Мед. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология т-1, Звере. 2016 2 Библиография Медицинская микробиология,вирусология и иммунология в 2 т. Том Электронный ресурс
 Скачать 4.99 Mb.
|
|
3.2.2. Программируемая клеточная смерть (апоптоз) Вирусы могут вызывать апоптоз инфицированной клетки, предотвращая распространение инфекционного процесса на другие клетки. С другой стороны, многие вирусы имеют механизмы, предотвращающие апоптоз клетки. Так, некоторые ДНК-вирусы кодируют белки, сходные с клеточнымиBcl-2-белками, контролирующими апоптоз в результате усиления клеточной пролиферации. 3.2.3. Непродуктивные инфекции Иногда вирус заражает клетку, но его репродукция не завершается. Если вирусный геном персистирует в клетке, то говорят о латентной инфекции. Латентная инфекция поддерживается в инфицированной клетке в виде последовательности вирусной ДНК, интегрированной в геном клетки, или в виде множественных копий ковалентно замкнутой циркулярной ДНК вируса. Например, герпесвирусы обычно вызывают латентные инфекции, при которых вирусный геном поддерживается как циркулярная эписома в ядре, экспрессируя только несколько вирусных генов и не образуя инфекционного вируса. В эукариотической клетке вирусная ДНК связана с гистонами этой клетки, которые играют стабилизирующую роль в латенции. 68 Абортивный тип взаимодействия вирусов с клеткой не завершается образованием вирусного потомства. Причины развития абортивного типа разнообразны: заражение чувствительных клеток дефектными вирусами или дефектными вирионами; заражение стандартным вирусом генетически резистентных к нему клеток; заражение стандартным вирусом чувствительных клеток в непермиссивных (неразрешающих) условиях. Различают дефектные вирусы и дефектные вирионы. • Дефектные вирусы существуют как самостоятельные виды, которые репродуцируются лишь при наличии вируса-помощника (например, вирус гепатита D репродуцируется только в присутствии вируса гепатита B). • Дефектные вирионы обычно лишены части генетического материала и могут накапливаться в популяции многих вирусов при множественном заражении клеток. Имеются дефектные интерферирующие частицы (ДИ-частицы), которые интерферируют с репродукцией стандартного вируса и подавляют воспроизводство вирусного потомства. Таким образом, ДИ- частицы могут защищать организм от болезнетворного вируса. Абортивный тип взаимодействия чаще наблюдается при заражении непермиссивных (нечувствительных) клеток стандартным вирусом. Механизм генетически обусловленной резистентности клеток к вирусам широко варьирует. Он может быть связан: с отсутствием на плазматической мембране специфических рецепторов для вирусов; неспособностью данного вида клеток инициировать трансляцию вирусной иРНК; отсутствием специфических протеаз или нуклеаз, необходимых для синтеза вирусных макромолекул и т.д. Абортивный тип взаимодействия может также возникать при изменении условий, в которых происходит репродукция вирусов: повышение температуры организма, изменение рН в очаге воспаления, введение в организм противовирусных препаратов и др. Некоторые абортивные инфекции могут приводить к уничтожению клетки хозяина. При устранении неразрешающих условий абортивный тип переходит в продуктивный тип взаимодействия вирусов с клеткой. Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой (вирогения) заключается во взаимном сосуществовании вируса и клетки в результате интеграции (встраивания) генома вируса в хромосому клетки хозяина. При этом интегрированный геном вируса реплицируется и функционирует как составная часть генома клетки. Интегративный тип взаимодействия характерен для умеренных ДНК-содержащих бактериофагов, онкогенных вирусов и некоторых инфекционных как ДНК-содержащих (например, вируса гепатита В), так и РНК-содержащих (например, ВИЧ) вирусов. С геномом клетки интегрирует двунитевая ДНК вируса в кольцевой форме, которая прикрепляется к клеточной ДНК в месте гомологии нуклеотидных последовательностей и встраивается в определенный участок хромосомы при участии ферментов (рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз). Более сложным является процесс интеграции у РНК-содержащих вирусов. Он начинается с механизма обратной транскрипции, который заключается в синтезе комплементарной нити ДНК на матрице вирусной РНК с помощью вирионной обратной транскриптазы (ревертазы). После образования двунитевой ДНК и замыкания ее в кольцо происходит интеграция ДНК-транскрипта в хромосому клетки. Встроенная в хромосому клетки ДНК вируса называется провирусом, или провирусной ДНК. Провирус реплицируется в составе хромосомы и переходит в геном дочерних клеток, т.е. состояние вирогении наследуется. Однако под влиянием некоторых физических или химических факторов провирус может исключаться из хромосомы клетки и переходить в автономное состояние с развитием продуктивного типа взаимодействия с клеткой. Дополнительная генетическая информация провируса при вирогении сообщает клетке новые свойства, что может быть причиной онкогенной трансформации клеток и развития опухолей, а также развития аутоиммунных и хронических заболеваний. Сохранение вирусной информации в виде провируса в составе клеточного генома и передача ее потомству лежат в 69 основе персистенции (от лат. persistentia - упорство, постоянство) вирусов в организме и развития латентных (скрытых) вирусных инфекций. 3.3. Культивирование вирусов Вирусы культивируют для лабораторной диагностики вирусных инфекций, изучения патогенеза и иммунитета при вирусных инфекциях, а также для получения вакцин и диагностических препаратов. Поскольку вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, их культивируют в организме лабораторных животных, развивающихся куриных эмбрионах и других птиц, а также на культурах клеток (тканей). Присутствие вируса в исследуемом материале определяют с помощью методов индикации и идентификации. Индикация вирусов, т.е. неспецифическое обнаружение факта инфицирования, основано на выявлении биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками. Идентификация означает установление вида или типа вируса. Она осуществляется в основном с помощью иммунных реакций или молекулярногенетических методов (ПЦР и др.). Вирусы можно культивировать в организме восприимчивых к ним лабораторных животных (белые мыши, хомячки, кролики, обезьяны и др.), которых заражают вируссодержащим материалом различными способами в зависимости от тропизма вирусов (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально и т.