1. Использование спор микроорганизмов для биотрансформации органических соединений. Достоинства и недостатки по сравнению с использованием клеток микроорганизмов

• Название: 1. Использование спор микроорганизмов для биотрансформации органических соединений. Достоинства и недостатки по сравнению с использованием клеток микроорганизмов
• Дата: 06.06.2020
• Размер: 54.78 Kb.
• Имя файла: Samokhvalova_A_D_-3.docx
• Тип: Документы; #128548

Самохвалова А.Д.472

Вариант №10

Последниие правки выделены зеленым цветом

1.Использование спор микроорганизмов для биотрансформации органических соединений. Достоинства и недостатки по сравнению с использованием клеток микроорганизмов

Ответ принят

Микробная трансформация — естественное свойство микроорганизмов, широко распространенное в природе. Это свойство используется человеком в практической деятельности для получения ценных продуктов. Таким образом, микроорганизмы могут выполнять роль химических реагентов в органической химии. Поэтому микробную трансформацию, когда она используется в этих целях, называют ферментативной, микробиологической химией. Действительно, цели и подходы микробной трансформации близки целям и методам органической химии.

Что такое бактериальная спора? Чем она отличается от нативной клетки? Почему споры удобно использовать в процессах биотрансформации?
Для того, чтобы изучить вопросы биотрансформации, необходимо разораться с терминами.

Споры бактерий — тельца круглой или овальной формы, которые образуются внутри некоторых бактерий в определенные стадии их существования или при ухудшении условий окружающей среды.В отличии от нативных клеток спора- многоклеточное образование,а не одноклеточное,менее долговечна, питается автотрофно и имеет более плотную оболочку чем бактери .

Трансформация органических веществ спорами имеет ряд преимуществ. Эти  процессы  обычно  осуществляются  в  простых средах — дистиллированной или водопроводной воде, буферных растворах. Иногда для  этого требуются добавки  органических веществ в небольших концентрациях. Споры активны после длительного  хранения   (до  трех  лет  в  замороженном   состоянии). Если процесс трансформации идет в бедной среде,  то  споры  могут быть отмыты и использованы еще 4-5 раз.  Оптимум рН обычно выражен менее четко, чем у вегетативных клеток. Это позволяет использовать условия, предотвращающие заражение посторонними  микроорганизмами.  Подобные  наблюдения  стимулировали попытки   применения   трансформации с   использованием   спор   в промышленных  масштабах.  Такая  возможность  продемонстрирована      на   следующих процессах: 11а-гидроксилирования  прогестерона и   кортексолона спорами     Aspergillusochraceus; 1-дегидрогенизации   кортексолона   спорами   Septomyxaaffinis; 1la-гидроксилирования  6а-16а-,   17а-диоксипрегн-4-ендиона в нестерильном 200-литровом ферменте. В последние годы  осуществлен  гидролиз  феноксиметилпенициллина  спорами Fusariumsp. Конидии AspergilluscandidusNRRL305 синтезировали,манитиз глюкозы с 75%-ным выходом. Появились работы по иммобилизации спор в  полиакриламидный  гель,  что  дает  возможность  применения  непрерывно действующих  колонок. 

Таким образом,были  осуществлены  гидролиз сахарозы и многочисленные трансформации стероидов. Преимущество   непрерывного   культивирования   по   сравнению с периодическим  при  получении  биомассы  клеток  стимулировали      его   применение   для   синтеза   микробных   метаболитов. Процессы   получения   продуктов,      непосредственно      связанные      с  ростом  микроорганизмов,  в условиях  непрерывного  культивирования  осуществляются  сравнительно легко.  Образование  микробных  метаболитов,  не  связанное  с  ростом, потребовало  больших  усилий  для  реализации  процессов  непрерывным методом, и хотя многие из них осуществлены в лаборатории, внедрение этого метода   в   практику   сопряжено   с   рядом   затруднений.   Одним   из недостатков  непрерывного  метода,  имеющим  существенное  значение, является  то,  что  в  периодической  культуре  легче  получить  максимальный выход продукта на единицу субстрата, в то время как в проточной культуре часть  субстрата  обычно  не  превращается.    Однако  более  детальное  и   углубленное  исследование непрерывной трансформации сорбита в сорбозу культурой Acetobactersuboxydans, прогестерона  в 11α-оксипрогестерон культурой  Aspergillusochraceus, прегнандиена в прегнатриен  с помощью Septomyxaaffinisи  т.д. наглядно  продемонстрировали  рентабельность и преимущества этого метода. Непрерывные   методы   микробной   трансформации   получили интенсивное  развитие  благодаря  разработке  метода  иммобилизации  спор, клеток и ферментов.

