1. Ферменти визначення властивості ферментів як біологічних каталізаторів
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
Інгібітори ферментів. Інгібітори - хімічні сполуки, що зменшують каталітичну активність ферментів. Навідміну від речовин, які інактивують ферменти за рахунок їх денатурації (концентровані кислоти та луги, солі важких металів у високих концентраціях), дія інгібіторів є специфічною стосовно певних ферментів або груп ферментів, вони мають низьку концентрацію. За допомогою інгібіторів отримують цінну інформацію про специфічність дії ферментів, природу функціональних груп їх активних центрів, про механізм дії і т. ін. 9. Типи інгібування ферментів: зворотнє (конкурентне, неконкурентне) та незворотнє інгібування. Залежно від характеру змін, що відбуваються в молекулі ферменту, розрізняють: 1) оборотне інгібування, що описується таким рівнянням взаємодії ферменту з інгібітором І 2) необоротне інгібування: Оборотне інгібування ферментів, залежно від механізму взаємодії ферменту з інгібітором, поділяється на конкурентне та неконкурентне. Конкурентне інгібування спричиняють ліганди, що за своєю хімічною структурою близькі до субстрату і взаємодіють із тим самим активним центром на молекулі ферменту, що і субстрат, утворюючи комплекс ЕІ: Класичним прикладом конкурентного інгібітора є малонова кислота яка про тидіє зв'язуванню активним центром ферменту сукцинатдегідрогенази справжнього субстрату - бурштинової кислоти (сукцинату). Конкурентне інгібування викликають різні антиметаболіти, тобто сполуки, близькі за будовою до справжніх клітинних метаболітів: антивітаміни; речовини, близькі до амінокислот, пуринових та піримідинових основ і нуклеотидів. У зв'язку з високою біологічною активністю деякі антиметаболіти застосовують як антибактеріальні засоби (сульфаніламіди, антибіотики), протипухлинні препарати. Конкурентне інгібування ферменту можна перебороти за рахунок підвищення концентрації субстрату в інкубаційному середовищі. Неконкурентні інгібітори не мають структурної подібності до субстрату. Вони реагують з іншими, відмінними від активних центрів, ділянками на молекулі ферменту і можуть зв'язуватися не тільки з вільним ферментом, ай із фермент-субстратним комплексом. Приєднання неконкурентного інгібітора до ферменту зменшує його активність (максимальну швидкість реакції (V ), але не впливає на спорідненість ферменту із субстратом. Неконкурентними інгібіторами є іони важких металів (Cu 2+ , Hg 2+ , Ag + ) та їх похідні, що оборотно зв'язуються із SH-групами цистеїну в молекулах ферментів. Необоротне інгібування ферментів - процес, що відбувається внаслідок руйнування або необоротної хімічної модифікації однієї чи декількох функціональних груп ферменту. Необоротні інгібітори мають властивості клітинних отрут. Прикладом такої модифікації молекули ферменту є дія алкілуючих агентів (зокрема, йодацетаміду), що необоротно реагують із каталітично активними SH-групами: Практично важливим прикладом необоротного інгібування ферменту шляхом ковалентного зв'язування інгібітора з активним центром є вплив фосфорорганічних сполук (ФОС) на активність ферменту ацетилхолінестерази (АХ-естерази). Препарати ФОС є високотоксичними отрутами відносно комах (пестициди) та теплокровних тварин, механізм антихолінестеразного ефекту яких полягає у взаємодії з ОН-групою серину в активному центрі ферменту. 10. Регуляція ферментативних процесів. Шляхи та механізми регуляції: алостеричні ферменти; ковалентна модифікація ферментів. Існують два принципових шляхи регуляції інтенсивності, або швидкості біохімічних ферментативних реакцій: А - через зміну каталітичної активності ферменту. Б - через зміну кількості ферменту (або ферментів), що визначають перебіг ферментативного процесу. А. Перший шлях регуляції передбачає наявність у ферментному пулі клітини спеціальних регуляторних ферментів, які містяться звичайно на головних, ключових ланках метаболізму. Цей шлях забезпечує термінову адаптацію ферментного апарату організму і реалізується протягом декількох секунд або хвилин - механізм "швидкого реагування". Існують чотири основних механізми регуляції каталітичної активності ферментів (L. Stryer, 1995): 1. Алостерична регуляція активності ферментів.2. Регуляція активності ферментів за рахунок їх ковалентної модифікації. 