1. Ферменти визначення властивості ферментів як біологічних каталізаторів
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
15. Принципи та методи виявлення ферментів у біооб'єктах. Одиниці виміру активності та кількості ферментів. Оскільки кількість ферменту в біологічному об'єкті у більшості випадків визначити неможливо, для характеристики швидкості біохімічної реакції, що каталізується певним ферментом, за умов сталості інших показників середовища (фізико-хімічних параметрів, концентрації активаторів та інгібіторів) користуються значеннями активності ферменту. Активність ферменту - це умовна величина, що прямо пропорційна швидкості біохімічної реакції, яку каталізує певний фермент. Усвою чергу, як легко зрозуміти, швидкість ферментативної реакції можна визначити або за кількістю субстрату (S), що перетворився за певний проміжок часу, або за кількістю накопиченого за цей час продукту реакції (Р. У біохімічній практиці для кількісної характеристики реакцій, що каталізуються ферментами, використовують умовні величини - одиниці ферменту. Загальновживаними є такі одиниці ферменту 1. За одиницю ферменту U (unit, англ, що рекомендована Міжнародним біохімічним союзом (МБС), приймають таку його кількість, яка каталізуєперетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хвилину: 2. При використанні одиниць системи СІ (SI) активність ферменту виражають у каталах (кат. 1 Катал (кат) - така кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 с 3. Розповсюдженою одиницею є питома активність ферменту, яка визначається кількістю одиниць ферментної активності, що припадають на 1 мг білка в біологічному об'єкті (мг білка). У медичній ензимології активність ферменту часто виражають в одиницях (U) на 1 л досліджуваної біологічної рідини - сироватки крові, слини, сечі тощо (л. 1. Обмін речовин (метаболізм) - загальні закономірності протікання катаболічних та анаболічних процесів. Метаболізм , що є найбільш характерною ознакою та неодмінною умовою існування будь-якої біологічної системи, поділяється на анаболізм (асиміляцію, синтез) та катаболізм (дисиміляцію, розщеплення молекул. Катаболізм. Процеси катаболізму являють собою сукупність реакцій розщеплення хімічних сполук, що надходять в організм у вигляді продуктів харчування та містять чужорідні вуглеводи, ліпіди, білки тощо. Крім того, в будь-якій клітині постійно відбувається розщеплення власних біомолекул. Катаболізм є екзергонічним процесом, тобто таким, що призводить до вивільнення хімічної енергії, яка частково використовується організмом в ході анаболізму. Ця хімічна енергія звільняється в результаті реакцій окислення біомолекул - проміжних продуктів внутрішньоклітинного розщеплення моносахаридів: переважно глюкози, жирних кислот, гліцерину та деяких амінокислот. Основні реакції біологічного окислення, що вивільняють енергію, необхідну для процесів життєдіяльності, відбуваються в мітохондріях (саркосомах), у мембранах яких локалізовані також складні ферментні та йонтранспортуючі системи, які реалізують накопичення енергії окислювальних процесів у вигляді високоенергетичних (макроергічних) зв'язків АТФ. Анаболізм являє собою постійний синтез молекул та побудову структур власного організму з органічних сполук, що надходять з навколишнього середовища у вигляді продуктів харчування та продуктів їх перетворення (інтермедіатів). Процеси анаболізму є ендергонічними, тобто такими, що потребують витрат хімічної енергії, яка постачається за рахунок реакцій катаболізму, переважно у формі молекул АТФ. Таким чином, живі організми за термодинамічними закономірностями їх функціонування є не тепловими машинами, а хімічними машинами, тобто системами, в яких різні види роботи здійснюються за рахунок хімічної енергії молекул, до того ж при сталій температурі (у людини близько 37 С. При цьому джерелом хімічної енергії для ендергонічних процесів синтезу та побудови нових клітинних структур є екзергонічні реакції біологічного окислення, що відбуваються в електротранспортних ланцюгах мітохондрій та акумулюють цю енергію в ході окисного фосфорилування. 2. Спільні стадії внутрішньоклітинного катаболізму біомолекул: білків, вуглеводів, ліпідів. В катаболизме различают три стадии 1). Полимеры превращаются в мономеры (белки – в аминокислоты, углеводы в моносахариды, липиды – в глицерол и жирные кислоты. Химическая энергия при этом рассеивается в виде тепла. 