1. Ферменти визначення властивості ферментів як біологічних каталізаторів
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
4. Окисне фосфорилювання: пункти спряження транспорту електронів та фосфорилювання, коефіцієнт окисного фосфорилювання. Значення коефіцієнта окисного фосфорилування при окисленні різних субстратів у мітохондріях Субстрат Коефіцієнт Ф н /О (АТФ/О) α-Кетоглутарат 3 Ізоцитрат 3 Малат 3 L-Глутамат 3 Сукцинат 2 Ацил-КоА 2 Синтез однієї молекули АТФ з АДФ та Фн потребує витрат хімічної енергії, що дорівнюють + 7,3 ккал (+ 30,5 кДж. Очевидно, що енергії, яка вивільняється за умов транспорту електронів у дихальному ланцюгу мітохондрій, достатньо для синтезу декількох молекул АТФ. Безпосередніми біохімічними дослідженнями доведено, що за умов окислення субстратів через НАДН: коензим Q-редуктазу утворюється 3 молекули АТФ, при дії сукцинат: коензим Q-редуктази - 2 молекули АТФ. Коефіцієнт окисного фосфорилування — відношення кількості зв'язаного (етерифікованого) неорганічного фосфату (моль) до кількості поглинутого мітохондріями кисню (моль) (позначається як Фн (Р) - кількісно дорівнює числу молекул АТФ, що утворюються при перенесенні двох відновлювальних еквівалентів на один атом кисню, тобто АТФ/О – таблиці. Пункти спряження транспорту електронів та окисного фосфорилування Утворення АТФ з АДФ та Ф н може відбуватися тільки в певних ділянках електронотранспортного ланцюга мітохондрій, в яких величина хімічної енергії, що виділяється при транспортуванні пари електронів між двома редокс-системами (компонентами дихального ланцюга), достатня для синтезу 1 молекули АТФ (тобто > 7,3 ккал, або 30,5 кДж. Ділянки дихального ланцюга мітохондрій, де вивільнення хімічної енергії достатнє для синтезу молекули АТФ Комплекс І (НАДН → коензим Q) 12,2 ккал 51,0 кДж Комплекс III (цитохром b → цитохром с) 9,9 ккал 41,4 кДж Комплекс IV цитохрома О) 23,8 ккал 99,6 кДж Зазначені ділянки електронотранспортного ланцюга називаються пунктами спряження дихання (електронного транспорту) з окисним фосфоритуванням. 5. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилювання, АТФ-синтетаза мітохондрій. Хеміосмотична теорія передбачає, що : 1. Функціонування дихального (електронотранспортного) ланцюга у внутрішніх (спрягаючих) мембранах мітохондрій супроводжується генерацією на цих мембранах електрохімічного градієнта протонів (Н. 2. Окремі компоненти електронотранспортного ланцюга діють як протонні помпи, що спричиняють векторний (перпендикулярний площині мембрани) транспорт протонів, спрямований у напрямку "матрикс → зовнішня поверхня мембрани" Спроможність мітохондріальних переносників електронів до транслокації протонів через мембрану зумовлюється особливостями їх внутрішньомембранної топографії. Вважають, що дихальний ланцюг укладений у спрягаючій мембрані у вигляді трьох окислювально-відновлювальних "петель, що відповідають трьом комплексам переносу електронів - І, III та IV і транспортують два іони Н з матриксу в зовнішнє середовище. 3. Електрохімічний потенціал протонів на спрягаючих мембранах, який створюється завдяки дії протонних помп дихального ланцюга, є рушійною силою синтезу АТФ з АДФ та Фн. 4. Існує ферментна система, що використовує енергію електрохімічного протонного потенціалу для синтезу АТФ за рахунок зворотної транслокації протонів через мітохондріальну мембрану в напрямку "зовнішня поверхня → матрикс. Ця ферментна система, яка замикає протонний цикл на спрягаючих мембранах мітохондрій - протонна АТФаза, або АТФ-синтетаза. АТФ-синтетаза є білком з четвертинною структурою, що складається з декількох білкових субодиниць, які утворюють компоненти F 0 та F 1 5. Будь-які фізичні, хімічні та біологічні