1. Визначення мікробіології як науки. Галузі мікробіології. Предмет і завдання медичної мікробіології. Тенденції розвитку сучасної мікробіології. Значення медичної мікробіології в практичній діяльності лікаря стоматолога
 Скачать 0.51 Mb.
|
|
9. Методи мікроскопії. Виготовлення бактеріологічних препаратів. Барвники та фарбуючі розчини,прості та складні методи фарбування. 1.Світлова мікроскопія: -світлопільна-різновид оптичної (світлової) мікроскопії, де візуалізація досліджуваного об'єкта ґрунтується на вибірковому поглинанні ним або елементами його структури світла з різною довжиною хвилі. -темнопільна- заснована на розсіюванні світла мікроскопічними об'єктами . При темнопольній мікроскопії в об'єктив попадають тільки промені світла, розсіяного об'єктами при бічному висвітленні . Прямі промені від освітлювача в об'єктив не попадають.Застосовується темнопольная мікроскопія переважно для вивчення спірохеті виявлення (але не вивчення морфології) великих вірусів. -фазово-контрастна- заснована на інтерференції світла: прозорі об'єкти, що відрізняються по показнику переломлення від навколишнього середовища, виглядають або як темні на світлому тлі (позитивний контраст), або як світлі на темному тлі (негативний контраст). Фазово-контрастна мікроскопія застосовується для вивчення живихмікроорганізмів і кліток у культурі тканини. -люмінісцентна-в основі лежить явище люмінесценції, тобто здатності деяких речовин світитися при опроміненні їх короткохвильової (синьо-фіолетової) частиною видимого світла або ультрафіолетових променів з довжиною хвилі, близької до видимого світла. Люмінесцентна мікроскопія використовується в діагностичних цілях для спостереження живих чи фіксованих мікроорганізмів, пофарбованих люмінесцентними барвниками (флюорохромами) у дуже великих розведеннях, а також при виявленні різних антигенів і антитіл за допомогою іммунофлюоресцентного методу. -поляризаційна - заснована на явищі поляризації світла і призначена для виявлення об'єктів, що обертають площину поляризації.Застосовується в основному для вивчення мітозу. -ультрафіолетова-в основі лежить здатність деяких речовин (ДНК, РНК) поглинати ультрафіолетові промені. Вона дає можливість спостерігати і кількісно встановлювати розподіл цих речовин у клітці без спеціальних методів фарбування. 2.Електронна-принципово відрізняється від світлової. В електронному мікроскопі замість світлових променів для побудови зображення використовується потік електронів у глибокому вакуумі. Зображення в електронному мікроскопі спостерігають на флюоресцуючому екрані і фотографують. Як об'єкти використовують ультратонкі зрізи чи мікроорганізмів тканин товщиною 20-50 нм, що значно менше товщини вірусних часток.За допомогою електронного мікроскопа вивчають ультратонку будову мікроорганізмів і тканин, а також проводять імунну електронну мікроскопію. Виготовлення бактеріологічних препаратів 1.Знежирене предметне скельце проводять через полум'я газового паяльника,охолоджують і кладуть на робоче місце. 2.Бактеріологічну петлю прожарюють у полум'ї,тримаючи її як олівець у правій руці. 3.Не випускаючи петлі,лівою рукою беруть прбірку з 0,9% розчином натрію хлориду,а 4 і 5 пальцями правої руки виймають ватно-марлеву пробку. 5.Вінце пробірки пропускають через полум'я паяльника. 6.Петлю вводять у пробірку і охолоджують її торкаючись стінки. 7.Занурюють петлю у пробірку і набирають краплю фіз. розчину. 8.Виймають петлю, проводять пробку і відкритий край пробірки через полум'я.ставлять пробірку у штатив. 9.На центр скельця наносять взятий ізотонічний розчин. 10.Петлю стерелізують.Уліву руку беруть пробірку з досліджуваним матеріалом,відкривають пробку з дотриманням усіх правил. 11.Петлю охолоджують і набирають невелику к-кість матеріалу. 12.Взятий матеріал наносять на скло біля краплі фіз. розчину,розтираючи та емульгуючи його в краплі,готують мазок,діаметром 1-1,5 см. 13.Петлю прожарюють. Барвники та фарбуючі розчини 1.Феноловий фуксин Циля 2.Фуксин Пфейфера 3.Насичений спиртовий розчин метиленової синьки 4.Метиленова синька за Леффлером 5.Водно-спиртовий розчин метиленової синьки Складні методи фарбування 1.