2). Мономеры превращаются в общие продукты, в подавляющем большинстве в ацетил-КоА. Химическая энергия частично рассеивается в виде тепла, частично накапливается в виде восстановленных коферментных форм (НАДН, ФАДН 2 ), частично запасается в макроэргических связях АТФ (субстратное фосфорилирование. 1-ая и 2-ая стадии катаболизма относятся к специфическим путям, которые уникальны для метаболизма белков, липидов и углеводов. 3). Заключительный этап катаболизма, сводится к окислению ацетил-КоА до СО 2 и НО в реакциях цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса) – общий путь катаболизма. Выделенные атомы водовода соединяются с НАД и ФАД и восстанавливают их. После этого НАДН и ФАДН 2 переносят водород в цеп дыхательных ферментов, расположенную на внутренней мембране митохондрий. Окислительные реакции общего пути катаболизма сопряжены с цепью тканевого дыхания. При этом энергия (40-45%) запасается в виде АТФ (окислительное фосфорилирование. В результате специфических и общих путей катаболизма биополимеры (белки, углеводы, липиды) распадаются до СОН О и NH 3 , которые являются основными конечными продуктами катаболизма. 3. Цикл трикарбонових кислот. Локалізація, послідовність ферментативних реакцій, значення в обміні речовин. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК) - це загальний кінцевий шлях окислювального катаболізму клітини в аеробних умовах. Реакції і ферменти ЦТК локалізовані в матриксі та внутрішній мембрані мітохондрій. Вони функціонально та біохімічно спряжені з мітохондріальними електроно- транспортними ланцюгами, що використовують для відновлення атомів кисню відновлювальні еквіваленти від НАДН (НАДН 2 ) та ФАДН 2 або ФМНН 2 , і утворюють АТФ у ході окисного фосфорилування. Цикл начинается с взаимодействия молекулыацетил-СоА с четырехуглеродной дикарбоновой кислотой—щавелевоуксусной (оксалоацетатом), в результате образуется шестиуглеродная трикарбоноваякислота, называемая лимонной. Далее следует серияреакций, входе которых происходит высвобождениедвух молекул СО 2 и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество оксалоацетата, необходимое для превращения большого числа ацетильныхединиц в СО 2 весьма невелико, можно считать, чтооксалоацетат выполняет каталитическую роль. Цикл лимонной кислоты является механизмом,обеспечивающим улавливание большей части свободной энергии, освобождаемой в процессе окисления yглеводов, липидов и белков. В процессе окисления ацетил-СоА благодаря активности ряда специфических дегидрогеназ происходит образование восстановительных эквивалентов в форме водорода илиэлектронов. Последние поступают в дыхательнуюцепь; при функционировании этой цепи происходитокислительное фосфорилирование, те. синтезируется АТФ. 4. Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот. Фізіологічне значення реакцій ЦТК. Значение о6щих путей катаболизма в энерrетическом обмене. В результате окисления, катализируемого дегидрогеназами цикла лимонной кислоты, на каждую катаболизируемую за период одного цикла молекулу ацетил-СоА образуются три молекулы NADH и одна молекула FADH 2 . Эти восстановительные эквиваленты передаются вдыхательную цепь, локализованную во внутренней митохондриальной мембране. При прохождении по цепи восстановительные эквиваленты NADH генерируют три высокоэнергетические фосфатные связи посредством образования АТР изв процессе окислительного фосфорилирования. За счет FADH 2 генерируются только две высокоэнергетические фосфатные связи, поскольку FADH 2 переносит восстановительные эквиваленты на кофермент Q и, следовательно, в обход первого участка окислительного фосфорилирования вдыхательной цепи. Еще один высокоэнергетический фосфат генерируется на одном из участков цикла лимонной кислоты, те. на субстратном уровне, при превращении сукцинил-СоА в сукцинат (5 реакция. Таким образом, за период каждого цикла образуется 12 новых высокоэнергетических фосфатных связей. Реакції біологічного окислення; типи реакцій (дегідрогеназні, оксидазні, оксигеназні) та їх біологічне значення. Тканинне дихання. В настоящее время биологическое окисление определяется как совокупность реакций окисления органических веществ (субстратов, выполняющих функцию энергетического обеспечения потребностей организма. Окисление субстратов в биохимических системах сопровождается отщеплением электронов от субстратов (донор электронов, которые при участии промежуточных переносчиков передаются на кислород — конечный (терминальный) акцептор электронов у аэробных организмов. Транспорт высокоэнергетических электронов восстановленных субстратов происходит в сложной системе, состоящей из окислительно-восстановительных ферментов и коферментов, локализованных во внутренней мембране митохондрии. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, называют оксндоредуктазами. Оксидазы. Истинные оксидазы катализируютудаление водорода из субстрата, используя при этомв качестве акцептора водорода только кислород.Они неизменно содержат медь, продуктом реакцииявляется вода (исключение составляют реакции, катализируемые уриказой и моноаминоксидазой, в результате которых образуется НО. Аэробные дегидрогеназы—ферменты, катализирующие удаление водорода из субстрата в отличие от оксидаз они могут использовать в качестве акцептора водорода не только кислородно и искусственные акцепторы, такие, как метиленовый синий.Эти дегидрогеназы относятся к флавопротеинам,и продуктом катализируемой ими реакции являетсяперекись водорода, а невода. Анаэробные дегидрогеназы—ферменты, катализирующие удаление водорода из субстрата, но неспособные использовать кислород в качестве акцептора водорода. В этот класс входит большое числоферментов. Они выполняют две главные функции. а Перенос водорода с одного субстрата на другой в сопряженной окислительно-восстановительной реакции. Эти дегидрогеназы специфичны к субстратам, но часто используют один и тот же кофермент или переносчик водорода. Поскольку рассматриваемые реакции обратимы, они обеспечивают в клетке свободный перенос восстановительных эквивалентов. Реакции этого типа, приводящие к окислению одного субстрата за счет восстановления другого, особенно важны для осуществления окислительных процессов в отсутствие кислорода. б Функцию компонентов дыхательной цепи, обеспечивающих транспорт электронов от субстрата на кислород. 4) Оксигеназы — ферменты, катализирующие прямое введение кислорода в молекулу субстрата. Окислительным фосфорилированием называют сопряжение двух клеточных процессов экзергонической реакции окисления восстановленных молекул (НАДН + Н или ФАДН 2 ) и эндергонической реакции фосфорилирования АДФ и образования АТФ. 2. Ферменти біологічного окислення в мітохондріях: піридин-, флавін-залежні дегідрогенази, цитохроми. 1. Дегідрогенази, залежні від нікотинамідних коферментів (НАД(Ф)-залежні дегідрогенази). Коферментами цих дегідрогеназ є нуклеотиди НАД або НАДФ, у структурі молекул яких міститься похідна піридину - нікотинамід. Зв'язок між НАД (або НАДФ) та білковою частиною ферменту (апоферментом) у складі піридинзалежних дегідрогеназ нестійкий: він утворюється та руйнується в процесі каталітичного циклу, що дозволяє вважати нікотинамідні нуклеотиди скоріше субстратами, ніж простетичними групами. Активною структурою в молекулі НАД або НАДФ, що акцептує відновлювальні еквіваленти від субстрату, є піридинове кільце никотинаміду. У ході ферментативної реакції субстрат відщеплює два атоми водню (Не, один з яких у формі гідридіона: Н - (тобто Не) приєднується до піридинового кільця НАД(Ф), а другий у вигляді протона (іона Н) надходить у реакційне середовище. Як свідчить наведене рівняння, під час реакції до четвертого вуглецевого атома нікотинаміду приєднується атом водню (тобто Не, а додатковий електрон гідридіона взаємодіє з азотом піридинового кільця. Дегідрогенази, залежні від нікотинамідних коферментів, дуже поширені в живих клітинах. Вони виконують функції анаеробних дегідрогеназ, що відщеплюють протони та електрони від багатьох субстратів, відновлюючи НАД або НАДФ, які передають в подальшому відновлювальні еквіваленти на інші акцептори. НАД-залежні дегідрогенази - ці ферменти каталізують окислювально-відновлювальні реакції, що містяться на окислювальних шляхах метаболізму - гліколізу, циклу лимонної кислоти, β-окислення жирних кислот, окисного дезамінування амінокислот, дихального ланцюга мітохондрій. НАДФ-залежні дегідрогенази - ці ферменти беруть участь у процесах відновлювального синтезу, що відбуваються в цитозолі, зокрема постачають атоми водню при синтезі жирних кислот та стероїдів. Головним джерелом відновленого НАДФ є дегідрогеназні реакції пентозофосфатного шляху окислення глюкози. 