Мед. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология т-1, Звере. 2016 2 Библиография Медицинская микробиология,вирусология и иммунология в 2 т. Том Электронный ресурс
 Скачать 4.99 Mb.
|
|
3.1.11. Условия культивирования бактерий Для культивирования бактерий необходимо соблюдать ряд условий. • Наличие полноценной питательной среды. Каждая питательная среда независимо от сложности состава и цели применения (см. главу 3.1) должна обладать водной основой, органическим источником углерода и энергии, определенным рН, осмотическим давлением. • Температура культивирования. Температура влияет на скорость размножения. Для поддержания требуемой температуры используют специальные приборы - термостаты. 61 • Атмосфера культивирования. Для роста и размножения строгих аэробов необходим кислород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для обеспечения роста и размножения строгих аэробов в глубинных слоях жидкой среды необходимо диффузное распределение кислорода по всему объему питательной среды. Это достигается непрерывным перемешиванием или встряхиванием питательной среды, т.е. аэрированием. Аэрирование осуществляется на специальных аппаратах - встряхивателях. Для культивирования факультативных анаэробов используют те же методы, так как в присутствии кислорода у них преобладает оксидативный метаболизм над ферментацией как наиболее энергетически выгодный. Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Этого можно достичь повышением парциального давления СО 2 в атмосфере культивирования до 1-5% против 0,03% СО 2 в атмосфере воздуха. Для этих же целей используют специальные СО 2 - инкубаторы или же посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горящую свечу. Облигатные анаэробы для своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха. Это достигается следующими мерами: - добавлением к питательным средам редуцирующих кислород веществ: тиогликолевой и аскорбиновой кислот, цистеина, сульфидов; - регенерацией от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения с последующим плотным закупориванием сосудов, в которые налиты среды, резиновыми пробками; - использованием поглотителей кислорода, щелочного пирогаллола, и других средств, помещая их в герметически закрываемые емкости газ-паки. Этот метод используется для культивирования аэротолерантных бактерий; - механическим удалением кислорода воздуха с последующим заполнением емкости инертным газом (для этих целей используют анаэростаты и анаэробные боксы). Для культивирования хемо- и фотоавтотрофных бактерий создается атмосфера, насыщенная СО 2 • Время культивирования зависит от времени генерации. Большинство бактерий культивируют для получения видимого роста в течение 18-48 ч. Для культивирования возбудителя коклюша требуется 5 сут, для культивирования М. tuberculosis - 3-4 нед. • Освещение. Для выращивания фототрофных микроорганизмов необходим свет. Некоторые условно-патогенные микобактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент, что используется при их идентификации. Культивирование абсолютных внутриклеточных паразитов, бактерий, относящихся к родам Rickettsia, Ehrlichia, Coxiella, Chlamydia, осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах (за исключением эрлихий). Куриные эмбрионы используют также для культивирования бактерий, обладающих высоким уровнем гетеротрофности, например родов Borrelia, Legionella. 3.1.12. Поведение бактерий в бактериальных сообществах Популяция бактерий, будь то в окружающей среде или в организме хозяина, представляет собой не совокупность отдельных клеток, а сообщество, живущее по социальным законам, члены которого общаются между собой посредством понятного им языка. В настоящее время стало известно явление, получившее название «quorum sensing», или чувство кворума. «Quorum sensing» - это межклеточный механизм бактериального общения, предназначенный для контроля экспрессии генов в зависимости от плотности бактериальной популяции. Регуляторные системы «quorum sensing» обычно состоят из двух компонентов: небольшой диффундирующей сигнальной молекулы и транскрипционного активаторного белка. В грамотрицательных бактериях сигнальные молекулы называются аутоиндукторами. По 62 типу «quorum sensing» регулируется широкий ряд физиологических процессов, включая биолюминесценцию, синтез антибиотиков, детерминант вирулентности, перенос конъюгативных плазмид (см. главу 5). Такой тип межклеточной коммуникации позволяет индивидуальным бактериям следить за плотностью собственной популяции в окружающей среде, будь то внешняя среда или организм хозяина, и регулировать экспрессию специфических генов. Патогенным бактериям, которые вызывают развитие заболевания, необходимо достичь критической плотности для эффективного распространения и заселения