3. Активація ферментів шляхом обмеженого протеолізу. 4. Активація та гальмування активностей ферментів за допомогою особливих регуляторних білків. Алостеричні ферменти - це різновид регуляторних ферментів, що, крім активного центру, мають додатковий регуляторний (алостеричний) центр, з яким взаємодіють алостеричні регулятори (ефектори, модулятори). Алостеричні ефектори можуть бути як позитивними, тобто такими, що збільшують каталітичну активність ферменту (алостеричні активатори), так і негативними, тобто такими, що її гальмують (алостеричні інгібітори). За своєю молекулярною будовою алостеричні регуляторні ферменти складаються, як правило, з декількох поліпептидних ланцюгів, тобто мають четвертинну структуру. Активний та регуляторний (алостеричний) центри локалізуються на різних білкових субодиницях - каталітичній ті регуляторній, відповідно. Модифікація каталітичної активності такого ферменту здійснюється шляхом передачі на каталітичні субодиниці конформаційних змін із регуляторних субодиниць, які відбуваються в останніх після взаємодії з лігандами - ефекторами. Ковалентна модифікація ферментів. Постсинтетична ковалентна модифікація ферментних білків є одним із поширених механізмів контролю за перебігом метаболічних процесів. Шляхами такої модифікації є оборотне фосфорилування-дефосфорилування (найбільш поширений механізм регуляції), метилування, аденілування, АДФ-рибозилування білків-ферментів. Б. Другий шлях регуляції є механізмом довготривалої адаптації ферментного апарату. Для його включення і повної реалізації необхідно декілька годин або діб. 11. Циклічні нуклеотиди (цАМФ, цГМФ) як регулятори ферментативних реакцій та біологічних функцій клітини. Важливою та поширеною біологічною системою контролю за ферментативними реакціями, що поєднує в собі різні молекулярні механізми регуляції, є система циклічних нуклеотидів. Циклічні нуклеотиди 3',5'-АМФ (цАМФ) та 3',5' ГМФ (цГМФ) - це внутрішні (3'5' дифосфорні ефіри аденілової (АМФ) та гуанілової (ГМФ) кислот. Найбільш поширеними є цАМФ-залежні системи контролю за внутрішньоклітинними біохімічними процесами, зокрема за такими, що підлягають нейрогуморальній регуляції з боку цілісного організму, яка реалізується гормонами та нейромедіаторами. Регуляція ферментативних процесів за участю цАМФ включає декілька послідовних стадій передавання і трансформації хімічного (регуляторного) сигналу. 1. Утворення циклічних нуклеотидів у реакціях, що каталізуються ферментами циклазами: аденілатциклазою та гуанілатциклазою з нуклеозидтрифосфатів АТФ та ГТФ, відповідно: Розщеплення цАМФ та цГМФ до звичайних, нециклічних нуклеозидмонофосфатів каталізується фосфодіестеразою циклічних нуклеотидів. Фермент аденілатциклаза розміщений у плазматичних мембранах клітин і його активація відбувається в результаті взаємодії з рецепторами мембран певних фізіологічно активних сполук, зокрема гормонів адреналіну, глюкагону тощо. 2. Активація циклічним АМФ протеїнкіназ, функцією яких є фосфорилування інших ферментних білків. Ці цАМФ-залежні протеїнкінази є регуляторними ферментами, що активуються цАМФ за механізмом алостеричного контролю. 12. Ензимопатії – уроджені (спадкові) вади метаболізму вуглеводів, амінокислот, порфіринів, пуринів. Первинні, або спадкові, ензимопатії виникають унаслідок змін у генетичному коді синтезу ферментів. Причинами ферментативних дефектів можуть бути: аномальна структура ДНК, порушення перенесення генетичного коду від ДНК до РНК, змінена структура РНК і порушення в передачі інформації від РНК до рибосом. Крім того, причиною метаболічних розладів можуть бути генетично зумовлені порушення співвідношення природних активаторів та інгібіторів ферментів. Причиною спадкових ензимопатій є мутації, що виявляються характерними змінами в активності відповідних ферментів. При цьому ферментативна активність відсутня або знижена, або (дуже рідко) підвищена. Можуть з’являтися патологічні ферменти, які в нормі не трапляються. 