалены, т.к. фитогормоны будут подавлять регенерацию из трансформированных клеток целого растения; • ген опина также должен быть удален, т.к. при его наличии может снижаться биомасса; • участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены, т.к. Ti-плазмида имеет очень большой размер; • необходимо внести сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в E. Coli 3) Микроинъекция заключается в непосредственном введении растворов ДНК в клетку или ее ядро с помощью полых стеклянных микроигл. Клетка (протопалст) фиксируется на твердой поверхности. Под визуальным контролем на специальном микроскопе с помощью микроманипулятора производится введение микрокапилляра в ядро. С помощью специальной гидравлической системы через иглу подается от 1 до 5 пиколитров раствора ДНК с концентрацией от 0,1 до 1,0 мкг/мл. Ограничения: • необходимость закрепеления клетки либо протопласта на поверхности стекла; • трудоемкость и сложность используемого обрудования; • наличие высококвалифицированного персонала, осуществляюшщего микроинъекцию. |