соответствующих ниш в организме хозяина. Патогенные бактерии чувствуют необходимость экспрессии детерминант вирулентности при достижении определенной концентрации. Социальным поведением патогенных бактерий объясняется такое важное для медицины явление, как образование биопленок. Биопленки представляют высокоорганизованные сообщества бактерий, необратимо прикрепленных к субстрату и друг к другу и защищенных продуцируемым этими клетками внеклеточным полимерным матриксом. Они снабжены каналами для водоснабжения, распределения питательных веществ между членами сообщества и удаления отходов жизнедеятельности. Биопленки могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов и состоят из активно функционирующих и покоящихся (некультивируемых) клеток. Образование биопленки является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде, поскольку в составе биопленки они защищены от антибактериальных препаратов, включая антибиотики, дезинфектанты, бактериофаги. Многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования - катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств. Образование биопленки начинается с прикрепления к твердой поверхности отдельной бактериальной клетки, которая выделяет полисахариды. Делящиеся затем клетки образуют микроколонию уже внутри полисахаридного матрикса. Эти микроколонии сливаются или включают в свой состав бактерии этого или другого вида, и процесс заканчивается образованием биопленки. В процессе образования биопленки важная роль принадлежит полярно расположенным пилям IV типа (рис. 3.7). Рис. 3.7. Образование биопленки: 1 - прикрепление к твердой поверхности отдельных бактериальных клеток; 2 - агрегация клеток с участием пилей IV типа; 3 - синтез экзополисахарида 63 3.2. Физиология вирусов Вирусы растут только внутриклеточно, т.е. являются облигатными внутриклеточными паразитами. В клетке они могут находиться в различных состояниях. Нарушения, вызываемые вирусами, весьма разнообразны: от продуктивной инфекции с образованием вирусного потомства и гибелью клетки до продолжительного взаимодействия вируса с клеткой в виде латентной инфекции или злокачественной трансформации клетки. Инфицирование клетки вирусом может иметь следующие последствия: • разрушение клетки (некроз) в результате цитоцидной инфекции, т.е. репродукция вируса приводит к цитоцидному действию (в культуре клеток происходит цитопатический эффект - клетки округляются, отделяются от соседних клеток, образуются многоядерные гигантские клетки, вакуоли и включения); • разрушение клетки (апоптоз) в результате инициации вирусом програмированной клеточной гибели, при этом вирусный репликативный цикл часто прерывается; • разрушение клетки в итоге не самим вирусом, а иммунными реакциями организма; • вирус находится внутри клетки, но не разрушает ее (латентная инфекция); • вирус трансформирует клетку организма в раковую клетку. Хорошо изучены три основных типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и интегративный. Продуктивный тип взаимодействия завершается воспроизводством вирусного потомства - многочисленных вирионов и гибелью зараженных клеток (цитоцидное действие). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитоцидное действие). Абортивный тип взаимодействия не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. Интегративный тип взаимодействия, или вирогения, характеризуется встраиванием (интеграцией), вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместной репликацией. 3.2.1. Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой, т.е. репродукция вируса (от лат. re - повторение,productio - производство), проходит несколько стадий: 1) адсорбция вириона на клеточной мембране; 2) проникновение вириона в клетку, «раздевание» и высвобождение вирусного генома (депротеинизация вируса); 3) синтез вирусных компонентов; 4) сборка реплицированной нуклеиновой кислоты и новых капсидных белков; 5) выход вирусного потомства из клетки. Адсорбция вириона, т.е. его прикрепление к клеточной мембране, - первая стадия репродукции вирусов. Она происходит в результате взаимодействия поверхностных молекул (белковых лигандов) вируса с мембранными рецепторами клеток вирусов. Белки поверхности вирусов, например гликопротеины липопротеиновой оболочки, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Лиганды вирусов и специфические рецепторы клеток имеют различную природу. Так, гемагглютининовые шипы вируса гриппа связываются с сиаловой кислотой в составе гликопротеинов и гликолипидов (ганглиозидов) клеток дыхательных путей. Гликопротеины вируса иммунодефицита человека взаимодействуют с CD4- молекулами и хемокиновыми рецепторами Т-хелперов, моноцитов и дентритных клеток. Капсидные белки вируса полиомиелита 64 связываются с CD155-молекулой, а капсидные белки риновирусов - с ICAM (молекулой адгезии) клеток. На клетке находятся десятки тысяч специфических рецепторов, поэтому на ней могут адсорбироваться десятки и сотни вирионов, но проникают в клетку только определенные вирионы или их содержимое. В основе избирательности поражения вирусами определенных клеток, тканей и органов (так называемого тропизма) лежат специфичность рецепторов поражаемой клетки и возможность развития в ней репродуктивного цикла вируса (пермиссивные условия клетки). Например, вирусы, репродуцирующиеся преимущественно в клетках печени, называются гепатотропными, в нервных клетках - нейротропными, в иммунокомпетентных клетках - иммунотропными и т.