Правилозаборов. 1 Проведение забора материала от больных для бактериологических исследований

• Название: 1 Проведение забора материала от больных для бактериологических исследований
• Дата: 18.02.2019
• Размер: 326.18 Kb.
• Имя файла: Правилозаборов.pdf
• Тип: Документы; #67990
• страница: 2 из 3

Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей
Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:
1) нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);
2) бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);
3) тщательно промыть водой;
4) окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);
5) промыть водой и высушить.
Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.
Метод Ожешко.
1) нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);
2) слить кислоту, промыть водой, высушить;
3) зафиксировать в пламени;
4) окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).
1)
Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);
2)
Промыть;
3)
Окрасить раствором Люголя (30 секунд);
4)
Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)
5)
Промыть препарат и высушить
Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные.
Окраска по Бурри (обнаружение капсул). Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с неокрашенными бактериями.
1)
Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;
2)
Высушить на воздухе и бактериоскопировать.
Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в
5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.
Окраска по Романовскому-Гимзе. Относится к сложным методам окраски и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и зерна волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1мл воды, которая должна быть подщелочена до рН – 7,2.
1)
Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол;
2)
Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24ч);
3)
Промыть водой (рН – 7,2) и высушить;
Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в краснофиолетовый.
4.
Правила проведения посева на жидкие и плотные питательные среды для получения чистых культур аэробных бактерий. Методы выделения чистых культур бактерий.
1.
Посев петлей. Посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки. Избыток снимают, поколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по всей поверхности агара.
2.
Посев шпателем. Материал наносят петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности среды.
3.
Посев тампоном. Тампон и исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.
4.
Посев на секторы. Дно чашки делят на секторы. Посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, что бы штрихи с одного не переходили на другой.
5.
Посев газоном. 1мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют по всей поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой.
После посева чашки закрывают и кладут вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, на пробирках – в верхней части.
При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал по стенке пробирки. После чего смывают его средой.
6.
Правила проведения посева на питательные среды для получения чистых культур анаэробных
бактерий. Методы создания анаэробных условий.
Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Для контролем за насыщением этих сред кислородом используют специальные радокс-индикаторы.
Для сохренения низкого ОВП среды должны быть агаризованы. Для культивирования оглигатно- анаэробных бактерий среды должны быть свежеприготовленными (не позднее 2 часов). Для

успешного выращивания требуется внесение большого количества посевного материала. Это связано с тем, что в больших количествах анаэроб способны быстрее понижать ОВП среды.
Среды должны очень богаты питательными субстратами и витаминами, факторами роста, т.к. анаэробный типа дыхания менее продуктивный, чем аэробный.
Методы создания анаэробных условий
1.Физичесикие методы. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода используют их регенерацию путем кипячения в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 50 градусов. После посева поверхность среды заливают парафином или вазелиновым маслом. Так же, возможен посев в столбик плотной или полужидкой среды на глубину
10-12см. кислород с воздуха диффундирует на 1,5-2см, а в глубине создаются благоприятные условия.
Применение анаэростатов и анаэробных боксов.
2.Химические методы. Для поглощения кислорода из замкнутого простанства можно использовать гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1л объема используют 100мл свежеприготовленного 20% Na
2
S
2
O
4
и 16мл 50% КОН.
Для связывания остатков кислорода используют вещества-редуценты, к которым относится тиогликоевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и т.д.
3.Биологические методы. Совместнео выращиевание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При нем на одну половину чашку засевают исследуемы материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроба, способного энергично поглощать кислород.
Помещение в среду кусочков печени, почек, мозга. При это тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют кислород, а в среде создаются анаэробные условия.
Методы выделения чистых культур анаэробов.
1.
Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24-72ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или среду Китта-Тароцци.
2.
Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материал вносят в пробирку с 4-5мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии пересевают на СКС или среду Китта-
Тароцци.
3.
Метод Перетца. Готовят разведение материала, как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в чашку Петри, на дне которой на двух палочках лежит стеклянная пластина 6х6см. среду заливают так, что бы она заполнила пространство между пластиной и дном чашки. При появлении роста пластинку поднимают и чистые колонии пересевают.
7.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом.
Расшифровывание антибиотикограммы.
Для использования необходимо использовать стандартные питательные среды. Стандартные диски с антибиотиками используются только до истечения срока годности. После вскрытия флакон с дисками можно хранить в течение недели в рефрижераторе при 10 градусах.
На поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносят 1мл исследуемой культуры, равномерно распределяют путем покачивания, избыток удаляют пипеткой. Плотные субстраты
(мокрота, кал, рвота) должны быть предварительно гомогенизированы, мочу и экссудат засевают из осадка после центрифугирования. Материал наносят на чашку ватным тампоном. После выделения чистой культуры исследование проводят уже с ней. После посева среду подмушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Диски с антибиотиками накладывают пинцетом на равно расстоянии друг от друга и на 2см от края чашки (на одну чашку не более 6 дисков). Чашку сразу ставят в термостат вверх дном и инкубируют при 35-37 градусах в течение 18-20 часов.
Для учета результатов чашки помещают на темную матовую поверхность и освещают под углом 45 градусов. Допускается учет в проходящем свете. С помощью линейки определяет диаметр зон задержки роста, включая сами диски, с точность до 1мм. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии в пределах зоны торможения роста. Оценку проводят по таблицам в соответствии с используемой средой и видом возбудителя.