2. Преимущества использования иммобилизованных биокатализаторов (ферменты, клетки) перед неиммобилизованными. Сопоставить достоинства и недостатки использования иммобилизованных ферментов и клеток.

Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. Для иммобилизации клеток используется множество способов (сорбция инертными и ионообменными носителями, ковалентное связывание с полимерным носителем, включение в гель) и носителей разных типов (природные и синтетические полимеры и неорганические вещества). Включение живых клеток требует мягких условий иммобилизации, носитель при этом должен представлять собой систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена. Следует принимать во внимание и возможное вредное влияние на жизнеспособность клеток сшивающих агентов. Наибольшее распространение получило включение клеток в полиакриламидный гель и гель альгината кальция.

На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы:

· адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (матрикса);

· включение в поры геля;

· пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;

· введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.

В чем заключается химическая иммобилизация?

Химическая  иммобилизация ферментов.

Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

Этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность —СН2—NH—(СН2)5—СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями.

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента участвовали функциональные группы, не существенные для его каталитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента.

Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента:

1.Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо-группами. Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциановый метод.

При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов.

2.Иммобилизация ферментов носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азооединения, в составе которых белок связан с носителями

3.Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот.

4.Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрилъными группами. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха

Иммобилизация путем химического присоединения биокатализатора к носителю отличается высокой эффективностью и прочностью связи. Несмотря на это, методы ковалентной иммобилизации ферментов все еще малодоступны для промышленного использования в связи со сложностью и дороговизной их применения.
преимуществами иммобилизованных ферментов:

1) могут быть отделены от продукта и использованы повторно, что снижает стоимость процесса+получение конечного продукта, не загрязненного ферментом
2) характеризуются повышенной стабильностью и длительным со-хранением активности;

3) возможность остановки реакции в любой нужный момент; пригодны для непрерывных процессов, которые, в свою очередь, облегчают контроль за качеством и снижают стоимость труда;

4) время реакции может быть уменьшено за счет создания более вы-сокого соотношения ферментов и субстратов;

5) возможностью создания мультиферментных систем.
Однако применение ферментов ограничено из-за их низкой стабильности, способности катализировать только одну единственную реакцию, высокой стоимости чистых препаратов. Кроме того, для практических целей могут использоваться только те ферменты, для которых не требуется регенерации кофакторов. Преимущество иммобилизированных клеток и органелл:

1.Живая клетка в отличие от фермента - готовый биотехнологический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и многие другие, способствующие поддержанию каталитической эффективности системы на высоком уровне (например, регенерация кофакторов). Поскольку ферменты функционируют в нативном окружении, их денатурация в процессе работы сводится к минимуму.Это расширяет число применяемых ферментов и позволяет осуществлять как процессы синтеза, так и процессы деградации.

2.Иммобилизованные клетки идеально подходят для использования в реакторах с перемешиванием, через которые пропускают субстрат. Преимуществом таких реакторов является возможность их многократного использования и получения продукта, свободного от фермента.

Недостатки иммобилизированных клеток и органелл:

1. клеточная стенка или плазматическая мембрана могут препятст-вовать проникновению субстрата к ферменту или диффузии продукта из клетки.

2. Возникает необходимость поддержания целостности клеток и удержания их в той фазе роста, в которой синтезируются требуемые ферменты.

3.Из-за большого числа присутствующих в клетке ферментов (что в ряде случаев рассматривается как достоинство)возможно протекание нежелательных побочных реакций.
3. Устройства для аэрирования культуральной жидкости в ферментере.

Для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация. Микроорганизмы способны использовать только растворенный кислород (в чем проблема?)

Всем облигатным аэробам необходим молекулярный кислород. Для бактерий, растущих на агаре или в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха, кислорода обычно вполне достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности, так как в более глубоких слоях по мере удаления от поверхности условия приближаются к анаэробным. Поэтому для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация. Микроорганизмы способны использовать только растворенный кислород.