За Грамом 2.За Ромамовським-Гімзою 3.Фуксин Пфейфера 4.Метод Циля-Нільсена 5.Метод Нейссера 10. Анілінові барвники, використання у мікробіології. Принципи готування фарбуючих розчинів. Прості та складні методи фарбування. Фарбування за Грамом, фактори, які впливають на фарбування бактерії за Грамом. Властивості, що спільні для грам позитивних або для грам негативних бактерій Анілінові барвники - органічні сполуки, що утворюються при окисленні аніліну або його солей; широко використовуються в гістологічної техніки, мають бактерицидну, а деякі - канцерогенну дію. Цей препарат має бактерицидну і бактеріостатичну активність щодо грампозитивних бактерій, особливо стрепто-і стафілококів, а також протипаразитарні і фотосенсібілізуючі властивості. У медицині використовуються деякі анілінові барвники (фуксин, діамантовий зелений), метиленовий синій, метиловий фіолетовий. Розрізняють прості і складні (диференціальні) способи фарбування мікроорганізмів. просте фарбування дозволяє швидко вивчити морфологічні особливості мікроорганізмів. Найбільш придатними є основні і нейтральні анілінові барвники. Для простого забарвлення використовують тільки один барвник, найчастіше червоного кольору - фуксин, фіолетового – генціанвіолет. Складні методи фарбування: Метод Ціля-Нільсена призначений для диференціації кислотостійких бактерій (збудників туберкульозу та лепри) від некіслотоустойчівих. Метод Нейссера використовується для виявлення зерен волютину. Метод Буррі є негативним методом забарвлення: забарвлюється фон, і не фарбуються самі мікроорганізми. Для цього використовують барвники, не фарбують бактерії, наприклад туш. Метод Буррі-Гінса використовується для фарбування капсульних бактерій і заснований на тому, що капсула не сприймає барвники. Метод фарбування за Романовським-Гімзою універсальний метод фарбування. При фарбуванні найпростіших їх цитоплазма набуває блакитний колір, а ядра - червоно-фіолетовий. Основні відмінності складних методів фарбування від простих: Використання декількох барвників.; Використовування додаткових інгридієнтів, що не мають забарвлюючих властивостей. Метод Грама є універсальним методом забарвлення і рекомендується для фарбування прокариотических клітин. Фарбування за Грамом є важливим методом для диференціації різних видів мікроорганізмів за тинкторальними властивостями Фактори, які впливають на фарбування бактерій за Грамом: Точне виконання правил приготування мазка, тривалості фарбування та знебарвлюваності спиртом. Крім того, має значення вік культури та мінливість мікроорганізмів. Для грам позитивних бактерій є спільне: чутливість до лізоциму, пеніциліну, йоду; нечутливість до дії пепсину панкреатину; слабо виражені імуногенні властивості; можуть бути ксимлостійкими; можуть утворювати ендоспори, екзотоксин; війки не виявлені Для грам негативних бактерій є спільним: перетравлюються ферментами ШКТ; мало чутливі до дії лізоциму, пеніциліну, йоду; імуногенні властивості добре виражені; чутливі до дії кислот; ендоспор не утворюють; рідко утворюють екзотоксин; можуть утворювати війки 11.Принципи організації,апаратура і режим роботи бактеріологічної,серологічної та вірусологічної лабораторій. Бактеріологічна лабораторія-науково-дослідні,науково-практичні,практичні установи,які проводять бактеріологічні,серологічні та мікробіологічні дослідження.Їх організовують при науково-дослідних інститутах,навчальних закладах,клінічних лікарнях та санітарно-епідеміологічних станціях. Правила роботи в мікробіологічних лабораторіях:
У кожній лабораторії передбачені: а) бокси для роботи з окремими групами бактерій або вірусами, б) приміщення для серологічних досліджень, приготування поживних середовищ, стерилізації, миття посуду; в) віварій з боксами для здорових і піддослідних тварин;, г) реєстратура для прийому та видачі аналізів. Поряд з цими приміщеннями у вірусологічних лабораторіях є бокси для спеціальної обробки досліджуваного матеріалу і для роботи з клітинними культурами. Лабораторії забезпечені наступним обладнанням: імерсійним мікроскопами з додатковими пристосуваннями, люмінесцентним мікроскопом, термостатами, приладами для стерилізації (автоклав, сушильну шафу, свертивателі), рН-метрами, апаратом для отримання дистильованої води (дистилятор), центрифугами, технічними, аналітичними вагами, апаратурою для фільтрування (фільтр Зейтца тощо), водяними банями, холодильниками, апаратом для виготовлення ватно-марлевих пробок, набором інструментів (бактеріологічні петлі, шпателі, голки, пінцети та ін), лабораторним посудом (пробірки, колби, чашки Петрі, матраци, флакони, ампули, пастерівські і градуйовані піпетки). В лабораторії є місце для забарвлення мікроскопічних препаратів, де знаходяться розчини фарб, спирт, кислоти, фільтрувальний папір та ін Кожне робоче місце забезпечене газовим пальником або спиртівкою і банкою з дезінфікуючим розчином. Для повсякденної роботи лабораторія повинна мати у своєму розпорядженні необхідні поживні середовища, хімічні реактиви, діагностичні препарати. У великих лабораторіях є термальні кімнати для масового вирощування мікроорганізмів, постановки серологічних реакцій. 12. Бактеріоскопічний метод дослідження. Етапи. Методика фарбування бактерій за Грамом Бактеріоскопічний (мікроскопічний) метод сукупність способів виявлення та вивчення морфологічних і тинкторіальних властивостей бактерій (мікробів) Застосовують для встановлення діагноза інфекції. захворювання чи іншого викликаного мікробами процесу, а також при ідентифікації виділеної чистої к-ри. У лабораторній практиці використовують такі типи мікроскопічних препаратів: 1) висячу краплю 2) придавлену краплю 3) тонкий мазок крові, гною, мокротиння та ін; 4) товсту краплю 5) агар-мікроскопію 6) препарат-відбиток 7) фіксований мазок. У Бактеріологічній практиці частіше застосовують останній тип препарату. Приготування його складається з декількох етапів: 1) забору і доставки матеріалу для дослідження 2) приготування препарату. Для цього досл. матеріал наносять на чисте, знежирене предметне скло з допомогою бактерій. петлі і розподіляють по площі в 1 см2. Щільний (густий) матеріал або к-ру з щільного середовища вносять бактерій. петлею в краплину фізрозчину, ретельно розмішують і розподіляють по склу на такому ж просторі, як і в попередньому випадку. Величина внесеного матеріалу залежить від передбачуваної кількості бактерій в ньому. 3) приготовлений мазок висушують на відкритому повітрі або в теплому струмені повітря (від газового пальника), 4) препарат фіксується на склі для забезпечення безпеки подальшої роботи, прикріплення бактерій до скла, кращого сприйняття ними фарби, оскільки структури вбитих бактерій легше і міцніше сприймають барвники; 5) фіксовані мазки забарвлюють одним з простих або спеціальних методів фарбування , занурюючи мазок в барвник або наливаючи його на препарат так, щоб вся поверхня препарату була вкрита суцільним шаром барвника, і добре просушують на повітрі. Погано висушений препарат дає каламутне зображення при імерсійної мікроскопії через утворення емульсії; 7) мікроскопії мазка. Цінність Б.м. полягає в простоті, доступності методик і швидкості отримання результатів (30 - 60 хв і менше). Метод фарбування за Грамом 1. Фіксований мазок забарвлюють карболовим розчином генціановий фіолетового протягом 1-2 хвилин. 2. Протягом 1 хвилини обробляють мазок розчином Люголя. 3. Знебарвлюють спиртом 10-20 сек. 4. Промивають водою. 5. Дофарбовують мазок водним розчином фуксину 1-2 хвилини. 13.Конструктивний та енергетичний метаболізм.Класифікація бактерій за типами живлення. Енергетичний метаболізм. Для синтезу компонентів мікробної клітини та процесів життєдіяльності,крім поживних речовин потрібна також і енергія.У результаті енергетичного метаболізму енергія накопичується у вигляді молекул АТФ.Хемолітотрофи здатні отримувати енергію з неорганічних сполук.Хемоорганотрофи одержують енергію в процесі реакцій окислення-відновлення,сполучених з реакцією фосфорилювання.Бактерії забезпечують себе енергією за рахунок окислювального фосфорилювання(дихання),субстратного фосфорилювання(бродіння)та змішаного. Конструктивний метаболізм.Сукупність біосинтетичних реакцій,в результаті яких із низькомолекулярних сполук утворюються клітинні полімери.