д. Проникновение вирусов в клетку возможно в результате рецепторзависимого эндоцитоза или слияния оболочки вируса с клеточной мембраной. Возможно также сочетание этих механизмов. Рецепторзависимый эндоцитоз происходит в результате захватывания и поглощения вириона клеткой: клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячиваются с образованием эндосомы (внутриклеточной вакуоли). Эндоцитоз вирусов осуществляется с помощью везикул, покрытых клатрином («ямки, окаймленные клатрином»). Содержимое эндосомы закисляется, что приводит к слиянию липопротеиновой оболочки сложного вируса с мембраной эндосомы и выходу вирусного нуклеокапсида в цитозоль клетки. Эндосомы объединяются с лизосомами, которые разрушают оставшиеся вирусные компоненты. Пенетрация компонентов вируса в цитозоль обычно происходит в ранних или поздних эндосомах при уменьшенном значении pH. Стали известны новые клатриннезависимые, альтернативные пути соединения вируса с эндосомами. Одним из них может быть макропиноцитоз с образованием крупной вакуоли, окруженной плазматической мембраной, наполненной в основном жидкостью. Другим путем попадания вируса может быть вовлечение эндоплазматического ретикулума. Этот путь начинается с формирования различных везикул (кальвеолярный эндоцитоз). Вируснесущие везикулы, сформированные в плазматической мембране, маленькие (диаметр около 70 нм). В результате проникновение вируса в цитозоль может происходить на уровне плазматической мембраны, эндосомы, кальвеосомы и эндоплазматического ретикулума. Слияние вириона с клеточной мембраной характерно только для некоторых оболочечных вирусов (герпесвирусов, парамиксовирусов, ретровирусов), в составе которых имеются белки слияния. В результате взаимодействия вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны вирусная липопротеиновая оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса попадает в цитозоль клетки. Существует три варианта проникновения безоболочечных вирусов в клетку: мембранный прокол (вирион образует пору в мембране, через которую геном попадает в цитозоль, а капсид в него не попадает; перфорация (капсид переносится через мембрану без основного лизиса мембраны); лизис (вирионы индуцируют поломку мембраны цитоплазматических органелл, что способствует проникновению вируса и его компонентов в цитозоль). Выход безоболочечных (простых) вирусов из эндосомы в цитозоль остается малоизученным. Попав в клетку, вирусы лишаются многих белков («раздевание», или депротеинизация вирусов). В результате депротеинизации удаляются поверхностные структуры вируса и высвобождается его внутренний компонент, способный вызывать инфекционный процесс. Первые этапы «раздевания» вируса начинаются в процессе его проникновения в клетку путем слияния вирусных и клеточных мембран или же при выходе вируса из эндосомы в цитозоль. Последующие этапы «раздевания» вируса тесно взаимосвязаны с их внутриклеточным транспортом к местам депротеинизации. Для разных вирусов существуют свои специализированные участки «раздевания» в клетке: для пикорнавирусов - в цитоплазме с участием лизосом, аппарата Гольджи, для герпесвирусов - околоядерное пространство или поры ядерной мембраны, для аденовирусов - сначала структуры цитоплазмы, а затем ядро клетки. Конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеиновая кислота, нуклеопротеид (нуклеокапсид) или сердцевина вириона. Так, конечным продуктом «раздевания» пикорнавирусов является нуклеиновая кислота, ковалентно 65 связанная с одним из внутренних белков. А у многих оболочечных РНК-содержащих вирусов конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеокапсиды или сердцевины, которые не только не препятствуют экспрессии вирусного генома, а, более того, защищают его от клеточных протеаз и регулируют последующие биосинтетические процессы. Следующей стадией репродукции является синтез белков и нуклеиновых кислот вируса, который разобщен во времени и пространстве. Синтез вирусных белков. В вирусинфицированной клетке синтезируются две группы белков: неструктурные белки, обслуживающие разные этапы репродукции