ответы к экзамену биотехнология. 1. Биотехнология как межотраслевая область научнотехнического прогресса и раздел практических знаний 1917 г был введён термин биотехнология
 Скачать 340.74 Kb.
|
|
30. Специализированные ферментационные технологии: анаэробные, твердофазные и газофазные процессы Большинство ферментационных технологий связано с жидкими аэрируемыми системами, однако в настоящее время достаточно широко используются ферментационные технологии, основанные на утилизации плотных субстратов, при отсутствии воды или малом ее количестве, а также в безкислородных условиях. Анаэробные процессы. Биореакторы для таких процессов лишены приспособлений для аэрирования среды, хотя некоторые из анаэробных процессов сопровождаются потреблением газообразных продуктов водорода, метана, поэтому требуют соответствующих приспособлений для подачи газов в жидкую среду. Ведущим моментом является обеспечение анаэробиоза, что сопряжено со значительными сложностями. Твердофазные процессы. Твердофазные осуществляются, на основе растительного сырья и используют чаще всего мицелиальные грибы и дрожжи или их комбинации. Различают три типа твердофазных процессов: Поверхностные, когда слой субстрата не превышает 3-7 см ("тонкий слой"). В качестве "биореакторов" используются большие (до нескольких квадратных метров) подносы или культуральные камеры. Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое ("высокий слой"). Биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных твердофазных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конвекционный газообмен. Перемешиваемые процессы, протекающие в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным (полужидкой консистенции) или состоять из частиц твердого вещества, взвешенных в жидкости (переходный вариант от твердофазного процесса к процессу в жидкой фазе). Для этого обычно используют биореакторы с низкоскоростным перемешиванием. Газофазные процессы. Процессы этого типа осуществляются в аппаратах с твердым наполнителем, через который пропускают газ. В таких аппаратах получают, например, спирт на основе дрожжей, а также их биомассу, мелкие агрегаты дрожжевых клеток, предварительно увлажненные концентрированной питательной средой, "парят" в потоке газа, подаваемого под сильным давлением через сопло в днище реактора. Газ,покидающий аппарат, несет с собой летучие продукты жизнедеятельности дрожжей (в том числе и спирт), которые конденсируются в холодильнике.Процесс может осуществляться как в аэробных, так и в анаэробных условиях (в зависимости от используемого газа). 31.Особенности культивирования клеток животных и растений Особенности культивирования клеток растений. В суспензионной культуре: клетки образуют агрегаты и сами по себе дифференцируются На плотной среде – образуются калусные культуры (обычно бесцветные, хотя растут на свету) Растение – лист – пектиназа, можно ввести ДНК, клетки – целлюлоза – протопласты (используются в клеточной инженерии, слияние – клетки – гибриды растения) – регенирация – деление – каллус на плотной среде – побеги – фитогармоны Метод флотации: клетки продуцента обл. небольшой смачивостью и клетки продуцент. Накапливаются в верхних слоях биореактора, Доб. ПАВ – образуется пена – собирают пену в пеноприлы + экономичность. Метод фильтрации: использует различные фильтры. Принцип задержания биомассы: диаметр пор уменьш. Р-ра культивируемых клеток. Биомассу с фильтра снимаем струей воздуха или специальными Лопатками. Метод центрифугирувания: осаждение частиц культ. Жидкости с применением центорбежной силы. Но это очень дорого, зато – эффективно. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ стенок: Физические методы (жидкая среда: ультразвук, замораживание, мельницы; твердая среда: прессы/шаровая мельница) Химические методы (детергенты, обработка кислотой, экстракция ацетоном, толуолом) Существует 2 основных системы культивирования животных клеток: 1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами: прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды); постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются); перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды)( Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.) 2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток: монослойные культуры и суспензионные культуры. Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ: 1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты. 2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток. 3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату. 4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований. 5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты. Недостатками монослойных культур являются: требования большого пространства; возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба; недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы; сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода. Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток. Стандартные среды для введения культур животных клеток 1. Среда Игла: содержит мин. в-ва, АК (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин, инозит. Используется только с сывороткой, т.к. в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. 2. Среда Дульбекко: содержит двойную концентрацию АК, глицин, железо. Основа для бессывороточных сред. 3. Среда Искова: содержит незаменимые АК, биотин, витамин В12. Среда быссывороточная. Используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток. 4. Среда МакКоя: в присутствии сыворотки (культивирование лейкоцитов, гибридом) 5. Среда 199: без добавок – поддерживание для первичных клеток. С сывороткой – ростовая среда для быстрого размножения клеток. 32. Конечные стадии получения продуктов биотехнологических процессов Существует 5 стадий биотехнологического производства. Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами. Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит. На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции. Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. 33. Отделение биомассы: флотация, фильтрование и центрифугирование Разделение культуральной жидкости и биомассы - сепарация. Это 1-ый этап очистки целевого продукта. Виды сепарации: 1. Флотация. Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости, то жидкость предварительно вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с клетками. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости. 2. Фильтрация - задержание биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Применяют фильтры однократного или многократно использования: барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток. Иногда биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. 3. Центрифугирование - осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация иногда реализуются в комбинации, в фильтрационных центрифугах. Перспективны для осаждения биомассы центрифуги-сеператоры, в которых биомасса оседает на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки. 34. Методы дезинтеграции клеток: физические, химические и энзиматические Под дезинтеграцией (деструкцией) клеток понимают процесс необратимого нарушения анатомической целостности клеток. С практической точки зрения необходимым и достаточным является разрыв клеточной оболочки, который может быть вызван различными повреждающими факторами - физическими, механическими, химическими, энзиматическими, биологическими. В природных условиях дезинтеграция клеток и клеточных систем вызывается внутриклеточными (внутренними) и внешними причинами. К внутренним причинам можно отнести факторы генетической природы. К различным внешним воздействиям можно отнести физические, физико-химические, химические и биологические факторы. Вызванную действием внутренних факторов дезинтеграцию обычно определяют как естественную. Наряду с естественной дезинтеграцией бывает искусственная (насильственная) дезинтеграция. Последняя целенаправленно применяется человеком и часто используется в научной и производственной деятельности. При этом основной задачей дезинтеграции является извлечение функционально активных структур и биополимеров. В настоящее время можно определить три направления практического применения методов искусственной дезинтеграции клеточных систем: 1. Дезинтеграция биомассы (животной, растительной, микробной) для производства продуктов пищевого, кормового и технического назначения. (Биомасса подвергается комплексному внеклеточному дезинтегрирующему разрушению (механическому, химическому и энзиматическому), а затем продукты распада (дезинтеграты) используются для биосинтеза). 2. Дезинтеграция как способ стерилизации и инактивации живых систем. (Второе направление применяет методы направленные на тотальное уничтожение или полное, желательно необратимое, прекращение жизнедеятельности вредных и болезнетворных микроорганизмов. Они могут применяться для консервации и хранения продуктов, для обеззараживания различных сред и материалов). 3. Дезинтеграция как инструмент для направленного разрушения клеток и клеточных систем в научной деятельности. Первое и второе направление традиционны. Физические методы Наиболее популярными физическими и механическими методами являются: баллистические, гидро- и криоэкструзионные, ультразвуковые, декомпрессионные. Химические и энзиматические методы Нейтральные соли, органические соединения, хелатные агенты, детергенты и др. способны повреждать и при некоторых условиях разрушать оболочку микробной клетки. В основе данного метода лежат различные механизмы нарушения межмолекулярной и химической связи между структурными элементами клеточной стенки. Обработку клеток химическими реагентами используют как подготовительный этап, предшествующий энзиматической дезинтеграции. Для энзиматической дезинтеграции используют широкий набор ферментов и ферментных комплексов бактериологического, миколитического и дрожжелитического действий. Причем энзиматическая дезинтеграции нашла особое широкое применение в научных исследованиях, где её используют для холодного выделения малоустойчивых субклеточных структур, изучения особенностей строения и состава клеточных стенок, исследования путей и механизмов их биосинтеза и регенера- ции. Особенно перспективным является применение иммобилизованных литических ферментов. 35. Выделение целевого продукта: осаждение, экстрагирование, адсорбция, электрохимические методы, ионообменная хроматография Выделение целевого продукта микробиологического биосинтеза – это завершающая стадия биотехнологического процесса. При этом продукты биосинтеза могут, как накапливаться в клетках продуцентов, так и выделяться в культуральную жидкость. После разрушения клеток выделение целевого продукта из раствора осуществляется методами, общими для внеклеточных и внутриклеточных продуктов: Осаждение – выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящим его в твердую фазу. Осаждение проводят физическими (нагревание, охлаждение, разбавление или концентрирование раствора) или химическими методами. Так, пенициллин переводят в кристаллический осадок в присутствии соединений калия или натрия. Белки осаждают добавлением сульфата аммония, органических растворителей (этанола, ацетона). Экстракция– переход целевого продукта из водной формы в несмешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). Наиболее распространено выделение жироподобных веществ жидкими углеводородами (типа бензина), но применяются и многие другие виды экстрагентов (хлороформ, эфир, бутилацетат). Экстракция прямо из твердой фазы (в том числе и биомассы микроорганизмов) называется экстрагированием. Частным случаем является холодовая экстракция (криоэкстракция), когда предполагается