фактори, що пошкоджують цілісність спрягаючих мембран мітохондрій та розсіюють енергію електрохімічного градієнта, порушують синтез АТФ, тобто виступають як роз'єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилування. Таким чином, згідно з хеміосмотичною теорією, спряження між переносом електронів в дихальному ланцюгу та синтезом АТФ здійснюється за рахунок утворення при функціонуванні протонних помп градієнта концентрації Н + між двома поверхнями мітохондріальної мембрани. АТФ-синтетаза, транспортуючи протони у зворотному напрямку (за електрохімічним градієнтом) призводить до вивільнення хімічної енергії, за рахунок якої утворюються макроергічні зв'язки АТФ. 6. Інгібітори транспорту електронів та роз’єднувачі окисного фосфорилювання. Певні хімічні сполуки здатні специфічним чином порушувати електронний транспорт (інгібітори електронного транспорту) та окисне фосфорилування (інгібітори та роз'єднувачі окисного фосфорилування) в мітохондріях. Дані сполуки взаємодіють з певними компонентами дихального ланцюга або системи окисного фосфорилування, порушуючи їх біохімічні функції. Інгібітори електронного транспорту Сполуки цього класу порушують функціонування дихального ланцюга мітохондрій за рахунок зв'язування з окремими ферментними білками або коферментами, що беруть безпосередню участь у переносі електронів від субстратів біологічного окислення на O 2 . При надходженні в організм людини або тварин ці речовини діють як клітинні отрути, спричиняючи феномен тканинної гіпоксії. Ротенон - інгібітор транспорту електронів через НАДН:коензим Q-редуктазний комплекс. Ротенон застосовується як інсектицид. Амобарбітал (амітал) та близький до нього за структурою секобарбітал (секонал). Ці похідні барбітурової кислоти (барбітурати) застосовуються у фармакології як снодійні засоби. Разом з тим, барбітурати, подібно до ротенону, є активними інгібіторами клітинного дихання, блокуючи електронний транспорт на рівні НАДН:коензим Q-редуктази. Пієрицидин А - антибіотик, що також блокує НАДН:коензим Q-редуктазний комплекс за рахунок конкурентної взаємодії з убіхіноном. Антиміцин А - антибіотик, що блокує дихальний ланцюг мітохондрій на рівні переносу електронів через комплекс цитохром b - цитохром с 1 ). Ціаніди (іони CN - ) - потужні клітинні отрути, що є інгібіторами транспорту електронів на термінальній ділянці дихального ланцюга мітохондрій (у цитохромоксидазному комплексі). Іони CN - утворюють комплекси з фери (Fе 3+ )-формою молекул гему цитохромоксидази, блокуючи їх відновлення до феро (Fе 2+ )-форм. Монооксид вуглецю (CO) - інгібує цитохромоксидазу шляхом зв'язування з ділянкою гема, що взаємодіє з молекулою кисню. Інгібітори окисного фосфорилування Інгібітори окисного фосфорилування блокують як окислення субстратів, так і фосфорилування АДФ у мітохондріях. Олігоміцин - антибіотик, що протидіє як фосфорилюванню АДФ до АТФ, так і стимуляції поглинання O 2 , що спостерігається після додавання до мітохондрій АДФ (феномен "дихального контролю. Механізм дії олігоміцину полягає в інгібуванні функції АТФ-синтетази. Роз'єднувачі окисного фосфорилування Сполуки цього класу спричиняють "неконтрольоване" дихання мітохондрій, яке не залежить від функціонування системи фосфорилування АДФ. В присутності роз'єднувачів спостерігається активне поглинання мітохондріями О, незважаючи на зниження швидкості (або відсутність) генерації АТФ з АДФ та Фн. Згідно з хеміосмотичною теорією, роз'єднувачі спричиняють втрату мембраною протонного потенціалу - рушійної сили генерації макроергічних зв'язків АТФ. До роз'єднувачів окисного фосфорилування належать: - 2,4-динітрофенол та сполуки, близькі до нього за хімічною структурою (динітрокрезол, пентахлорфенол); - карбонілціанід-м-хлорфенілгідразон - сполука, що в 100 разів перевищує за специфічною активністю 2,4-динітрофенол. Здатність роз'єднувати дихання та окисне фосфорилування в мітохондріях мають також гормони щитовидної залози (тироксин, трийодтиронін).