Микроорганизмы способны использовать только растворенный кислород, который является таким же питательным компонентом, как глюкоза или аммоний, однако в отличие от большинства подобных компонентов он довольно плохо растворим (<10 мг/л). В то время как минеральные соли и органические вещества можно добавлять к среде в концентрациях, обеспечивающих рост бактерий на протяжении нескольких часов и даже дней, с молекулярным кислородом этого сделать нельзя, так как растворимость его очень мала.

Конструктивные различия ферментеров определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды:

1. ферментеры с подводом энергии к газовой фазе;

2. ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе;

3. ферментеры с комбинированным подводом энергии.

В аппаратах первого типа аэрация и перемешивание культуральной жидкости осуществляются сжатым воздухом, который подается в ферментер под определенным давлением. К таким ферментерам относят:

• барботажные ферментеры, подача воздуха в которых осуществляется через барботажные устройства, расположенные в нижней части аппарата;

• аппараты с диффузором (эрлифтные аэраторы), имеющие внутренний цилиндр-диффузор, который обеспечивает перемешивание поступающих по распределительным трубам в нижнюю часть аппарата субстрата и воздуха;

• трубчатые ферментеры (газлифтные), состоящие из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь, таким образом циркуляции.

- ферментеры (биореакторы) с форсуночным воздухораспределением, оборудованные форсунками для подачи воздуха, расположенными в нижней части аппарата, и находящимся над ними диффузором, который обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости;

- ферментеры (биореакторы) колонного типа, представляющие собой цилиндрическую колонну, разделенную горизонтальными перегородками (тарелками) на секции; воздух барботирует через слой жидкости каждой тарелки, а перемещение жидкости через кольцевую щель обеспечивает противоточное движение жидкой и газовой фаз

Ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе:

- аппарат с самовсасывающей турбиной, имеющий цилиндрический диффузор и мешалку с полыми лопастями и валом, при вращении которой за счет создаваемого разрежения происходит самовсасывание воздуха, благодаря чему происходит подъем жидкости в кольцевом зазоре между диффузором и стенками аппарата с последующим ее возвращением в диффузор;

- ферментер (биореактор) с турбоэжекторными перемешивающими устройствами - аппарат, разделенный вертикальными перегородками на секции, в каждой из которой имеется самовсасывающая мешалка турбинного типа (эжектор) и диффузор; для перемещения жидкости из секции в секцию в перегородках сделаны окна

Ферментеры с комбинированным подводом энергии

В этих аппаратах осуществлен подвод энергии к газовой фазе для аэрации и к жидкой фазе для перемешивания. Ферментер представляет собой цилиндрический сосуд, снабженный механической мешалкой и барботером, который устанавливается, как правило, под нижним ярусом мешалки.

По способу перемешивания, в соответствии с которым используются аппараты, их разделяют на ферментеры с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием

4. ”Мягкие” способы концентрирования белковых растворов.

Ответ принят

В чем проблема концентрирования белковых растворов?
При выборе технологии концентрирования белковых препаратов ищут решения, позволяющие проводить эти процессы в непрерывном режиме, с высокой скоростью, в "мягких" условиях добиваться максимального обезвоживания образующихся осадков. Это обусловлено рядом технических сложно­стей, связанных, в основном, с нестабильностью белков, проявляющейся в необратимой денатурации или частичной потере ими активности под влиянием незначительных изменений внешних условий. Для уменьшения потерь продуктов применяют различные вещества-стабилизаторы, проводят процесс при оптимальном значении рН растворов, стараются обеспечить максимально возможную механизацию и автоматизацию всех процессов.

Процесс вакуум-упаривания используют для предварительного концентрирования полученных из культуральной жидкости растворов белков перед их осаждением и сушкой .

Быстрое упаривание водного раствора при атмосферном давлении требует его нагрева до температуры 100⁰С, т.е. до температуры кипения воды, что совершенно неприемлемо для растворов белков(из-за необратимой денатураци). Поэтому процесс упаривания проводят при пониженном давлении (ниже 50 мм рт. ст.). Для большей стабильности концентрируемых белков его стараются проводить при нейтральных значениях рН раствора. Так при значениях рН раствора меньше 4,5 и больше 8,2 активность выделяемых ферментов начинает падать уже при нагревании раствора выше 35°С. При рН=6 тот же эффект наблюдается лишь при температуре выше 50°С.

Чем меньше время выпаривания, тем выше может быть температура греющего агента, а выпаривание наиболее очищенного раствора ферментов сопровождается большей потерей активности фермента. Последнее объясняется тем, что присутствующие в растворе примеси "защищают" выделяемый белок от неблагоприятных температурных воздействий.