10. Методы дезинфекции, правила дезинфекции в бактериологической лаборатории
В зависимости от характера действующего агента различают физический и химический способы дезинфекции.
Физический способ сводится к механической очистке объектов (орошению, мытью, чистке, встряхиванию и выколачиванию, влажной уборке, вентиляций помещений). Он не позволяет достигнуть полного обеззараживания обрабатываемых объектов, однако его применение приводит к значительному уменьшению числа патогенных микроорганизмов во внешней среде.
В микробиологической практике широкое применение нашли способы химической дезинфекции (рук и рабочего места, отработанного патологического материала, градуированных и пастеровских пипеток, стеклянных шпателей, стекол).
Дезинфицирующие средства предназначены для уничтожения возбудителей во внешней среде
(помещениях, предметах ухода за больными, выделениях и одежде больных). Они должны:
1.
Хорошо растворяться в воде
2.
В короткие сроки проявлять бактерицидное действие
3.
Не утрачивать обеззараживающих свойств при наличии органических примесей в среде, подлежащей обработке
4.
Не оказывать токсического действия на людей и животных
5.
Достаточно долго сохранять бактерицидные свойства при хранении в сухом виде или растворе
6.
Быть дешевыми и удобными при транспортировке
Антисептческие средства применяются для воздействия на микробы, контаминирующие поверхности кожных покровов, слизистых оболочек и соприкасающихся с ними тканей.
Галогеносодержащие соединения: хлорная известь, хлорамин, раствор Люголя, спиртовой раствор йода.
Соединения тяжелых металлов: сулема, серебра нитрат, цинка сульфат, цинка окись, ксероформ, дерматол
ПАВ: пероксид водорода, калия перманганат.
Спирты: спирт этиловый.
Альдегиды: формальдегид. Циминаль
Фенолы: карболовая кислота, лизол, деготь, ихтиол
Красители: зеленка, синька
11. Методы стерилизации, аппаратура и режимы стерилизации, используемые в
бактериологической лаборатории.
Стерилизация сухим жаром применяется для обеспложивания стеклянной посуды, пробирок, колб, чашек Петри и пипеток. Для этой цели используют сухожаровые шкафы (печи Пастера), в который необходимый эффект достигается при температуре 160 градусов в течение 2 часов или при температуре 170 градусов в течение 40 минут.
Принципиальные преимущества сухого жара заключаются в том, что при его применении не происходит коррозии металлов и инструментов, не повреждаются стеклянные поверхности. Он пригоден для стерилизации порошков и не содержащих воды нелетучих вязких жидкостей.
Стерилизация паром под давлением – один из наиболее эффективных методов, основанный на сильном гидролизирущем действии насыщенного пара. Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки): жидкости, приборы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Для этого применяют автоклавы.
Питательные среды, перевязочные материалы и белье стерилизуют при 1атм 15-20 минут, питательные среды с углеводами – при 0,5атм 15 минут, а патогенный материал обеззараживают при 2атм.
12. Использование реакций Аг+Ат (РА, РИГА, РП) для идентификации бактерий
РА. Проводят на предметных стеклах. Для этого на обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой несколько капель сыворотки в небольших (1:10 – 1:20) разведениях и каплю ИХН для контроля. Для идентификации в каждую каплю сыворотки, а также в каплю контроля вносят петлю суточной культуры испытуемого микроорганизма, взятой с поверхности плотной питательной среды.
Для выявления АТ в исследуемой сыворотке крови в нее, как и в каплю ИХН, пастеровской пипеткой

