ответы на предмет. 2. Методы исследований на ионномолекулярном уровне, уровне элементарных частиц, микро и макроагрегатов
 Скачать 114.89 Kb.
|
|
31. Методы определения микробиологической активности. Для оценки деятельности почвенной биоты используют показатель биологической активности почвы. Почвенная биота - это совокупность живых организмов, населяющих почву. В их число входят: бактерии, грибы, актиномицеты, водоросли, микроскопические животные, а также лишайники и зеленая растительность, имеющая в почвах свою корневую зону. Обычно, чем плодороднее почва, тем в ней больше содержится живых организмов, и тем разнообразнее они по видовому составу. Биологическую активность почвы определяют следующими способами: - подсчетом общего количества почвенных микроорганизмов. - определением количества отдельных физиологических групп микроорганизмов, например, нитрифицирующих или целлюлозоразлагающих бактерий. Появление нитрифицирующих бактерий (нитрификаторов) указывает на развитие процесса самоочищения, так как они завершают цикл разложения азотсодержащих соединений, превращая аммиак в азот. При свежем фекальном загрязнении нитрификаторов не будет, поскольку субстрат для их развития отсутствует. В ходе жизнедеятельности микроорганизмов, разлагающих органические вещества, образуется аммиак, что приводит к развитию нитрификаторов. - определением выделяемого почвой диоксида углерода - биохимический способ определения биологической активности почвы. Чем интенсивнее выделение углекислого газа из почвы, тем активнее происходят в ней биологические процессы, тем лучше условия для возделывания сельскохозяйственных культур и выше их потенциальная урожайность. Выделение углекислого газа из почвы в приземный слой атмосферы называют дыханием почвы. Интенсивность дыхания почвы зависит от ее свойств, гидротермических условий, характера растительности, агротехнических мероприятий. Выделение диоксида углерода почвой усиливается при ее окультуренности в связи с активизацией биологических процессов и улучшением условий аэрации. Уменьшение выделения углекислого газа почвой (снижение биологической активности) может ухудшить поступление кислорода в почву, что, в свою очередь, будет способствовать образованию токсичных веществ. Отбор проб производят с квадратного участка (не менее 5x5 м) из 5 точек - из каждого угла и центра квадрата («метод конверта»). Образцы забирают в условиях асептики с глубины 20-30 см. Объем образцов 1 кг. Периодичность контроля. Периодичность контроля зависит от контролируемых объектов, но не реже 1 раза в год. При изучении динамики самоочищения почвы на загрязненных территориях пробы берут в течение первого месяца после загрязнения еженедельно, в последующие месяцы - 1 раз в месяц в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения. Санитарная оценка воды по микробиологическим показателям Среди объектов, подлежащих микробиологическому контролю, важнейшее место отводится исследованию воды. В соответствии с действующими нормативными документами контролю подлежат: вода питьевая (центрального и местного водоснабжения); вода плавательных бассейнов; вода открытых водоёмов; сточные воды; вода для приготовления инъекционных растворов и глазных капель. Предупредительный надзор осуществляют при: решении вопросов водоснабжения и канализации населенных территорий; санитарной оценке бассейнов, пляжей, мест коллективного отдыха. Текущий санитарный надзор осуществляют при: оценке качества питьевого водоснабжения населенных мест; оценке санитарного состояния поверхностных вод для установления степени влияния биологического загрязнения на способность воды к самоочищению; контроле над обеззараживанием сточных вод; обнаружении санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов по эпидемическим показаниям для выявления возможного пути передачи инфекционных заболеваний. 32. Методы диагностики вредного влияния сорняков: методы измерения биомассы, засоренности почвы семенами, токсического влияния выделений сорных растений. Потенциальной засоренностью полей называют количество семян сорняков или их вегетативных зачатков на единицу площади, содержится в определенном слое почвы. Единицами измерения этого показателя является шт. / М 2, или млн. Шт. / Га. Существует несколько способов определения потенциальной засоренности полей: механический, биологический и расчетный. Определяя потенциальную засоренность полей, важно выделять общее количество физически нормального семян и ее составных частей: похожей части и семена, находится в покое. Для определения потенциальной засоренности поля механическим способом осенью после основной обработки почвы или весной берут образец грунта массой 1 кг, который составляют из отдельных проб, отобранных из определенной глубины равномерно по двум диагоналям поля. При площади поля более 100 га отбирают 80 равновеликих