Синтез основних органічних компонентів у бактерій відбувається завдяки реакції полімеризації.Для цього використовуються амінокислоти,моносахариди,жирні кислоти.Частина низькомолекулярних сполук потрапляє у бактеріальні клітини іззовні після розщеплення екзоферментами різних поживних субстратів.Більшість інших сполук,утворюються в клітині в результаті катаболізму вуглеводів. Класифікація за типами живлення За джерелами засвоєння вуглецю: -аутотрофи-синтезують вуглецьвмісні компоненти кліт. з неорганічного вуглецю -гетеротрофи-використ. органічний вуглець За способами споживання азоту: -аміноаутотрофи-задовільняють свої потреби в азоті за допомогою фіксації атмосферного азоту або використ. азот з азотовмісних мінеральних солей. -аміногетеротрофи-використовують азот органічних сполук За рахунок синтезу глюкози та солей амонію: -прототрофи-синтез. речовини з глюкози та солей амонію -ауксотрофи-беруть реч. з навколишнього середовища За джерелами енергії: -фототрофи-використ. сонячну енергію -хемотрофи-використ. окисно-відновні реакції(хемолітотрофи,хемоорганотрофи) 14. Типи і механізми живлення мікроорганізмів. Механізми проникнення поживних речовин в бактеріальну клітину. Хімічний склад мікроорганізмів. Значення складових компонентів. Поживні середовища, вимоги до них. Класифікація поживних середовищ, які використовують у мікробіології Типи живлення: автотрофи (для створення нових клітин використовують окис водню) і гетеротрофи (використовують готові сформовані органічні сполуки). Гетеротрофи в свою чергу поділяються на сапрофіти (потребують мертві органічні речовини) і паразити (визивають хвороби в тих істотах, в яких живуть) Механізми проникнення поживних речовин: дифузія, полегшена дифузія, транслокація груп (коли транспортуєма сполука піддається модифікаційним змінам), активний транспорт (затрати енергії) Мікробні клітини майже цілком складаються з води (біля 80 %). 20 % вмісту клітини припадає на сухі речовини. Якщо їх прийняти за 100 %, то хімічний склад клітини буде такий: вуглецю - 46-50 %. кисню - 30, водню - 6-7, азоту - 7-14, мінеральних речовин - 2-14 %. До мінеральних речовин належать фосфор, калій, натрій, магній, сірка, кальцій, хлор, залізо, цинк, бор, хром та інші. Вода: розчинник для кристалічних речовин, джерело водневих іонів, учасник хім. реакції Білки: утворюють мембрану на поверхні цитоплазми (ліпопротеїди), здійснюють хім. реакції (ферменти); обумовлюють видову специфічність мікроорганізмів. Полісахариди: розпадаються на глюкозу, фруктозу, галактозу. Класифікація поживних середовищ: -за консистенцією 1)тверді 2)напіврідкі 3) рідкі -за походженням 1)Природні (сироватка крові, жовч, яйця, молоко, морква) 2)Штучні; 3) Синтетичні -за призначенням і складом 1)Основні (МПБ, МПА) 2)Диференціально-діагностичні(Середовище Гісса, Середовище Левіна, кровяний МПА, згорнута сироватка) 3)Спеціальний жовчний бульйон, цукровий бульйон, асцит, агар) Вимоги до поживних середовищем: Повноцінність за хім. складом; наявність стимуляторів росту; певна реакція (рН); буферність; ізотонічність; в’язкість; вологість; прозорість; стерильність. 15.Дихання мо.Класифікація за типами дихання.Аеробний і анаеробний тип дихання.Бродіння.Ферменти і структури мо,що беруть участь у процесі дихання.Методи вирощування анаеробних бактерій. Класифікація за типами дихання Дихання бактерій. Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати. 1.Облігатні аероби - мікроорганізми, для оптимальнгоо росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На поверхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки. 2.Облігатні анаероби - бактерії, які ростуть при відсутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентиними газами (азотом, воднем). 3.Факультативні анаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу факультативних анаеробів формують численні представники родини кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. 4. Мікроаерофіли - особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями. 5. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками є збудники бруцельозу бичачого типу. |