вводят по 1 капле взвеси известных микроорганизмов (диагностикума). Внесенную культуру тщательно перемешивают до получения суспензии.
Реакция происходит при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом через 2-5 минут, иногда для этого используют лупу. Если предметные стекла поместить во влажную камеру, что бы исключить испарение капель, то результаты реакции можно учитывать и позже.
При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных и мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. При отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной, как и в контроле.
РНГА. Применяется для идентификации бактериальных и вирусных аг а исследуемом материале, а так же для экспресс-диагностики ряда инфекций.
В данной реакции эритроциты сенсибилизируют антителами. Частицы антительного эритроцитарного диагностикума склеиваются при добавлении аг.
Готовят двукратные разведения исследуемого материала в стабилизирующем растворе. Вносят по одной капле каждого разведения аг в три соседние лунки планшета (реакция занимает три параллельных ряда лунок). В каждую лунку первого ряда вносят по 1 капле стабилизирующего раствора, второго ряда – по одной капле гомологичной иммунной сыворотке, третьего ряда – по 1 капле гетерологичной иммунной сыворотке. Второй и третий ряды служат контролем специфичности реакции. Смесь оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Затем во все лунки добавляют по
1 капле 1% суспензии эритроцитарного антительного диагностикума и тщательно встряхивают планшеты. Результаты реакции учитывают через 30-40 минут. При наличии специфического аг гемагглютинация наблюдается в первом и третьем рядах и отсутствует во втором ряду, где аг предварительно нейтрализован гомологичной сывороткой. Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.
РП (реакция кольцепреципитации). В узкую пробирку (диаметр 0,5см) наливают 0,3-0,5мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пастеровской пипеткой медленно наслаивают по стенке (пробирку держат наклонно) аг в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, что бы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении аг на сыворотку четко видна граница между двумя жидкостями. РП должна обязательно сопровождаться контролем аг и сыворотки. Результаты учитывают в зависимости от вида микроорганизма через 5-10 минут, 1-2 часа, 20-24 часа. В случае положительной реакции в случае в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.
РП (реакия преципитации в геле). Основана на взаимодействии гомологичных аг и ат в агаровом геле с образованием видимых полос преципитации. Аг и ат в результате встречной диффузии в гель образуют макромолекулярные иммунные комплексы, регистрируемые визуально.
В застывшем агаре вырезают лунки, удаляя из них гель пастеровской пипеткой. В одни лунки вносят ат, в другие – аг. И оставляют во влажной камере на несколько дней. Учитывая результаты реакции, сравнивают локализацию и характер линий преципитации возле опытных лунок и контрольной тест- системы.
14. Использование реакций Аг+Ат с мечеными компонентами (РИФ, ИФА, РИА) для
идентификации бактерий
РИФ. Основана на использовании флюоресцеинизотиоционата или других флюорохромов, химически связанных с ат. При этом меченные ат сохраняют свою иммунологическую специфичность. И вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными аг. Комплексы аг и меченными ат можно легко определить по интенсивному желто-зеленому свечению при изучении препарата в люминисцентном микроскопе.
Прямая РИФ ставится следующим образом: препарат окрашивается специфической меченой антисывороткой во влажной камере 30 минут при 25 градусах.
Непраямая РИФ проводится в 2 этапа с использованием двух различных антисывороток. В начале применяют немеченые ат против искомого аг, а на втором этапе образовавшийся комплекс ат-аг обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые ат против гамма-глобулина того вида животного, на котором была получена немеченая антисыворотка, использованная на первом этапе реакции.
ИФА. Метод основан на использовании для метки ат ферментов, способных разгалать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов. Коъюшированные с ферментом ат сохраняют

способность соединяться с гомологичными аг. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов аг-ат+фермент. В качетве ыерментов чаще всего используют пероксидазу, щелочную фосфотазу. Субстратом для пероксидазы служит перекись водорода, а хромогеном 5-аминосалициловая кислота и другие вещества.
В настоящее время в микробиологии используется твердофазная модификация ИФА. Ее суть заключается в том, что в начале на каком-либо твердом материале сорбируют аг (или ат) и лишь после этого добавляют остальные ингредиенты реакции.
Определение неизвестных аг состоит из следующих этапов:
1.
Связывание ат, специфичных для искомого аг. С пластиком лунки планшета;
2.
Внесение антигенсодержащего материала;
3.
Внесение 2-х антител той же специфичности;
4.
Внесение коъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки);
5.
Внесение хромогенного субстрата;