проб, при размере поля 50-100 га - 60, а на площади до 50 га - 30 проб. Отбор проводят из слоев толщиной 10 см, то есть в пахотном слое выделяют три части: 0-10 см, 10-20 см и 20-30 см. Эти части делят пополам - на две навески по 500 г, отделяя семена с каждой на сита с отверстиями 0,25 мм в воде. Подсчет физически нормального (наполненные) семена оказывают на белой бумаге, надавливая на него слегка шпателем, не учитывая при этом пустые оболочки. Затем по 50-100 выделенных из почвы нормальных семян в 4-х повторностях высевают в чашки Петри на ложе из трех слоев фильтровальной бумаги, смоченной 10 мл воды, и помещают в термостат для проращивания при температуре +20 - + 25 ° С в течение 30 дней . Учет пророщенных семян проводят через 3-5 дней нарастающим итогом. Чтобы избежать алелопатично взаимовлияния семян различных видов, высеянных в одну чашку Петри, а также поражения семян болезнями каждые 5 дней в чашках заменяют бумажные ложе. Для проращивания семян удобно использовать аппарат Якобс-на. После окончания проращивания в чашки наливают 10 мл 0,5% раствора хлорфе-нилтетразолию хлористого и через 24 ч экспозиции в темном термостате при температуре 20 ° С определяют при 10-кратном увеличении после раздавливания семенных оболочек количество мертвых семян с коричневым содержимым, а также семян, находится в эндогенном покое (ткани окрашиваются в красный цвет), и твердые семена в экзогенном покое с белым цветом тканей. Чтобы рассчитать количество семян сорняков на 1 га, результаты учета проращивания семян из двух навесок сравнивают между собой. Если различие не превышает + 5%, данные двух навесок составляют, а полученная сумма и будет количеством похожих семян в миллионах штук на 1 га в слое 0-10 см. Определяя биологическим способом потенциальную засоренность полей, образцы почвы определенной массы сеют слоем 2-3 см в чашки Петри и проращивают при температуре +20 - + 22 ° С. Лестницы подсчитывают в течение 30-дней дней. Затем количество сходов выражают в млн. Шт. / Га в определенном слое почвы, и будет величиной его потенциальной засоренности похожим семенами сорняков. При этом общее количество семян сорняков в почве остается неизвестной. 33. Методы исследования почвенной биоты: насекомых, червей, фитонематод, микроорганизмов. Метод стекол обрастания. «Микробный пейзаж» может быть получен методом стекол обрастания Росси — Холодного,, который заключается в следующем. В небольшом почвенном разрезе одну из стенок зачищают и, делая ножом вертикальную щель, закладывают в нее стерильные предметные стекла, плотно прижимая их к почве. Закапывают разрез, отмечая колышком местонахождение препаратов. Если почва содержит достаточно влаги, то закопанное стекло вскоре покрывается почвенным раствором, к его поверхности прилипают коллоидные частички органического и минерального происхождения. В этой среде поселяются и активно развиваются различные микроорганизмы, образующие на стеклах характерные для данной почвы микропейзажи. По истечении срока экспозиции (не менее одного месяца) стекло осторожно отделяют от почвы (не скользящим движением), подсушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки, отмывают осторожно препарат водой от крупных частиц почвы (для этого можно оставить стекло в стакане с водой в наклонном положении на несколько часов), окрашивают 1%-ным карболовым эритрозином в течение 1 ч во влажной камере, промывают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Метод широко применяется в микробиологической практике. С помощью этого метода впервые оказалось возможным наблюдение за распределением различных микроорганизмов в их природной среде обитания, наблюдение за формой и размерами группировок микроорганизмов, их взаимоотношениями. Метод капиллярных педоскопов. В естественных условиях развитие микроорганизмов происходит в основном в почвенных капиллярах, к стенкам которых прикрепляются. почвенные микроорганизмы. Исходя из этого положения, Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе (1961) предложили использовать для наблюдения за живой почвенной микрофлорой капилляры с плоокопараллельными стенками. Был сконструирован специальный прибор — педоскэп, состоящий из набора таких капилляров. Стерильные педоскопы вставляют в почву с помощью специального пробойника так, чтобы каналы капиллярных ячеек приняли вертикальное положение, т. е. соответствовали преобладающему направлению тока почвенного раствора. Экспозиция педоскопов в почве длится обычно в течение месяца, после чего педоскопы вынимают из почвы, очищают снаружи от почвенных частичек и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой объектива. Микробы в иедоскопах могут быть зафиксированы и окрашены. Фиксируют их в парах осмиевой кислоты или в парах 40%-ного раствора формалина. Окрашивают 1%-ным раствором карболового эритрозина, промывают водой. Модификация метода, предложенная Т. В. Аристовской, состоит в том, что внутренние стенки капилляров покрывают средой, содержащей ту или иную фракцию гуминовых кислот. 