Порушення синтезу АТФ спостерігається в умовах дії на організм людини і тварин багатьох патогенних факторів хімічного (природні та синтетичні токсини), біологічного та фізичного (іонізуюча радіація) походження, які спричиняють роз'єднання дихання та окисного фосфорилування за рахунок порушення спроможності створювати і підтримувати протонний потенціал на спрягаючих мембранах мітохондрій. 8. Мікросомальне окислення: цитохром Р молекулярна організація ланцюга переносу електронів. У мембранах ендоплазматичного ретикулуму печінки, в мітохондріях і мікросомах кори надниркових, статевих залоз та інших тканин локалізовані ферментні системи, які каталізують монооксигеназні реакції, коли один атом молекули кисню включається в субстрата другий – у молекулу води. Оскільки найчастіше субстрату монооксигеназних реакціях гідроксилюється, цю групу ферментів називають також гідроксилазами. Донором воднів для утворення Н 2 О замість НАДФН може бути НАДН, ФМНН 2 , ФАДН 2 Головний компонент монооксигеназ – цитохром Р – названий так тому, що комплекс його відновленої форми з монооксидом вуглецю (II) має максимум поглинання світла при 450 нм. Цитохром Р містить протогем і подібний до цитохромів групи b. Буква Р в цитохромі Р походить від американського міста Philadelphia, де він вперше був відкритий. Існує велика кількість ізоформ цитохрому Р. Оскільки в процесі один із атомів молекули кисню включається в молекулу води, а другий - в молекулу субстрату, що гідроксилюється, ферментні системи, які каталізують ці реакції, отримали також назву "мікросомальних оксигеназ мішаної функції'' Ферментні системи, що каталізують реакції мікросомального окислення гідрофобних речовин, являють собою електронотранспортні ланцюги, локалізовані в мембранах ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів та клітин деяких інших органів тварин та людини, що також беруть участь у реакціях детоксикації (кишечник, легені, шкіра, плацента тощо). Компонентами цих ферментних ланцюгів є ФАД-вмісний флавопротеїн, цитохром та кінцева монооксигеназа - цитохром Р-450: Подібний цитохром Р-450-залежний електронотранспортний ланцюг каталізує реакції окислювального гідроксилування стероїдів (синтезу та біотрансформації), що відбуваються в мітохондріях кори наднирників та статевих залоз. 2. Анаеробне окислення глюкози. Послідовність реакцій та ферменти гліколізу. За умов анаеробного гліколізу (наприклад, в інтенсивно працюючих скелетних м`язах або в молочнокислих бактеріях) гліколі-тичний НАДН не віддає свої відновлювальні еквіваленти в дихальний ланцюг мітохондрій, а використовується для відновлення пірувату до лактату Реакція каталізується ферментом лактатдегідрогеназою, яка існує у вигляді пяти різних ізоферментних форм (ЛДГ1—ЛДГ5), що відрізняються за своїми кінетичними властивостями (КМ, мах, ступенем алостеричного інгібірування піруватом). Таким чином, ферментативні реакції анаеробного гліколізу майже повністю спів¬падають із реакціями аеробного гліколізу, відрізняючись лишена етапі, що відбувається після утворення пірувату: при аеробному гліколізі піруват є субстратом перетворення на ацетилкоензим А та подальшого окислення, а при анаеробному гліколізі піруват відновлюється до лактату за рахунок НАДН, що утворився в реакціях гліколітичної оксидоредукції. Інакше кажучи, після утво¬рення пірувату подальше його перетворення може відбуватися за одним із двох альтер¬нативних шляхів, що