|
Шпоры по ветеринарной генетике. 1. Предмет и методы генетики
62.Трансформация 63.Трансдукция 64.Конъюгация у бактерий. 69. Использование процесса конъюгации КОНЪЮГАЦИЯ
Конъюгация — перенос генетического материала от одной бактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту) при их непосредственном контакте. Процесс конъюгации у бактерий обнаружили Дж. Ледерберг и Э. Татум в 1946 г. Они провели следующий эксперимент. Были отобраны два ауксотрофных мутантных штамма Е. coli К-12: не способный синтезировать метионин и биотин штамм Met" Bio и не способный синтезировать треонин и лейцин штамм Thr Leu\ Оба штамма в течение ночи выращивали вместе на полноценной среде. Затем смешанную культуру центрифугировали, отмывали от полноценной среды и высевали на минимальную питательную среду. На минимальной питательной среде без метионина, биотина, треонина и лейцина появились прототрофные колонии Met+ Bio+ Thr+ Leu+ с частотой около 1 на каждые 107 клеток. Дополнительные опыты показали, что ни трансформации, ни трансдукции в данном случае не происходило. Из этого следовало, что образование рекомбинант-ных геномов происходило в результате контакта родительских клеток. Вскоре были получены микрофотографии конъюгирую-щих бактерий кишечной палочки, которые свидетельствов^али о том, что между бактериями при конъюгации образуется "цито-плазматический мостик.
В 1952 г. Хейс установил неравноценную роль родительских штаммов при конъюгации. Выяснилось, что один штамм является донором (мужским), другой — реципиентом (женским). Клетки-доноры обладают половым фактором F. Он является конъюгатив-ной плазмидой и представляет собой циркулярно замкнутую молекулу ДНК. Половой фактор F автономно существует в цитоплазме. Бактериальные клетки с фактором F обозначают F4", а не имеющие его — F. В составе генома конъюгативной плаз-миды имеется tra-оперон, гены которого контролируют образование половых ворсинок (пилей) донорской клетки, необходимых для осуществления контакта с реципиентной клеткой, коныога-тивный перенос собственной плазмиды или хромосомной ДНК, а также репликацию автономной плазмиды.
Механизм переноса генетического материала при конъюгации из бактерии донора в бактерию реципиента показали В. Вольман и Ф. Жакоб. При конъюгации фактор F может перейти из мужской в женскую клетку и превратить ее в F4". Доноры F4" переносят довольно эффективно F-плазмиду во все клетки F, a гены хромосомы — с низкой частотой (105).
Половой фактор F обладает способностью включаться в геном бактерии и тогда из цитоплазматической структуры превращается в фрагмент хромосомы. Клетки, в которых возникает этот процесс, образуют Hfr-штамм. Доноры Hfr переносят бактериальную хромосому с фиксированной точки — сайта интеграции плазмиды, ориентированным образом и с высокой частотой (10 2— 10 3). Интегрированный F-фактор переносится последним. Генетическим методом идентифицировано около 25—30 сайтов интеграции фактора F в хромосому. При конъюгации клетки-доноры F4" или Hfr соединяются с клетками-реципиентами F
при помощи конъюгационного мостика — особой протоплазматической трубки, образуемой клеткой F"1". В клетке донора Hfr под влиянием фермента эндонуклеазы в точке внедрения фактора F происходит разрыв цепи ДНК. Свободный конец одной из цепей ДНК постепенно начинает передвигаться через конъюгационный мостик в клетку реципиента (F) и сразу же достраиваться до двух-цепочной структуры. На оставшейся в клетке-доноре цепи ДНК синтезируется вторая цепь.
Так как фактор F у разных штаммов Hfr включается в хромосому и разрывает ее в разных местах, переход хромосом в реци-пиентную клетку начинается с разных участков. Для переноса всей цепи ДНК в клетку реципиента требуется при 37 °С 100 мин, но конъюгационный мостик очень хрупкий, легко разрывается, и, как правило, вся цепь не успевает перейти. Поэтому с более высокой частотой передаются гены, расположенные около начальной 0-й точки хромосомы донора. Затем ДНК донора в гомологичных участках вступает в контакт с ДНК реципиента, и в результате кроссинговера некоторые участки одной цепи ДНК реципиента заменяются фрагментами ДНК донора.
Искусственное прерывание конъюгации через определенное время после начала скрещивания и выявление рекомбинантов дали возможность определить последовательность перехода разных генов донора в клетку F. На основании определения времени передвижения фрагментов разной длины из клеток Hfr в клетки F было установлено расстояние между генами в минутах, что позволило построить карты хромосом.
В основе построения карт хромосом лежат последовательность расположения генов в хромосоме и расстояние между ними в минутах. Вся окружность хромосомы Е. coli составляет 100 мин. К настоящему времени на карту Е. coli К-12 нанесено более 1000 генов, что составляет около 30 % ее генетической емкости (рис. 23). Иногда включенный в хромосому Hfr половой фактор освобождается и при этом (подобно профагу) может захватить с собой прилегающий к нему участок ДНК бактерии. При конъюгации половой фактор вместе с фрагментом ДНК иногда переходит в женскую клетку, превращая ее в мужскую и передавая ей свойства, контролируемые фрагментом хромосомы донора. Процесс переноса генетической информации при помощи полового фактора называется сексдущией.