Вымораживание основано на частичном замораживании раствора белка. Поскольку температура замерзания раствора всегда ниже температуры замерзания чистого растворителя, то образующиеся кристаллы представляют собой чистую воду, а белок концентрируется в водной фазе. Затем кристаллы льда отделяют на центрифуге. Подбирая условия замораживания исходного раствора и различные добавки можно фракционировать белки по составу и значительно сконцентрировать целевой фермент.

 ультрафильтрация или обратный осмос (фильтрованиечерез фильтры со сверхмалым размером пор) имеет ряд очевидных преимуществ, поскольку обеспечивает меньший процент снижения активности фермента. Кроме того, осуществляемое концентрирование сопровождается очисткой от балластных низкомолекулярных примесей и увеличением активности фермента в 100-150 раз. Однако энергозатраты оказываются рентабельными при концентрировании раствора до содержания сухих веществ не более 30%,что связано с забиванием пор мембраны белковыми молекулами и как следствие резким снижением скорости процесса.

Процесс ультрафильтрации в режиме диализа позволяет получать высокоочищенные препараты. Для его осуществления в получаемый концентрат постоянно добавляют чистую воду. Такая пятикратная промывка позволяет в 250-300 раз повысить активность ферментного раствора, т.е. при концентрации 30% раствор содержит практически один белковый ферментный препарат.

На практике процесс ультрафильтрации проводят в циркуляционных аппаратах периодического действия. Перед подачей раствора на стадию ультра­фильтрации из него предварительно удаляют клетки продуцента и для предотвращения развития посторонней микрофлоры на поверхности мембран подвергают стерилизующей фильтрации через специальные бактериальные фильтры. В ходе проведения процесса ультрафильтрации в зависимости от свойств получаемого фермента раствор постоянно охлаждается до темпе­ратуры 4-15° С.

Недостатком метода ультрафильтрации следует считать забивание пор мембраны осадками или адсорбированными молекулами, что приводит к снижению производительности мембранного аппарата во времени.

Какие еще способы Вы знаете?

5. Химерные белки.

Гибридный белок образуются при слиянии двух или более генов , которые изначально кодировали отдельные белки. При трансляции гибридного гена образуется единый полипептид со свойствами, полученными от каждого из оригинальных белков.

(какая самая важная область использования?)

Зачастую даже после успешного клонирования и подбора эффективных условий для экспрессии, чужеродные белки, особенно не­большие, обнаруживаются в клетках лишь в минимальных коли­чествах. Такой кажущийся низкий уровень экс­прессии кодирующих их генов во многих случа­ях объясняется быстрой деградацией этих чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присое­динении продукта клонированного гена к како­му-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клониро­ванного гена оказывается защищенным от рас­щепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соот­ветствующих генов.
Гибридные белки также появляются в результате мутаций, обычно хромосомных транслокаций (тем самым создаются новые белки). Образование этих белков имеет важное значение: гибридные белки вносят не только разнообразие в функции белков организма, но и способствуют развитию рака , когда выступают в роли онкопротеинов.

Для чего получают и где используют химерные белки? 
6. Два основных подхода к получению генноинженерного инсулина.

Ответ принят

Для начала, необходимо разобраться, что такое инсулин и зачем его синтезировать.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин - небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника - препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую пространственную ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае (1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором (2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.

• 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

• 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

• 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

• 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

• 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

• 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Метод 2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

Синтез:

• Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина.

• С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.

• Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.

• Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.

• В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.

• Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.

• Из проинсулина выделяется инсулин.
7. Метаболитическая перегрузка. Причины и способы устранения.

Ответ принят

Введение в клетку чужеродной ДНК и ее экспрессия часто приводят к различным нарушениям клеточного метаболизма. Это явление носит название метаболитическая перегрузка и может возникать по разным причинам:

1.Увеличение затрат энергии (АТФ) и метаболитов на экспрессию, как клонированного гена так и генов самого вектора, и возможность их истощения.

2. Нехватка кислорода и невозможность обеспечения им всех метаболити-ческих реакций, как нужных для клетки, так и для экспрессии клонируемого гена.

3. Нарушение внутриклеточной локализации и экспорта жизненно важных клеточных белков, вследствие перепроизводства чужеродного белка.