2. Флавінзалежні дегідрогенази Дегідрогенази цього типу за хімічною природою є флавопротеїнами, простетичними групами в яких є флавінаденіндинуклеотид (ФАД) та флавінмононуклеотид (ФАД). На відміну від піридинзалежних дегідрогеназ, у більшості флавінзалежних ферментів коферменти (ФАД та ФМН) міцно зв'язані з білковою частиною і не відщеплюються від неї на жодній стадії каталітичного циклу. Виключенням є ФАД-залежна оксидаза D-амінокислот, у складі якої білок має низьку спорідненість із коферментом. Активною частиною молекули ФАД або ФМН, що бере участь в окислювально-відновлювальній реакції, є ізоалоксазинове кільце рибофлавіну, яке акцептує два атоми водню (Не) від субстрату. Цитохроми - залізовмісні білки мітохондрій, що належать до класу гемопротеїнів. У цитохромах іон заліза входить до складу металопорфіринового комплексу (гемінове залізо), близького за хімічною структурою до простетичних груп гемоглобіну та міоглобіну. За рахунок оберненої зміни валентності гемінового заліза цитохроми виконують функцію транспорту електронів у ланцюгах біологічного окислення в аеробних клітинах Залежно від характерних особливостей спектрів поглинання, розрізняють три класи цитохромів (ас. У мітохондріях еукаріотів наявні пять різновидів цитохромів - b, с, с, а, а в ендоплазматичному ретикулумі гепатоцитів містяться цитохроми Рта що беруть участь у реакціях окислювального гідроксилування. 3. Послідовність компонентів дихального ланцюга мітохондрій. Молекулярні комплекси внутрішніх мембран мітохондрій. Дихальний ланцюг мітохондрій - сукупність молекулярних компонентів (ферментів, коферментів, додаткових електроно-транспортних білків), що здійснюють дегідрування органічних субстратів та послідовний перенос відновлювальних еквівалентів (протонів та електронів) на кисень через ряд проміжних переносників - транспортерів протонів та електронів. Окремі білки та небілкові переносники відновлювальних еквівалентів, які складають дихальний (електроно-транспортний) ланцюг, структурно об'єднані між собою в надмолекулярні мультиензимні комплекси, вбудовані в ліпідний матрикс внутрішніх мітохондріальних мембран, що створює стеричні умови, необхідні для ефективного перебігу окислювально-відновлювальних реакцій.До складу дихального (електроно-транспортного) ланцюга мітохондрій входять чотири білкові комплекси (комплекси І, II, III та IV), що функціонують як переносники протонів та електронів. До складу комплексів входять також залізо-сіркові білки, що містять іони негемового заліза (у вигляді FeS), асоційовані з флавопротеїнами або цитохромом b. Крім білкових комплексів, у функціонуванні електроно-транспортних ланцюгів беруть участь два рухомі переносники - убіхінон (коензим Q) та цитохром с . Комплекс І (НАДН-дегідрогеназа; НАДН: убіхінон - редуктаза; НАДН: коензим Q - редуктаза). Це - ферментний комплекс, що містить ФМН як первинний акцептор електронів від НАДН і передає відновлювальні еквіваленти на убіхінон; до складу комплексу, як проміжні транспортери електронів, входять також FeS-білки. Комплекс II (сукцинатдегідрогеназа; сукцинат: убіхінон (коензимQ) -редуктаза). Комплекс являє собою флавопротеїн ФАД-залежну сукцинат-дегідрогеназу, асоційовану з FeS-білками, що окислює сукцинат, відновлюючи коензим Q. Коензим Q (убіхінон) - ліпідорозчинний хінон з ізопреноїдним бічним ланцюгом, що містить у тканинах ссавців десять п'ятивуглецевих ізопреноїдних залишків (Q10). Убіхінон виконує функцію колектора відновлювальних еквівалентів, акцептуючи протони та електрони не тільки від ФМН-залежної НАДН-дегідрогенази, а й від ФАД-залежних дегідрогеназ мітохондрій (сукцинатдегідрогенази, ацилдегідрогеназ системи (β-окислення жирних кислот, дегідрогенази гліцерол-3-фосфату тощо) Комплекс III (убіхінон: цитохром с -оксидоредуктаза; убіхінолдегідрогеназа; цитохром с-редуктаза). До складу комплексу входять цитохроми ста FeS-білок. Відновлена форма коензиму Q (QH 2 ) за допомогою комплексу III передає на цитохром с - подальший компонент дихального ланцюга лише електрони, а протони, що відщеплюються від QH 2 , вивільняються у мітохондріальний матрикс:Ці вільні протони будуть в подальшому використані для утворення води. Цитохром с - водорозчинний білок з молекулярною масою 12,5 кДа, що переносить електрони між комплексами III та IV дихального ланцюга. За хімічною природою цитохром с є гемвмісним хромопротеїном (гемопротеїном), у складі якого міститься один поліпептидний ланцюг, ковалентно сполучений із залізопорфірином через залишки цистеїнів. Подібно до інших цитохромів, гемова група цитохрому с здатна до транспорту електронів шляхом приєднання та відщеплення одного електрона з поперемінним переходом окисної форми заліза [Fe(III)] в закисну [Fe(II)]:. Комплекс IV - ферментний комплекс, що складається з цитохромів а та а 3 (цитохромоксидаза); містить два іони міді змінної валентності (Сu + - Сu 2+ ). Цитохромоксидаза каталізує кінцеву стадію біологічного окислення - відновлення електронами молекулярного кисню за рівнянням:Взаємодія відновленого кисню з вільними протонами мітохондріального матриксу призводить до утворення молекули води |