1. Галактоземії ( дефіцит галактозо- 1-фосфатуридилтрансферази, або галактокінази). При цій патології відбувається накопичення в крові й тканинах галактозо-1-фосфату, вільної галактози та спирту дульциту продукту відновлення галактози. Високий їх уміст діє токсично, у немовлят після споживання молока спостерігають блювання й пронос, збільшується печінка, розвивається катаракта, затримується розумовий розвиток. 2. Фруктоземії (дефіцит фруктозодифосфатальдолази, або фруктокінази). Генетичний дефект альдолази фруктозо-1-фосфату зумовлює істотні порушення в обміні вуглеводів, гіпоглікемію, ураження печінки. 3. Глікогенози:I тип, гепаторенальний глікогеноз, хвороба Гірке (дефіцит глюкозо-6-фосфатази).II тип, генералізований глікогеноз, хвороба Помпе (дефіцит кислої 1,4-а-глюкозидази). Спостерігають збільшення розмірів серця (кардіомегалія) з гіпотонією та серцево-легеневою недостатністю. Смерть настає в дитячому віці.III тип, нирково-м’язовий глікогеноз, хвороба Корі (дефіцит аміло-1,6-глюкозидази).IVтип, печінково-циротичний ендотеліальний глікогеноз, хвороба Андерсена (дефіцит 1,4-а-глюкан-6-а-глюкозилтрансферази). У хворих спостерігають гепатомегалію та спленомегалію, печінкову недостатність.V тип, м’язовий глікогеноз, хвороба Мак-Ардля (дефіцит м’язової фосфорилази). 4. Непереносність дисахаридів Аглікогеноз (дефіцит глікогенсинтетази) характеризується гіпоглікемією з судомами, блюванням, порушенням розумового розвитку. 5.Мукополісахаридози, різні типи (дефіцит глюкуронозилдисульфоглюкозамінглюкуронідази, сульфатази, N-ацетилгексозамінідази, ідуронідази, N-ацетилглюкозаміні дази). 6. Гемолітичні анемії, зумовлені дефіцитом ферментів обміну вуглеводів в еритроцитах.7. Муковісцидози (дефіцит ферментів обміну глікопротеїнів). Спадкові захворювання, що характеризуються ушкодженням залоз внутрішньої секреції, патологічними змінами органів дихання й травлення, наявністю вязкого слизу у вивідних протоках екзокринних залоз (переважно підшлункової та бронхіальних). 1. Еритропоетичні порфірїі: а)природжена еритропоетична порфіріл, або хвороба Гюнтера (дефіцит уропорфіриноген ІІІ-косинтази). У результаті цього біохімічного дефекту відбувається утворення нефізіологічного ізомера уропорфіриногену — уропорфіриногену І. Для цієї патології характерне забарвлення сечі у червоний колір (зумовлене накопиченням нирками уропорфіриногену І, може бути забарвлення кісток і зубів; б)еритропоетична копропорфірія (дефіцит ферменту копропорфіриногеноксидази). Клінічні прояви такі самі, як і при еритропоетичній протопорфірії. Уміст протопорфірину в еритроцитах зростає у 30—80 разів порівняно з нормою в)еритропоетична протопорфірія (дефіцит ферохелатази). Спостерігають підвищену чутливість до сонячного випромінювання (набряк, свербіж, почервоніння шкіри), у разі тривалого перебування на сонці — геморагічні висипи. В еритроцитах уміст протопорфірину IX зростає у 20—100 разів. Спадкові порушення біосинтезу порфіринів (порфіри) - дефекти метаболізму (ензимопатії), за яких порфірини та їх попередники в надмірних кількостях накопичуються в тканинах людського організму, зокрема в шкірі і підшкірній клітковині, та екскретуються з сечею і фекаліями. а) піролопорфірія, або гостра переміжна порфірія (дефіцит уропорфіриногенсинтази); підвищена активність 5-АЛК-синтетази. Вияляється в ранньому дитячому віці. Характеризується нападами гострого болю в животі з диспепсією, лейкоцитозом, поліневритами, галюцинаціями. З сечею виділяється значна кількість порфобіліногену, а також 5-АЛК. Сеча таких хворих має червоне забарвлення; б) спадкова копропорфірія (дефіцит копропорфіриногеноксидази); у сечі й кал значно зростає кількість копропорфірину. Захворювання характеризується неврологічною симптоматикою, як і при гострій переміжній порфірії. Одночасно спостерігаються шкірні симптоми: набряк, везикули, склеродермія; в) природжена пізня шкірна порфірія (дефіцит копропорфіриногеноксидази). Захворювання характеризується вираженою шкірною симптоматикою, яка виявляється у віці після 40 років; г) змішана природжена порфірія (дефіцит ферохелатази й уропорфіриногендекарбоксилази). Ензимопатії при обміні білків 1. Фенілпіровиноградна олігофренія (дефіцит фенілаланін-4-монооксигенази. Відсутність у печінці фенілаланін-4-монооксигенази призводить до розвиту фенілкетонурії.2. Алкаптонурія (дефіцит гомогентизинат-1,2-діоксигенази). Це спадкове захворювання розвивається внаслідок генетичного дефекту гомогентизинат-1,2-діоксигенази — ферменту катаболізму фенілаланіну.3. Тирозиноз , тирозинеміяі типу (дефіцит фумарилацетоацетатгідролази), тирозинемія II типу (синдром Ріхнера—Ханхарта) і тирозинемія новонароджених (транзиторна тирозинемія).4. Альбінізм (дефіцит тирозинази) — молекулярна хвороба. Спадкова відсутність тирозинази призводить до альбінізму.5. Гіперамоніємія (дефіцит ферментів синтезу сечовини: карбамоїлфосфатсинтази, аргініносукцинатліази, орнітинкарбамоїлтрансферази, аргініносукцинатсинтетази, аргінази). 