Это может привести к таким нежелательным явлениям как снижение скорости роста трансформированных клеток, потере ими рекомбинантных плазмид или удалению рекомбинантного гена из плазмиды.

Поскольку клеткам, растущим в условиях мета­болической перегрузки, не хватает энергии для нормального функционирования, нарушения затрагивают прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слишком много внеклеточного полисахарида, склеивающего клетки друг с дру­гом и затрудняющего микрофильтрацию.

Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного ко­личества чужеродного белка и нехваткой пита­тельных веществ или «строительных блоков» - аминокислот, может произойти запуск стрессо­вых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеаз, под действием ко­торых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка.

Многократно возрастает вероятность трансляционных ошибок. Так для Е. Coli в нормальных условияхонасоставляет 2•10^-4 - 2•10^-3 % на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки опреде­ленных аминоацил-тРНК или гуанизинтрифосфата, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, веро­ятность включения в белковую молекулу непра­вильной амино-кислоты, вместо недостающей сильно увеличивается (в десятки и сотни раз).

Это не позволяет использовать синтезируемый белок в качестве лекарствен-ного средства, поскольку:

1) удельная активность и стабильность белка могут быть гораздо ниже ожидаемых;

2) наличие в молекуле «неправиль­ных» аминокислот может вызвать нежелатель­ную иммунологическую реакцию при введении такого белка в организм человека.

Для снижения влияния метаболитической перегрузки используют следующие подходы или их комбинацию:

1.Использование малокопийных плазмидных векторов.

2.Отказ от использования векторов и встраивание клонируемого вектора в хромосомную ДНК организма-хозяина.

3. Использование регулируемых промоторов. Что это такое? Пожалуйста подробно!

Промоотор — последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции

Для создания экспрессирующих векторов используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов Е.coli; специально сконстру­ированный tac-промотор, состоящий из отдельных фрагментов lac- и trp-оперонов и ряд других. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, ко­торые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

Наличие регулируемых промоторов позволяет предотвращать преждевременный, бесконтрольный синтез неконститутивных рекомбинантных белков, который будет тормозить рост клеточной культуры в lag- и log-фазах и запускать его только после накопления необходимого, оптимального количества биомассы клеток (в стационарной фазе). Так в лабораторных условиях получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1- 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Естественно, подбор условий культивирования для таких продуцентов играет решающее значение.

 4. На практике более эффективным и удобным спосо­бом увеличения количества чужеродного белка, синтезируемого рекомбинантным микроорганиз­мом, состоит в поддержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клеточного белка), но при максимальной плотности клеточной культуры, что достигается подбором соответствующих условий (аэрирование, перемешивание, термостатирование). Так микробиологиче­ская система с 5%-ным уровнем экспрессии чу­жеродного белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может достигать 40 г/л (масса сухого вещества), оказывается более эффективной, чем система с 15%-ым уровнем экспрессии и плотностью 10 г/л.

Какой из вариантов самый удобный?
8. Понятие о соединении – лидере и “привилегированной структуре”. Критерии оценки оральной биодоступности соединений – лидеров. Правило Липински.

Соединение-лидер - это химическое соединение, которое имеет желаемую, интересную, но не оптимальную активность. Это еще не лекарство, а в лучшем случае структурный прототип будущего лекарства .

Стратегия поиска соединения-лидера зависит от того, что известно о его биомишенях, а также от того, что известно о структурах лигандов, которые с ней связываются (этот лиганд может, например, вырабатываться самим организмом (метаболит), быть лекарством или ядом). Здесь возможны три основных варианта:

Чтобы искать соединение-лидер, нужно знать его биомишень, то есть макромолекулу в организме человека, на которую наше будущее лекарство должно воздействовать, связываясь с ней. В подавляющем большинстве случаев такой мишенью бывает белок (обычно рецептор или фермент), но это может быть и молекула ДНК, и другие важные биомолекулы. Стратегия поиска лидеров зависит от того, что известно о его биомишени, а также от того, что известно о структурах уже существующих лигандов, которые с ней связываются (этот лиганд может, например, вырабатываться самим организмом).

Лиганд — атом, ион или молекула, связанные с неким центром (акцептором). Агенты, соединяющиеся с биологическими акцепторами (рецепторами).

Рецептор — сложное образование, состоящие из нервных окончаний, межклеточного вещества и специализированных клеток тканей, которые в комплексе обеспечивают превращение влияния факторов внешней или внутренней среды в нервный импульс.

