Шпоры по ветеринарной генетике. 1. Предмет и методы генетики
 Скачать 1.02 Mb.
|
83. Генная инженерияГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Генная инженерия — раздел биотехнологии, связанный с целенаправленным конструированием invitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке и синтезировать определенный продукт. Генная инженерия решает следующие задачи: 1) получение генов путем их синтеза или выделения из клеток; 2) получение рекомбинантных молекул ДНК; 3) клонирование генов или генетических структур; 4) введение в клетку генов или генетических структур и синтез чужеродного белка. Получение генов. Известны два способа искусственного синтеза генов вне организма — химический и ферментативный. Химическим путем в 1969 г. американский ученый Г. Корана с сотр. синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была уже ранее расшифрована. Ученые сначала синтезировали фрагменты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Однако ген аланиновой тРНК при введении в клетку кишечной палочки или бесклеточную среду не функционировал. Оказалось, что он не имел регуляторных элементов — промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терминальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК. В 1976 г. Г. Корана с сотр. осуществили синтез гена супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нуклеотидов. Были также синтезированы примыкающие к гену регу-ляторные участки: промотор (52 пары нуклеотидов) и терминатор (21 пара нуклеотидов) и прикрепленные к концам полимера тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген, встроенный в геном мутантного фага Т4, при введении в живую кишечную палочку оказался работоспособным. В 1979 г. в нашей стране под руководством Ю. А. Овчинникова и М. Н. Колосова химическим путем с помощью ферментов были синтезированы гены гормонов человека и животных — энкефалина и брадикинина. Химико-ферментативный синтез довольно широко применяют в генной инженерии для получения мелких генов. Для получения генов животных, растений и человека, размер которых составляет 1000—3000 нуклеотидов, этот метод слишком сложен и пока неосуществим. Ученые нашли более простой способ получения таких генов. В 1970 г. Г. Темин с сотр. обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некоторые онкогенные вирусы при помощи обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы иРНК. Дальнейшие исследования показали, что матрицами для образования копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и другие иРНК. Это открывало принципиальные возможности ферментативного синтеза любых индивидуальных генов (ДНК), используя их РНК-копии. Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементарной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. Система для синтеза представляет собой раствор, в котором содержатся все четыре нуклеотида, входящих в состав ДНК, ионы магния* фермент обратная транскриптаза (ее получают из онкогенных вирусов) и матричная (информационная) РНК, кодированная геном, копию которого ставится задача снять. На иРНК обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ей цепь ДНК, а затем на ней при помощи этого же фермента синтезируется вторая цепь ДНК. В результате получается ген по структуре такой же, как и тот, на котором была синтезирована иРНК. Этим способом в лабораториях многих стран создан целый ряд генов. В нашей стране под руководством В. А. Энгельгардта был разработан проект «Ревертаза» — программа синтеза генов с помощью этого фермента. В осуществлении проекта участвовали ведущие отечественные и зарубежные институты. В итоге с 1974 по 1978 г. были синтезированы гены глобина голубя, кролика и человека, а также гены митохондрий печени крыс, часть гена, кодирующего иммунные белки мышей, и др. Гены, синтезированные при помощи обратной транскриптазы, не имеют регуляторных участков и функционально неактивны. Поэтому транскрибирование копий ДНК рекомендуется проводить с про-мРНК, которые имеют все необходимые копии регуляторных частей гена. Кроме изложенных способов ген можно получить путем выделения с помощью трансдуцирующих фагов. Таким путем в 1969 г. был впервые выделен лактозный ген кишечной палочки. Однако такой способ получения генов не всегда пригоден, так как предусматривает строгие места локализации фагов. Поэтому используются и другие приемы выделения фрагментов ДНК с нужными для переноса генами. Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы). Важным событием для развития генной инженерии было открытие в клетках бактерий ферментов, способных разрезать молекулу ДНК в строго определенных местах. Ферменты эти называются рестрикти-рующими эндонуклеазами или рестриктазами, а процесс «разрезания» молекулы ДНК называется рестрикцией. С рестриктазами связаны дальнейшие успехи в молекулярной биологии. Они стали одним из главных элементов генной инженерии. Участок ДНК, узнаваемый определенной рестриктазой, включает специфическую последовательность из 6—8 пар оснований, являющихся палиндромом. Палиндромом называется последовательность ДНК, которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная от З'-конца каждой цепи. Например, рестриктаза E.coli под названием EcoRI узнает последовательность ------П ААТТ Ц------ ------Ц ТТАА t Г------ и, прикрепляясь к ней, делает по одному однонитевому надрезу с обеих сторон, т. е. разрезает ее в симметричных участках, указанных стрелками. В результате двухцепочная молекула ДНК, если была кольцевой, вследствие разрыва приобретает линейное строение. На краях молекулы образуются липкие концы, представленные однонитевыми участками из четырех нуклеотидов: на одном конце будет последовательность ААТТ, на другом — ТТАА. При наличии липких концов молекула ДНК из линейной формы вновь способна замкнуться в кольцо без дополнительной обработки. Были обнаружены рестриктазы, узнающие самые разнообразные последовательности нуклеотидов. Например, рестриктаза EcoRII узнает последовательность ЦЦТГГ. К настоящему времени известно свыше 200 рестриктаз, характерных для разных видов микроорганизмов. Это открывает новые возможности для экспериментаторов. Огромные молекулы высших организмов включают большое число мест разрезания для ферментов рестрикции. При обработке ДНК рестриктазами образуются многочисленные фрагменты ДНК, в которых представлены отдельные гены. Затем гены можно соединять в определенные структуры. Остающиеся в такой структуре разрывы нитей ДНК воссоединяются лигазой. Имеется и другой способ получения фрагментов ДНК с липкими концами. Он состоит в том, что выделенные или искусственно синтезированные участки ДНК обрабатывают эндонуклеазой, укорачивающей участки ДНК с обоих концов, после чего при помощи фермента полинуклеотидтран-сферазы пристраивают к этим концам последовательности адени-ловых и тимидиловых нуклеотидов. Длина липких поли-А и поли-Т составляет 50—100 нуклеотидов. При встраивании гена в вектор используются оба рассмотренных метода и часто совместно. Рекомбинантные ДНК. Рекомбинантная ДНК — это искусственно полученная молекула ДНК. Она имеет форму кольца, включает ген (гены), составляющий объект генетических манипуляций, и так называемый вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном. Векторами являются те компоненты рекомбинантных ДНК, которые способны акцептировать чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетках хозяина. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь свойства репликона; 2) нести субстратные участки для рестриктаз, иначе невозможна встройка ДНК; 3) содержать один или несколько маркирующих генов, чтобы по фенотипу можно было определить факт его передачи. Исследования показали, что эффективными векторами являются плазмиды. Из них в качестве векторов используются Col El, pSC 101 и др. Из вирусов в качестве векторов используют фаги X, SV 40 и их производные. Векторы придают рекомбинантной молекуле способность воспроизводиться независимо от хромосомы клетки бактерии. Соединение вектора с фрагментом ДНК может производиться следующими путями: при помощи липких концов, образующихся в ДНК под действием эндонуклеаз рестрикции; дополнительного синтеза полинуклеотидных фрагментов каждой из цепей ДНК (поли-А и поли-Т); соединения тупых концов при помощи Т4-лигазы. На рисунке 25 показаны ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду. Слева