6. Гіпергістидинемія (дефіцит гістидинази). Це спадкове захворювання виникає внаслідок відсутності гістидинази, що каталізує окисне дезамінування гістидину. 13. Ензимодіагностика патологічних процесів та захворювань. Для ранньої діагностики низки захворювань використання ферментів виявилося інформативнішим порівняно з іншими біохімічними тестами. Так, зміну активності аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази, альдолази при інфекційному гепатиті у більшості хворих виявляють значно раніше, ніж інші біохімічні показники (тимолова проба, вміст білірубіну, білкових фракцій тощо). Підвищення активності лужної фосфатази при рахіті, креатинфосфокінази, аспартатамінотрансферази — при інфаркті міокарда використовують для ранньоїдіагностики цих захворювань. При багатьох захворюваннях зміна активності ферментів може бути настільки специфічною, що є одним із вирішальних критеріїв під час установлення діагнозу. Переконливим прикладом може бути використання сорбітолдегідрогенази для діагностики печінкових і обтураційних жовтяниць, креатинфосфокінази та аспартатамінотрансферази — для диференціації інфаркту міокарда й стенокардії. Нерідко активність ферментів змінюється ще до прояву клінічних ознак загострення. Наприклад, підвищення активності аланінамінотрансферази передує збільшенню вмісту білірубіну, погіршенню самопочуття хворого. Це допомагає своєчасно розпізнати ускладнення і змінити терапевтичну тактику. Ферменти успішно використовують у клінічній практиці для оцінювання ефективності лікування, прогнозу захворювання. Відсутність зміни активності ферментів на тлі використання лікарських та інших методів лікування свідчить про низьку їх ефективність. Так, визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові достовірніше відображує ступінь репаративних процесів у печінці при гепатиті порівняно із вмістом білірубіну. Багато ферментів використовують у клініці для прогнозування перебігу захворювання. Наприклад, стійке зниження активності холінестерази при хронічному гепатиті свідчить про прогресування процесу й ускладнення захворювання. Різке зниження активності амінотрансфераз на тлі зростання вмісту білірубіну (ферментно-білірубінова дисоціація) свідчить про виснаження тканинних джерел ферментів за рахунок тяжкого ушкодження паренхіми печінки, що визначає відповідний прогноз. Перспективним для ферментодіагностики є дослідження ізоферментів. Доведено, що в разі ушкодження тканин ізоферменти надходять у кров та інші біологічні рідини і їхній ізоферментний спектр стає близьким до тканинного, що покладено в основу використання ізоферментів у діагностиці. Знаючи топографію ізоферментів у клітині, особливості їх тканинних і сироваткових спектрів, можна встановити локалізацію патологічного процесу. Дослідження ізоферментів має переваги перед визначенням загальної активності ферментів, оскільки їм властиві одночасно висока чутливість і специфічність. Ізоферментні спектри широко використовують для діагностики різних видів патології, насамперед у гепатології, кардіології, при захворюваннях нирок, підшлункової залози, легенів, скелетних м’язів, в онкології, гематології тощо. 14. Ензимотерапія – застосування ферментів, їх активаторів та інгібіторів в медицині. Ензимотерапія — використання ферментів як лікарських засобів проводиться переважно в разі нестачі в організмі якогось ферменту, коферменту або як допоміжний засіб при деяких захворюваннях. Засоби замісної терапії використовують досить давно. Передусім це ферменти шлункового соку (пепсин, абомін) та підшлункової залози (панкреатина також багатокомпонентні препарати, що містять у своєму складі