вируса; структурные белки, которые входят в состав вириона (нуклеопротеины, связанные с геномом вируса, капсидные и оболочечные белки). К неструктурным белкам относятся: ферменты синтеза нуклеиновых кислот (РНКили ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и репликацию вирусного генома; белки-регуляторы; предшественники вирусных белков, отличающиеся своей нестабильностью в результате быстрого нарезания на структурные белки; ферменты, модифицирующие вирусные белки, например протеиназы и протеинкиназы. Синтез белков в клетке осуществляется в соответствии с хорошо известными процессами транскрипциипутем «переписывания» генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность иРНК, или мРНК, и трансляции - считывания иРНК на рибосомах с образованием белков. Передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК у разных групп вирусов неодинакова. • ДНК-содержащие вирусы имеют ДНК-геном, транскрибирующийся в ядре клетки с помощью клеточной РНК-полимеразы, в результате чего образуется иРНК, которая транслируется с образованием белка вируса. Особенностью этого процесса является синтез иРНК в ядре с помощью клеточной РНКполимеразы (у аденовирусов, папилломавирусов, герпесвирусов) или в цитоплазме с помощью собственной РНКполимеразы (у поксвирусов). Таким образом, синтез белка реализуется по схеме: геномная ДНК вируса → транскрипция иРНК → трансляция белка вируса. • Плюс-нитевые РНК-содержащие вирусы (пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы) имеют геном, выполняюший функцию иРНК; он распознается и транслируется рибосомами. Белки этих вирусов синтезируются без процесса транскрипции по схеме: геномная РНК вируса - трансляция белка вируса. • Минус-нитевые РНК-содержащие вирусы (минусоднонитевые - ортомиксовирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы и двунитевые - реовирусы) имеют геном, выполняющий роль матрицы, с которой транскрибируется иРНК, при участии РНК-полимеразы, связанной с нуклеиновой кислотой вируса. Синтез белка у них происходит по схеме: геномная РНК вируса - транскрипция иРНК - трансляция белка вируса. • Ретровирусы (ВИЧ, онкогенные ретровирусы) имеют диплоидный геном, состоящий из двух идентичных молекул РНК. В состав ретровируса включена вирионная обратная транскриптаза, или ревертаза, с помощью которой осуществляется процесс обратной транскрипции, т.е. на матрице геномной РНК синтезируется комплементарная однонитевая ДНК. Комплементарная нить ДНК копируется с образованием двунитевой комплементарной ДНК, которая интегрирует в клеточный геном и в его составе транскрибируется в иРНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Синтез белков ретровирусов осуществляется по схеме: геномная РНК вируса - комплементарная ДНК - транскрипция иРНК - трансляция белка вируса. Репликация вирусных геномов, т.е. накопление копий вирусных геномов, которые используются при сборке вирионов в клетке, отличается у вирусов, имеющих двунитевую ДНК, однонитевую ДНК, плюс-однонитевую РНК, минус-однонитевую РНК, двунитевую РНК и идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирусы). • Двунитевые ДНК-вирусы. К ним относятся вирусы, содержащие двунитевую ДНК в линейной (герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или кольцевой (папилломавирусы и 66 полиомавирусы) форме. В репликации вирусных геномов (см. табл. 2.2) участвуют вирусные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (у аденовирусов, герпесвирусов и поксвирусов) или клеточные ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (у папилломавирусов, полиомавирусов и анелловирусов). Двунитевые вирусные ДНК реплицируются обычным полуконсервативным механизмом: после расплетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной нити. У всех вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре. Своеобразный механизм репродукции с включением процесса обратной транскрипции имеют гепаднавирусы (см. ниже). • Однонитевые ДНК-вирусы представлены парвовирусами, которые используют клеточную ДНК-полимеразу для создания двунитевого вирусного генома, так называемой репликативной формы последнего. При этом на исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК, служащая матрицей для синтеза плюс-нити ДНК нового вириона. Параллельно синтезируется иРНК, происходит трансляция вирусных пептидов. • Плюс-однонитевые РНК-вирусы включают большую группу вирусов (пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы), у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию иРНК - матрицы для синтеза белка. На ее основе синтезируется полипротеин, который расщепляется на фрагменты: вирусные РНК-зависимую РНК-полимеразу, протеазы и капсидные белки. Вирусная РНК-полимераза транскрибирует геномную плюс-нить РНК в минус-нить РНК, на матрице которой