50 г почвы заливают 1 л 0,1 н. раствора NaOH и через 18—20 ч отфильтровывают. Реакция среды должна быть слабокислой, pH фильтрата осторожно доводят 0,2 н. НС1 до 5. Затем в фильтрат по капле прибавляют 20%-ный раствор FeCU до полного выпадения гумусовых веществ в форме геля, который отфильтровывают и отмывают от следов хлора (проба с 1%-ным раствором AgN03). Около 5 мл геля растирают в ступке, взбалтывают в 1 л воды, вносят в 0,1%-ный раствор агара и стерилизуют. Педоскоп боковой стороной помещают в расплавленную среду, тщательно протирают снаружи стерильной ватой, подсушивают. Метод люминесцентно-микроскопического наблюдения микроорганизмов в почвенных монолитах по Звягинцеву. Приготовляют цилиндрическую формочку размером 1x1 см из нержавеющей стали, пластмассы или стекла, имеющую острые края. Вдавливают формочку в почву исследуемого горизонта и осторожно вынимаюд ее так, чтобы над краями формочки возвышался слой'почвы. Острой бритвой срезают почву, чтобы верхняя грань монолита была на уровне краев формочки. На поверхность почвы капают раствор акридина оранжевого и накрывают ее очень тонким покровным стеклом (0,10—0,12 мм). Через 10—20 мин исследуют в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом (90Х) в отраженном свете. Основные трудности метода заключаются в подборе подходящей концентрации красителя; для каждой почвы она подбирается опытным путем. Электронно-микроскопические исследования почвенных микроорганизмов. Разрешающая способность электронных микроскопов достигается. Методы исследования адсорбции почвенных микроорганизмов. Для изучения адсорбции микроорганизмов почвенными частичками пользуются косвенными и прямыми методами. Метод Диановой и Ворошиловой заключается в следующем. В большую пробирку вносят 5 г почвы и 1 мл бульонной культуры исследуемого микроорганизма. Такое же количество клеток вносят в другую пробирку, не содержащую почвы. Затем в обе пробирки вносят по 9 мл стерильной водопроводной воды. После минутного встряхивания и 10-минутного отстаивания из верхнего слоя жидкости обеих пробирок производят посев на питательную среду для учета количества микроорганизмов. По разности определяют количество адсорбированных клеток и вычисляют процент адсорбции. Метод достаточно прост и нашел широкое применение при изучении адсорбции искусственно внесенных в почву клеток микроорганизмов. 34. Методы исследования биологической активности почв (метод определения дыхания почвы), активности ферментов. Биологическая активность почвы выражается суммарным проявлением активности биохимических процессов и характеризует размеры и направление превращения веществ и энергии в почве, происходящего под действием живых организмов. Показатели биологической активности почвы могут быть использованы при тестировании состояния почв. При загрязнении почв небольшими количествами органических соединений может наблюдаться возрастание некоторых показателей биологической активности, так как более интенсивно развиваются группы микроорганизмов, участвующих в переработке дополнительных субстратов (фенолов, углеводородов). При загрязнениях тяжелыми металлами, оксидами серы, большими количествами различных органических веществ преобладает токсический эффект, вследствие чего биологическая активность подавляется. В качестве показателей активности, характеризующих экологическое состояние почвы, в литературе чаще всего рекомендуются следующие: выделение почвами диоксида углерода (дыхание почвы), активность ферментов, токсичность почв по отношению к тестовым организмам, различные аппликационные методы. Интегральной характеристикой напряженности микробиологических процессов является скорость выделения углекислого газа. В большинстве случаев чем она выше, тем лучше экологическое состояние почвы. В оптимальных условиях скорость выделения углекислого газа может достигать нескольких кг/га в час. Так как интенсивность дыхания почвы является исключительно вариабельной величиной и зависит от большого количества факторов (температурного режима, влажности, состояния фитоценоза и др.), для оценки экологического влияния загрязнений необходимо проводить сравнение данных, полученных на различных участках в близких условиях. Метод Штатнова в котором количество выделившегося в течение определенного времени углекислого газа определяют по нейтрализации им раствора щелочи. Определение дыхания почвы этим методом заключается в том, что поверхность почвы изолируют от окружающего воздуха сосудом, под которым помещают чашку с 2 мл 0,1 н. раствора КОН для поглощения углекислого газа. Через определенное время (0,5-1 час) сосуд-изолятор снимают, щелочь оттитровывают 0,05 н. раствором НCl по фенолфталеину до