ферменти, які чинять комплексний вплив на білки, жири, вуглеводи (фестал, панзинорм, дигестал, онотон, ктазим, комбіцин). їх застосовують для поліпшення функціонального стану травного каналу та нормалізації процесів травлення. Вобензим. Препарат є спеціально підібраною комбінацією ферментів з імуномодулювальним, протинабряковим і певною мірою фібринолітичним впливом. Він чинить загальнотерапевтичну дію при запальних процесах, обмежує патологічні прояви автоімунних продуктів обміну речовин і некротизованих тканин, розсмоктує гематоми, нормалізує проникність судинних стінок, густину крові й тим самим поліпшує мікроциркуляцію. Препарат застосовують для лікування синуситу, бронхіту, бронхопневмонії, панкреатиту, виразкового коліту, хвороби Крона, розсіяного склерозу, ІХС, ревматоїдного артриту Аспарагіназа виявляє антилейкемічну активність. Протипухлинний ефект зумовлений здатністю аспарагінази каталізувати гідроліз амінокислоти аспарагіну, необхідної лейкозним клітинам для їх розвитку: дефіцит аспарагіну впливає на клітинні мембрани, що істотно полегшує транспорт білків і поліпептидів крізь мембрани ракових клітин. Відомо, що клітини деяких злоякісних пухлин позбавлені здатності синтезувати аспарагін з інших сполук, оскільки в них відсутня аспарагінсинтетаза. Цитохром С — фермент, що бере участь у процесах тканинного дихання. Ферум, який міститься в його простетичній групі, зворотно переходить із окисненої форми у відновлену, у зв’язку з чим препарат прискорює перебіг окисних процесів. Препарат застосовують для поліпшення тканинного дихання при асфіксії новонароджених, астматичних станах, хронічній пневмонії, серцевій недостатності, ішемічній хворобі серця, інфекційному гепатиті, старечій дегенерації сітківки тощо. Велика група лікарських засобів належить до регуляторів активності ферментів, передусім до їх інгібіторів. Необхідність у них виникає досить часто, а саме: • у разі дефіциту фізіологічних інгібіторів, які виконують важливу для організму функцію — обмеження впливу ендогенних ферментів, а інколи — його захисту від ушкоджувальної дії чужорідних ферментів, зокрема мікробного походження;• під час введення з лікувальною метою ферментів у неадекватній дозі або в разі несприйняття введеного ферменту. Так, при передозуванні тромболітичних препаратів (фібринолізину), активаторів плазміну (стрептокінази, урокінази) застосовують інгібітори протеолізу (трасилол, амінокапронову кислоту тощо);• під час захворювань, у патогенезі яких певну роль відіграє гіперфункція ферментів, повязана з неадекватною їх активацією, аномальним викидом у кров ітканини(механічні, термічні й хімічні травми, інфекційна патологія, тромбози та емболії тощо);• під час змін ферментного спектра, при патологічному переважанні однієї ізоформи ферменту над іншою. У клінічній практиці з цією метою інгібітори широко використовують в онкології, оскільки пригнічення активності ферментів пухлинних клітин — один із відомих напрямів створення лікарських препаратів для терапії онкопатології;• у разі потреби викликати необхідну, найчастіше нефізіологічну, реакцію. На цьому принципі ґрунтується дія деяких регуляторів судинного тонусу (інгібіторів тих ферментів, які беруть участь в утворенні ангіотензину II або катехоламінів), активаторів метаболічних процесів у печінці, лікарських засобів, які пригнічують синтез простагландинів тощо.Інгібітори ферментів, потенційно придатні для застосування в терапії, досить поширені в природі, їх також можна отримувати шляхом синтезу. Більшість інгібіторів тваринного й рослинного походження, вивчені в експерименті чи клініці, є поліпептидами з молекулярною масою понад 5 000, тоді як мікробні інгібітори, як правило, мають невелику молекулярну масу. Інгібітори, виділені з рослин і мікроорганізмів, належать переважно до простих білків, а інгібітори тваринного походження часто містять у своєму складі вуглеводи. Наприклад, значна кількість інгібіторів протеаз тваринного походження є глікопротеїнами. Для деяких рослинних інгібіторів характерний низький уміст ароматичних амінокислот. Слід зазначити, що багато мікроорганізмів продукують хімічні сполуки, здатні впливати на ферментативні процеси в тканинах організмів тварин і людини. |