синтезируется геномная плюс-нить РНК. Вирионы формируются в цитоплазме. • Минус-однонитевые РНК-вирусы (аренавирусы, борнавирусы, рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, филовирусы) имеют вирионную РНК-зависимую РНК- полимеразу. Проникшая в клетку геномная минус-нить РНК трансформируется вирионной РНК- зависимой РНК-полимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК. Неполные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии являются матрицей (промежуточная стадия) для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства. Вирионы формируются в цитоплазме. • Двунитевые РНК-вирусы. Репликация этих вирусов (реовирусы и ротавирусы) сходна с репликацией минус-однонитевых РНК-вирусов. Образовавшиеся в процессе транскрипции плюс- нити РНК не только функционируют как иРНК, но и участвуют в репликации: они являются матрицами для синтеза минус-нитей РНК. Последние в комплексе с плюс-нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК вирионов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот этих вирусов происходит в цитоплазме клеток. • Вирусы с обратной транскрипцией. К обратнотранскрибирующимся вирусам относятся представители семейств Retroviridae и Hepadnaviridae. Ретровирусы, в частности ВИЧ, являются плюс-нитевыми диплоидными РНК-содержащими вирусами. Вирионная обратная транскриптаза ретровирусов синтезирует (на матрице РНК вируса) минус-нить ДНК, с которой копируется плюс- нить ДНК с образованием двойной нити ДНК, замкнутой в кольцо. Далее двойная нить ДНК интегрирует с хромосомой клетки, образуя провирус. В результате транскрипции одной из нитей интегрированной ДНК при участии клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы образуются вирионные РНК. Формирование вирионов. Белки и нуклеиновые кислоты вируса синтезируются в разных частях клетки, вследствии чего этот способ репродукции вирусов получил название дисъюнктивного (от лат. disjunctus - разобщенный). Синтезированные компоненты вириона транспортируются в различные участки ядра или цитоплазмы клетки - места сборки вируса, которая происходит с участием гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия. Формирование вирионов - многоступенчатый процесс с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. Сборка простых вирусов заключается во взаимодействии вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов. У сложных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, которые окружаются модифицированной мембраной клетки (будущей 67 липопротеиновой оболочкой вируса). В процессе сборки вирионов в их структуры включаются отдельные липиды и углеводы клетки-хозяина. Так, формирование вирионов в ядре клетки происходит с участием мембраны ядра, а формирование вирионов в цитоплазме - с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда встраиваются гликопротеины и другие белки оболочки вируса. У ряда сложных минус-нитевых РНК-вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов) в сборку вовлекается матриксный белок (М-белок), расположенный под модифицированной клеточной мембраной - будущей оболочкой вириона. Обладая гидрофобными свойствами, он выполняет роль посредника между нуклеокапсидом и липопротеиновой оболочкой вируса. Выход вирусов из клетки. Продолжительность цикла вирусной репродукции колеблется от 6-8 ч (вирус гриппа, пикорнавирусы) до более чем 40 ч (некоторые герпесвирусы). Вирусное потомство составляет 10-1000 зрелых вирионов и в несколько раз большее количество дефектных вирионов. Репродукция вирусов заканчивается выходом их из клетки, который происходит взрывным путем почкованием или экзоцитозом. • Взрывной путь характерен для простых (безоболочечных) вирусов: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. • Почкование, экзоцитоз присущи сложным вирусам, имеющим липопротеиновую оболочку, которая является производной от клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокапсид или сердцевина вириона транспортируется к участкам клеточных мембран, в которые уже встроены вирусспецифические белки, после чего начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся почка отделяется от клетки в виде сложного вируса, а клетка может длительно оставаться жизнеспособной, продуцируя вирусное потомство. Вирусы, формирующиеся в ядре клетки (например, герпесвирусы) почкуются в перинуклеарное пространство через модифицированную ядерную мембрану, приобретая таким образом липопротеиновую оболочку. Затем они транспортируются в составе цитоплазматических везикул на поверхность клетки. Почкование вирусов, формирующихся в цитоплазме, может происходить либо через плазматическую мембрану (например, парамиксовирусы, тогавирусы), либо через мембраны эндоплазматической сети с последующим их выходом на поверхность клетки (буньявирусы). |