залежать від стану окислювально-відновлювальних процесів у певній тканині: - в анаеробнихумовах (або в умовах гіпоксії) реокислення гліколітичного НАДН відбува¬ється за рахунок дії лактатдегідрогенази, яка відновлює піруват до лактату течія лактат-дегідрогеназної реакції в даному напрямку генерує НАД, що знову використовується для окислення гліцеральдегід-3-фосфату і подальшого накопичення лактату як продукту анаеробного гліколізу. Така послідовністьреакцій найбільш характерна для інтенсивно працюючихскелетних м`язів; крім скелетних м`язів та еритроцитів, клітини деяких інших органів та тканин (головного мозку, шлунково-кишкового тракту, мозкового шару нирок, сітківки та шкіри) частково задовольняють свої енергетичні потреби за рахунок анаеробного гліколізу, утворюючи молочну кислоту. 3. Аеробне окислення глюкози. Етапи перетворення глюкози до СО і НО. Длябільшостітканинлюдинитавищихтваринвумовахнормальноїжиттєдіяльностіхарактернийаеробнийгліколіз, тобтоутвореннязглюкозипірувату, якийуподальшомуокислюєтьсядовуглекислогогазуйводи. Анаеробний гліколіз має місце переважно в м`язах при інтенсивній фізичній діяльності, тобто при відносній кисневій недостатності, та в деяких високоспеціалізованих клітинах (зокрема, в еритроцитах, в яких відсутні мітохондрії) або за певних патологічних умов (клітини злоякісних пухлин).Реакції гліколізу перебігаютьу цитозолі клітини і каталізуються ферментами, що локалізовані в цьому компартменті.Виділяють дві стадії гліколізу: 1. Розщеплення молекули глюкози до двох молекул фосфотріоз (гліцеральдегід-3-фосфату та діоксіацетонфосфату). Ця стадія включає в себе послідовність реакцій, які потребують витрати двох молекул АТФ на кожну молекулу глюкози, що розщеплюється. 2. Перетворення двох молекул фосфотріоз на дві молекули пірувату (або лактату. Ця стадія включає в себе окислювально-відновлювальні реакції ("гліколі-тична оксидоредукція"), які супроводжуються генерацією чотирьох молекул АТР. Таким чином, у результаті розщеплення однієї молекули глюкози в реакціях аеробного або анаеробного гліколізу сумарний вихід АТР складає дві молекули, що можна подати таким рівнянням:D-глюкоза + 2 АДФ + 2 Фн ? 2 піруват (лактат) + 2 АТФ 4. Окислювальне декарбоксилювання пірувату. Ферменти, коферменти та послідовність реакцій в мультиферментному комплексі. Окислювальнедекарбоксилюванняпіруватукаталізується піруватдегідрогеназнимкомплексом — мультиферментноюсистемою, якавклітинахеукаріотівміститьсявмембранахмітохондрій, аупрокаріотів — уцитоплазмі. До складу цього комплексу входять три ферменти, що каталізують три послідовні стадії перетворення пірувату на ацетил-КоА: • піруватдегідрогеназу [КФ 1.2.4.1];• дигідроліпоїлацетилтрансферазу [КФ 2.3.1.12];• дигідроліпоїлдегідрогеназу [КФ 1.8.1.4] і пять коферментів і простетичних груп: • тіаміндифосфат (ТДФ, або ТПФ);• ліпоєву кислоту(ЛК);• КоА;• ФАД;• НАД+ У результаті цього процесу утворюється ацетилкоензим А — основний субстрат окислення в циклі трикарбонових кислот — та відновлена форма НАД + .Сумарне рівняння окислювального декарбоксилювання пірувату: CH-CO-COOH + НАД+ + КоА-SH -> CH-CO-КоА + НАДН + НС Ферментативні стадії утворення ацетил-КоА з пірувату : Стадія I (декарбоксилювання) — каталізується піруватдегідрогеназою (Е, коферментом якої є ТДФ. На цій стадії відбувається взаємодія пірувату з С тіазольного кільця молекули тіаміну; в результаті реакції утворюється зв’язаний із ферментом гідроксиетильний похідний тіаміндифосфату: Стадія II — каталізується центральним ферментом комплексу дигідроліпоїлацетилтрансферазою (E2), яка переносить гідроксиетильну групу від ТДФ(Е1) на простетичну групу ферменту E2, що є окисленою формою ліпоєвої кислоти (ЛК); в результаті реакції утворюється ацетилтіоефір відновлених ліпоїльних груп ферменту E2, що містить макроергічний зв’язок: Стадія ІІІ — дигідроліпоїлацетилтрансфераза переносить ацетильну групу від відновленої ліпоєвої кислоти на коензим А Стадія IV — окислення відновленої форми ферменту Е ФАД-залежною дигідроліпоїлдегідрогеназою (E3): Стадія V — перенесення атомів водню від відновленої ФАД-групи дигідроліпоїлдегідрогенази на НАД+ з утворенням НАДН: Відновлений НАДН, що утворюється в результаті окислювального декарбоксилювання пірувату, в аеробних умовах окислюється в мітохондріальному електронотранспортному ланцюзі з генерацією шести (2x3) молекул АТФ. Біологічна роль окиснювального декарбоксилювання пірувату полягає: 1) в катаболізмі пірувату до одного з кінцевих продуктів - С (виводиться з організму або використовується для синтезу, 2) в утворенні макроергічної сполуки - ацетил-Ко А (піддається подальшому окисненню в циклі трикарбонових кислот або використовується в реакціях анаболізму); 3) в синтезі відновленого еквіваленту - НАДН, який окиснюється в дихальному ланцюгу мітохондрій. Реакції окиснювального декарбоксилювання пірувату регулюються в організмі на рівні піруватдегідрогенази: 1) алостерично (надлишок продуктів реакції ацетил-КоА НАДН інгібує фермента проміжний продукт гліколізу фруктозо-1,6-дифосфат, НАД, КоА - є активаторами піруватдегідрогенази); 2) шляхом хімічної модифікації - фосфорилування. Фосфорильована форма піруватдегідрогенази є неактивною, а дефосфорильована — активна. Тому інсулін підвищує активність комплексу, а глюкагон, адреналін (діють за аденілатциклазним каскадом) гальмують активність ферменту.Окислювальне декарбоксилювання пірувату – єдиний шлях його катаболізму, тому недостатність вітамінів (у перше чергу вітаміну В) призводить до порушення процесу, зниження утворення АТФ і проявляється порушенням діяльності ЦНС. Піруватдегідрогеназна недостатність в організмі призводить до підвищення концентрації лактату, пірувату, аланіну, що супроводжується ацидозом. Гліколітична оксидоредукція: субстратне фосфорилювання та човникові механізми окислення гліколітичного НАДН. в аеробних умовах відбувається окисне декарбоксилювання пірувату доацетил-КоА, який у подальшому окислюється до СО, та НО в циклі Кребса; НАДН, що утворився при окисленні гліцеральдегід-3-фосфату, віддає свої відновлювальні еквіваленти на дихальний ланцюг мітохондрій через спеціальні човникові механізми; - в анаеробнихумовах (або в умовах гіпоксії) реокислення гліколітичного НАДН відбува¬ється за рахунок дії лактатдегідрогенази, яка відновлює піруват до лактату течія лактат-дегідрогеназної реакції в даному напрямку генерує НАД, що знову використовується для окислення гліцеральдегід-3-фосфату і подальшого накопичення лактату як продукту анаеробного гліколізу. Така послідовністьреакцій найбільш характерна для інтенсивно працюючихскелетних м'язів; крім скелетних м'язів та еритроцитів, клітини деяких інших органів та тканин (головного мозку, шлунково-кишкового тракту, мозкового шару нирок, сітківки та шкіри) частково задовольняють свої енергетичні потреби за рахунок анаероб¬ного гліколізу, утворюючи молочну килоту. Човникові механізми. Суть процесу полягає в тому, що НАДН, який утворюється в цитозолі не може самостійно прникнути в мітохондрії для окислення, тому він відновлює у цтиозолі певну речовину, яка йде в мітохондрії і там окислюється (замість НАДН), відновлюючи внутрішньомітохондріальний НАД, і знову повертається в цитозоль; цикл повторюється. Малат-аспартатна човникова система. У цитозолі відновлюється оксалоацетат до малату. Малат іде в мітохондрії і там окислюється знову до оксалоацетату, відновлюючи НАД. |