выделение продуктов из замороженных образцов, в этом случае используются растворители с низкой температурой кипения, которые при комнатной температуре переходят в газообразное состояние. Криоэкстракция часто используется в комбинации с криоконсервацией клеток. Адсорбция– перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его осаждения (сорбции) на специальных твердых носителях (сорбентах). Хорошим адсорбентом является древесный уголь, глины с развитой пористой поверхностью. Путем адсорбции выделяют антибиотики и витамины. Хроматография – процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и отделяются от сорбента вместе, а при хроматографии они выходят из сорбента по очереди, что позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга. 36. Концентрирование, обезвоживание, модификация и стабилизация целевых продуктов биотехнологических процессов Концентрирование продукта Методы концентрирования 1)обратного осмоса (концентрируемый раствор помещается в мешок из полупроницаемой мембраны, снаружи создается осмотическое давление, превышающее осмотическое давление раствора, в результате чего растворитель начинает вытекать через мембранупротив градиента концентрации растворенного вещества, обусловливая дальнейшее концентрирование раствора) 2)ультрафильтрация (концентрирование вещества с помощью мембранных фильтров. Технология ультрафильтрации привлекает своей простотой, относительной экономичностью и щадящим обращением с продуктом, поскольку осуществляется при умеренно низком внешнем давлении. Кроме того, в данном методе не требуется изменение рН. Поэтому метод перспективен при концентрировании малостабильных продуктов (некоторые аминокислоты, антибиотики и ферменты). 3) выпаривания (метод выпаривания наиболее древний и обладает существенным недостатком: для удаления растворителя концентрируемый раствор следует нагревать, для этого применяются вакуумные испарители, обеспечивающие более щадящий режим концентрирования. Нагревающим агентом обычно служит водяной пар, хотя используется также обогрев жидким теплоносителем или электрическими нагревателями. Выпаривающие аппараты бывают периодического и непрерывного действия с однократной и многократной циркуляцией кипящего раствора. Обезвоживание продукта (сушка) Выбор методов сушки определяется физико-химическими и биологическими свойствами обезвоживаемого продукта, вязкости раствора или степени сохранности жизнеспособности, если дело имеют с живыми объектами. 1)обезвоживание в газообразных нагревающих агентах (пар, воздух, углекислый газ, дымовые газы) которые с высокой скоростью подаются в сушильный аппарат снизу, а частицы обезвоживаемого продукта парят в этом газовом потоке. Преимущество данного способа состоит в возможности регулировать интенсивность массо-тепло-обмена за счет изменения продолжительности пребывания препарата в воздушном потоке, а также возможность организации непрерывного процесса. Недостатком метода является прилипание продукта к стенкам сушильной камеры. 2)барабанные сушилки, в которых подогреваемые барабаны вращаются в сосудах с микробной взвесью. Соприкасаясь со стенками барабана, взвесь обезвоживается и биомасса присыхает к поверхности барабана. Засохшую биомассу удаляют специальными ножами. 3)вакуумные сушильные шкафы (для лабильных материалов) при пониженных давлениях и температурах. 4) распылительные сушильные аппараты, в которых обезвоживающиеся растворы или суспензии превращаются путем пропускания через форсунки (или вращающиеся диски) в аэрозоль, который подается в сушильную камеру с нагретым газом (110-150 0С). В таких сушилках выживаемость бактериальных культур достигает лишь 20-30%, что явно не удовлетворяет требуемому качеству препаратов. 5) лиофильные сушки (наиболее широко используются), особенно для высушивания лабильных белковых препаратов или препаратов медицинского назначения. Препараты предварительно замораживаются, и вода испаряется из замороженного состояния при высоком вакууме. Модификация продуктов Различного рода модификации необходимы в тех случаях, когда в результате процесса получается лишь "заготовка" целевого продукта. Так, например, пенициллин модифицируется до полусинтетических препаратов, поступающих для практического использования как коммерческие препараты. В некоторых случаях при биотехнологическом процессе продуцент образует какую-то определенную структуру, к которой уже химическим путем добавляется необходимый компонент. Модификация является необходимым этапом при получении многих ферментов, гормонов и препаратов медицинского назначения. Соединения животного или растительного, а также микробного происхождения зачастую необходимо изменять таким образом, чтобы придать им требуемые для тех или иных целей качества. Например, у бычьего инсулина удаляются аминокислотные остатки, после чего он становится идентичным человеческому гормону. Стабилизация продукта Для сохранения требуемых свойств получаемых продуктов в процессе их хранения, реализации и использования потребителями применяют различного рода физико-химические воздействия с целью повышения его стабильности. Стабилизация ферментов также достигается добавлением к препаратам глицерина или углеводов, которые формируют многочисленные водородные связи с аминокислотными остатками, препятствуя тем самым их денатурированию при нагревании или спонтанной инактивации. Пример: стабилизация пищевого продукта, получаемого из яичных желтков -меланжа, свойства которого при хранении существенно изменяются, что делает его непригодным к использованию. Однако порчу меланжа можно предотвратить, если удалить из него углеводы посредством выращивания на меланже пропионовокислых бактерий. Бактерии "выедают" углеводы, повышают питательную ценность продукта за счет обогащения органическими кислотами и витаминами В, а также значительно удлиняют сроки хранения меланжа. |