обесцвечивания. Одновременно делают контрольные измерения (изолятор и щелочь ставят не на почву, а в какой-либо плоскодонный сосуд и также изолируют от воздуха). По разнице титрования определяют количество выделившегося из почвы углекислого газа. Расчет проводят по формуле:  где F - скорость выделения углекислого газа из почвы, кг/га в час; а - объем 0,05 н. НС1, пошедший на титрование щелочи при определении содержания углекислого газа в воздухе контрольного сосуда, мл; б - объем 0,05 н. НС1, пошедший на титрование щелочи при определении содержания углекислого газа в воздухе сосуда-изолятора на почве, мл; 1,1 - масса углекислого газа, эквивалентная 1 мл 0,05 н. раствора кислоты, мг; 100 - пересчетный коэффициент (1 мг/см2=100 кг/га); S - площадь почвы под сосудом-изолятором, см2; t - время экспозиции, час. Тестировать активность различных групп почвенных микроорганизмов в почвах можно при помощи различных аппликационных методов. Наиболее распространенным является измерение скорости распада целлюлозы. Этот метод был рекомендован академиком Е. Н. Мишустиным. Для проведения исследований берут стерильную тонкую суровую льняную ткань (неотбеленную). Определяют массу 1 дм2 этой ткани, затем ее полосы (шириной обычно 10 см, длина зависит от глубины изучаемого почвенного слоя) пришивают к полимерной пленке. В почве вырывают свежие разрезы, в которые помещают полосы ткани, полиэтилен с обратной стороны придавливают почвой и разрез засыпают. Верхняя грань ткани должна быть на 3,5 см погружена в почву. Через определенное время ткань извлекают из разреза, отмывают и взвешивают. Потеря массы характеризует интенсивность разложения клетчатки. Для определения динамики процесса повторные куски ткани извлекают последовательно через разные интервалы времени. Для оценки интенсивности разложения клетчатки (% за сезон) используется следующая шкала: очень слабая Меньше 10% слабая 10-30% средняя 30-50 % сильная 50-80 % очень сильная больше 80 % Шкала интенсивности позволяет определить микробиологическую активность почв: чем выше процент разложения клетчатки, тем она выше. Описаные методы определения в почве активности ферментов оксидоредуктаз и гидролаз. Наиболее простыми по выполнению являются методы определения активности дегидрогеназ и инвертазы. Для определения активности дегидрогеназ в почве в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия, которые восстанавливаются в красные соединения формазанов. Навеску 1 г почвы помещают в 50 мл вакуумную колбу с притертыми стеклянными пробками, добавляют 10 мг углекислого кальция и тщательно смешивают. Для определения дегидрогеназ лучше использовать свежие образцы почвы, т.к. при высушивании образцов почвы их активность падает до 50-80%. Затем добавляют 1 мл 1%-ного солей тетразолия. Определение проводят в анаэробных условиях, для этого воздух из колбы эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт.ст. в течение 2-3 мин. Колбы осторожно встряхивают и ставят в термостат при 38С на 24 ч. Контролем служит стерилизованная почва и субстраты без почвы. После окончания инкубации в колбы добавляют по 25 мл этилового спирта и встряхивают в течение 5 мин. Содержимое колбы фильтруют, и полученный раствор формазанов анализируют на фотоэлектроколоримтре, используя кюветы шириной 5 мм и синий светофильтр с длиной волны 500-600 нм. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой. Для составления калибровочной кривой готовят стандартный раствор формазана в этиловом спирте (0,1 г в 1 мл.), затем в мерные колбы на 25 мл берут соответствующее количество стандартного раствора, содержащего от 0,1 до 1 мг формазана, этанолом доводят до метки и фотоколориметрируют согласно вышеописанному способу. Ошибка определения - до 8% [8, с. 32]. Фотоколориметрический метод определения активности инвертазы заключается в следующем. В колбу емкостью 50 мл помещают 5 г почвы, добавляют 10 мл 5%-ного раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (pH 4,7) и 5-6 капель толуола. Колбы закрывают пробками, встряхивают и помещают в термостат при температуре 30С на 24 часа, периодически встряхивая их. Контроль - стерилизованная почва (3 ч при 180С) и чистый субстрат. После инкубации содержимое колб фильтруют в 100-мл мерные колбы. Из фильтра берут 6 мл в большие пробирки, добавляют 3 мг сегнетовой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 10 мин. Затем пробирки с раствором охлаждают в холодной воде, содержимое переносят в пробирки и центрифугируют в течение 5-7 мин. при 3000 об/мин. Прозрачный центрифугат колориметрируют на фотоэлектроколориметре (светофильтр 630 нм), кюветы шириной 1 см. Количество глюкозы рассчитывают по предварительно составленным калибровочным кривым. Исходный стандартный раствор - 6 мг глюкозы в 1 мл. Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за сутки. Ошибка определения - до 5% [8, с. 33]. |