на иРНК при помощи обратной транскриптазы синтезируется цепь ДНК (кДНК), затем иРНК удаляют щелочью и при помощи ДНК-полимеразы достраивают вторую цепь кДНК, экзонуклеазой укорачивают обе цепи ДНК и концевой трансферазой пришивают к их концам поли-Т-последовательности. На этом же рисунке справа показано, что кольцевую ДНК векторной плазмиды разрезают рестриктазой и превращают ее в линейную форму, затем экзонуклеазой цепи укорачивают и концевой трансферазой пришивают к ним поли-А-последовательности. На последнем этапе соединяют оба типа молекул ДНК и получают гибридную молекулу — векторную плазмиду со встроенным в нее синтезированным геном. Разрывы в цепях ДНК воссоединяют лигазой. В данном случае было известно, какой ген включен в векторную плазмиду. Но в работах по трансгенозу чаще имеют дело со многими фрагментами ДНК, и среди них только единичные включают ген, который подлежит переносу. Для получения фрагментов ДНК с определенным геном применяют так называемый способ дробового ружья, который заключается в том, что ДНК механически или ферментами дробится на множество мелких фрагментов, после чего их вслепую гибридизируют с молекулами ДНК вектора. Перед этим ДНК вектора обрабатывают рестриктазой для придания им линейной формы и образования липких концов. После введения рекомбинантных молекул в кишечную палочку при помощи селективных сред выделяют те бактерии, в которые попал фрагмент ДНК с нужным геном. Включенный ген обнаруживают по продукту его действия в виде определенного вещества (фермент, гормон и т. д.). Размножение в бактериях идентичных рекомбинантных ДНК называется клонированием. каждый клон бактерий содержит свою рекомбинантную ДНК. Разрабатываются методы, позволяющие производить замены нуклеотидов в ДНК клонированного гена и тем самым изменять свойства кодируемого этим геном белка. Введение в клетку рекомбинантных молекул и синтез чужеродного белка. Чаще всего рекомбинантные молекулы вводятся в клетки бактерий методом трансформации. Сначала клетки бактерий с целью повышения их способности поглощать плазмидную ДНК обрабатывают хлористым кальцием или хлористым барием. После этого в клеточную взвесь вводят раствор с рекомбинантны-ми молекулами. Некоторые из этих молекул проникают внутрь клетки, и часть из них, прикрепясь к мембранам клетки, начинает размножаться и функционировать (рис. 26). Одно из наиболее важных для практики направлений генной инженерии — конструирование микроорганизмов-продуцентов нужных веществ. Первыми в этом направлении были исследования К. Итакуры и Г. Боейра с соавт. (1977). Им удалось добиться экспрессии гена, кодирующего гормон соматостатин в клетках кишечной палочки (рис. 27). Затем в разных странах клетки кишечной палочки использовались для синтеза ряда белков и гормонов человека и животных: инсулина, интерферонов, гормона роста, урокиназы, кальцитонина, альбумина, тимозина и др. В лабораториях А. А. Баева, Ю. А. Овчинникова, М. Н. Колосова, Е. Д. Свердлова и др. осуществлена экспрессия генов, кодирующих энкефалин, лейкоцитарный интерферон, брадикинин, сома-тотропин и др. В последние годы уделяется много внимания созданию генно-инженерных вакцин. Получают антигены из рекомбинантных микроорганизмов или культур клеток, в которые введен определенный ген возбудителя болезни. Этим методом получен материал для вакцинации против гепатита В, гриппа А, малярии, ящура, бешенства, паравируса свиней и др. В нашей стране произведена обратная транскрипция РНК вируса гепатита А. ДНК, кодирующая вирусный белок гепатита, была пришита к ДНК вируса оспы. В результате ослабленная культура оспы вызывает иммунитет против опасной болезни >— гепатита. Вакцина проходит производственное испытание. Штаммы бактерий, продуцирующие вещества, активные в организме человека и животных, могут быть использованы для промышленного производства лекарственных препаратов. В нашей стране ведутся работы по получению методами генной инженерии суперпродуцентов продуктов, свойственных клеткам, таких, как аминокислоты, витамины, ферменты, а также по созданию культур, активно разлагающих нефть, пластмассы, разрушающих нафталин, фиксирующих азот, и т. д. |