Здесь возможно несколько вариантов
1. Структуры биомишени и лиганда не известны

Если исследователю не известно ничего — ни структура биомишени, ни структура лиганда, то для поиска соединения-лидера используют метод комбинаторной химии (синтез библиотек соединений и их тестирование). Фактически это то же самое, что делали раньше, только на новом технологическом, машинном уровне. Химики синтезируют параллельно многие тысячи веществ и быстро тестируют их на биомишени с применением современной робототехники.

2. Известна структура биомишени

Когда структура мишени известна, а структуру её лиганда мы не знаем, учёные используют методику, которая называется de novo дизайн. Создают компьютерную пространственную модель молекулы-мишени, в том числе той её полости, с которой должно связываться лекарство. Потом на компьютере же совмещают эту полость с различными молекулами — кандидатами на роль лидера (эта процедура называется „докинг“, по аналогии с заходом корабля в док). При этом структуру гипотетических лидеров нужно подбирать таким образом, чтобы, во-первых, добиться хорошего совмещения размеров молекулы с размером полости, во-вторых, увеличить взаимное связывание молекулы в полости мишени (за счёт слабых взаимодействий: водородных связей, электростатического притяжения, липофильных взаимодействий и т. д). В результате можно подобрать структуру определённого размера и геометрии, которая хорошо подходит под мишень. Смоделированное соединение синтезируют, испытывают на активность и, если таковая обнаружится, берут его в качестве соединения-лидера.

3. Известна структура лиганда.

Следующий вариант структура лиганда известна, а про его мишень мы ничего или почти ничего не знаем. Тогда лидером выбирают сам этот лиганд.

Конечно же, ситуация упрощается, если в нашем распоряжении есть структуры и биомишени, и воздействующего на неё лиганда. Исследователь заранее знает, для какого класса веществ ему нужно делать докинг, и фактически модифицирует в полости мишени структуру лиганда. Такой способ называется структурно-обоснованным дизайном.

Если Вы собрались говорить о подходах к нахождению соединения – лидера, то это все один подход!!! - направленное конструирование. А какие еще есть подходы?

Привилегированная структура (privileged structure) – подструктурный признак, который присваивает желаемые (часто лекарственноподобные) свойства соединениям, содержащим этот признак. Она представляет собой некую неизменную структурную часть определенного семейства молекул, определяющую их активность к большому количеству разнообразных биомишеней. Часто состоит из полужесткого остова, который может иметь гидрофобные остатки (бензольные кольца, алкильные группы), не претерпевая при этом гидрофобный коллапс. В последнее время широко используется более точный термин “привилегированные фрагменты”, к которым относят фрагменты молекул, способные, за счет трехмерных характеристик своей структуры, связываться с большим числом биомишеней, тогда как другие части данных молекул могут обеспечивать специфическое взаимодействие с определенной биомишенью.
Существенным ограничением для молекул – кандидатов в лидеры является то, что они должны быть активными при оральном приеме. В общем, шансы появления оральной активности повышаются при учете следующих структурных особенностей, известных как правило Липински:

1. Молекула должна иметь молекулярную массу меньше, чем 500;

2. Рассчитанный log P (мера липофильности, коэффициент распределения в

системе октанол-1 - вода) должен быть меньше +5;

3. Она должна иметь не больше, чем пять групп доноров водородных связей;

4. Иметь не больше чем 10 групп, акцепторов водородной связи

Молекула соединения хорошей оральной биодоступностью должна иметь такие характеристики, т.к, иначе она будет плохо проходить через клеточные стенки(если будет слишком большой). Так же должна быть водорастворимой (гидрофильной), что обеспечивается наличием в ней полярных заместителей или атомов с высокой электроотрицательностью (N, O), участвующих в образовании водородных связей. Однако количество таких функций не должно быть слишком большим, поскольку такая молекула будет обладать низкой липофильностью, т.е. будет плохо растворяться в липидах клеточной стенки. В этом случае соединение будет иметь низкую биодоступность и легко выводиться из организма, прежде всего с мочой. В качестве определяющих биодоступность факторов рассматривают также площадь полярной поверхности молекулы (фактор так же определяющий ее гидрофильность) и ее гибкость, выражаемую числом одинарных связей, вокруг которых возможно вращение фрагментов молекулы.