ТРАНСДУКЦИЯ
Трансдукция — перенос генов из одной бактериальной клетки в другую при помощи бактериофага. Впервые это явление установили в 1952 г. Н. Зиндер и Дж. Ледерберг. Они проводили исследования на патогенных для мышей бактериях Salmonella typhimurium. Были отобраны два штамма этих бактерий: штамм 22А ауксотрофный, не способный синтезировать триптофан (Т), и штамм 2А, способный синтезировать триптофан (Т1"). Эти штаммы засевали в U-образную трубку, разделенную внизу бактериальным фильтром (рис. 24). В одно колено трубки засевали штамм 22А (Т), в другое — штамм 2А (Г*). После определенного периода инкубации бактерии штамма 22А при посеве на минимальную питательную среду дали небольшое количество колоний (частота появления трансдуцированных клеток была равна 110*). Это свидетельствовало о том, что некоторые клетки приобрели способность синтезировать триптофан. Каким же образом бактерии могли приобрести это свойство? Исследования показали, что штамм 22А был лизогенен по фагу Р-22. Этот фаг освобождался из лизоген-ной культуры, проходил через фильтр и лизировал штамм 2А. Присоединив часть генетического материала штамма 2А, фаг возвращался обратно и передавал этот генетический материал штамму 22А. Штамм 22А приобретал специфические наследственные свойства штамма 2А, в данном случае свойство синтезировать триптофан. Аналогичным образом могут быть трансдуцированы и другие признаки, в том числе способность к сбраживанию, устойчивость к антибиотикам и т. д.
Явление трансдукции установлено также у кишечной па- лочки и актиномицетов. Как правило, трансдуцируется один ген, реже два и очень редко три сцепленных гена. При переносе генетического материала заменяется участок молекулы ДНК фага. Фаг при этом теряет свой собственный фрагмент и становится дефектным. Включение генетического материала в хромосому бактерии реципиента осуществляется механизмом типа кроссинговера. Происходит обмен наследственным материалом между гомологичными участками хромосомы реципиента и материала, привнесенного фагом.
Различают три вида трансдукции: общую, или неспецифическую, специфическую и абортивную. При неспецифической трансдукции в период сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может включиться любой из фрагментов ДНК пораженной бактерии. В результате в реципиентные клетки могут переноситься различные гены бактерии донора. Неспецифическую трансдукцию могут осуществлять фаги Р-1 и Р-22 у эшерихий, шигелл и сальмонелл. При специфической трансдукции профаг включается в определенное место хромосомы бактерии и трансдуцирует определенные гены, расположенные в хромосоме клетки донора рядом с профагом. Например, фаг X(лямбда) в состоянии профага всегда включается в одно и то же место в хромосоме кишечной палочки и трансдуцирует локус, обусловливающий способность к сбраживанию галактозы. При отделении профагов от ДНК хозяина прилегающие к профагу бактериальные гены вместе с ним выщепляются из состава хромосомы, а часть генов профага остается в ее составе. Частота общей трансдукции составляет от 1 на 1 млн до 1 на 100 млн. Специфическая трансдукция происходит чаще.
Установлено, что фрагмент хромосомы донора, перенесенный в клетку реципиента, не всегда включается в хромосому реципиента, а может сохраняться в цитоплазме клетки. При делении бактерий он попадает только в одну из дочерних клеток. Такое состояние получило название абортивной трансдукции.
ТРАНСФОРМАЦИЯ
Трансформация — поглощение изолированной ДНК бактерии донора клетками бактерии реципиента. Явление трансформации кратко освещено при изложении доказательств роли ДНК в наследственности. В процессе трансформации принимают участие две бактериальные клетки: донор и реципиент. Трансформирующий агент представляет собой часть молекулы ДНК донора, которая внедряется в геном реципиента, изменяя его фенотип. В процессе трансформации клетки донора и реципиента не соприкасаются друг с другом. Механизм переноса генетического материала заключается в том, что из клеток донора выделяются в окружающую среду молекулы или фрагменты молекул ДНК. Сначала эта ДНК адсорбируется на оболочке клетки реципиента. Затем через определенные рецепторные участки ее стенки при помощи специальных клеточных белков ДНК втягиваются внутрь клетки. Проникающая донорская ДНК должна быть двух-цепочной. В реципиентной клетке она становится одноцепоч-ной. В ДНК реципиента включается одна из цепей трансформирующего фрагмента. Эта цепь вступает в синапсис с гомологичным участком хромосомы реципиента и встраивается в нее посредством кроссинговера. При этом участок ДНК реципиента замещается фрагментом донора. Молекула ДНК со вставкой трансформирующего участка оказывается гибридной. При следующем удвоении возникают одна нормальная дочерняя молекула ДНК, другая — трансформированная. Установлено, что способность бактерий-реципиентов к трансформации определяется их физиологическим состоянием. Такое физиологическое состояние было названо компетентностью. Состояние компетентности краткосрочно и приурочено к определенному времени клеточного цикла. Было обнаружено, что трансформирующей способностью обладают только крупные молекулы ДНК с молекулярной массой не менее 5-Ю5 Д. У бактерий трансформация имеет место чаще в пределах одного вида, но наблюдается и между разными близкими видами. Это указывает на то, что у них сохранилась гомологичность некоторых участков ДНК.
Изучение процессов рекомбинации у бактерий имеет важное значение для ветеринарного врача, так как ведет к пониманию причин высокой изменчивости бактерий, их способности к приобретению свойств патогенное™, устойчивости к лекарственным веществам.
|
|
|