д.). Наличие вирусов выявляют по развитию у животных клинических проявлений заболевания, патоморфологическим изменениям органов и тканей, а также на основании реакции гемагглютинации (РГА) с вируссодержащим материалом. РГА основана на способности многих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты своими гликопротеиновыми шипами (гемагглютининами). Другой моделью культивирования вирусов являются куриные эмбрионы (5-12-дневные), которых заражают исследуемым материалом в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Свидетельством репродукции вирусов в куриных эмбрионах являются специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), гибель эмбриона, положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, полученной из полостей зараженного зародыша. Часто вирусы культивируют на культуре клеток. Метод культур клеток был впервые разработан в 1949 г. Дж. Эндерсом и соавт., получившими за разработку техники культивирования вируса полиомиелита Нобелевскую премию в 1954 г. Изолированные клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Широко распространены культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих по сравнению с нормальными клетками взрослого организма более активной способностью к росту и размножению. Культуры клеток обычно состоят из одного-двух основных типов клеток. Так, фибробласты имеют вытянутую форму, тогда как эпителиальные клетки имеют многоугольную форму. Культуру клеток выращивают с соблюдением оптимальной температуры (36-38,5 °С) роста клеток и асептических условий в специальной лабораторной посуде (пробирки, флаконы, матрасы) или в реакторах для получения биотехнологической продукции. При этом используют сложную питательную среду Игла, среду 199 и другие среды, содержащие необходимые для роста клеток аминокислоты, минеральные соли, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные растворы для поддержания стабильного рН. Для подавления роста посторонней микрофлоры в среды для культивирования клеток добавляют антибиотики. Различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток. Клетки однослойной культуры клеток прикрепляются и размножаются на поверхности лабораторной посуды в виде 70 монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии. Клетки суспензионных культур клеток размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или вращающегося барабана. Метод применяют для получения большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин. Органные культуры применяются ограниченно. Они представляют собой цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие при культивировании исходную структуру. По свойствам жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на первичные, или первично-трипсинизированные, перевиваемые, или стабильные и полуперививаемые. Первичные культуры клеток размножаются только в первых генерациях, т.е. выдерживают не более 5-10 пассажей после выделения из тканей. Их получают при обработке кусочков тканей (эмбриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, которые разрушают межклеточные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток. Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т.е. выдерживают многочисленные пассажи. Их получают преимущественно из опухолевых или эмбриональных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культурами: продолжительность их культивирования, высокая скорость размножения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном состоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злокачественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клетками в процессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида культур, в частности их нельзя применять в производстве вирусных вакцин. Полуперививаемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40-50 пассажей. Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, характерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественную трансформацию. Поэтому полуперививаемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин. О репродукции вирусов в культуре клеток, зараженных вируссодержащим материалом, можно судить на основании следующих феноменов: цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, или цитопатического эффекта (ЦПЭ), образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакций гемадсорбции и гемагглютинации; цветной реакции. ЦПД, или ЦПЭ, - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов. В зависимости от особенностей репродуцирующихся вирусов ЦПД может различаться. В одних случаях быстро вакуолизируется цитоплазма, разрушаются митохондрии, округляются и гибнут клетки, в других формируются гигантские многоядерные клетки (так называемые симпласты) или наблюдается явление клеточной пролиферации, которое в итоге заканчивается деструкцией клеток. Таким образом, характер ЦПД позволяет использовать этот феномен не только для индикации вирусов, но и для их ориентировочной идентификации в культуре клеток. Другим проявлением ЦПЭ является образование внутриклеточных включений в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Часто включения представляют собой скопления вирионов или их компонентов, иногда они могут содержать клеточный материал. Выявляют включения с помощью светового или люминесцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами. Включения могут отличаться по величине (от 0,2 до 25 мкм), форме (округлые или неправильные) и численности (одиночные и множественные). Характерные цитоплазматические включения формируются в клетках, инфицированных вирусом натуральной оспы (тельца Гварниери), бешенства (тельца Бабеша- Негри), а внутриядерные включения - при заражении аденовирусами или вирусами герпеса. 71 Бляшки, или негативные, колонии представляют собой ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культур клеток (рис. 3.8). Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая бляшка образуется потомством одного вириона. Подсчитав количество бляшек, можно определить концентрацию вирусов в исследуемом материале. Кроме того, бляшки разных групп вирусов отличаются по размеру, форме, срокам появления. Поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для селекции штаммов и получения чистых линий вирусов. Однако не все вирусы могут вызывать цитопатический эффект, тогда их выявляют другими методами. Рис. 3.8. Образование «бляшек» в культуре клеток, зараженных вирусом В основе реакции гемадсорбции лежит способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Целый ряд вирусов (гриппа, парагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для индикации этих вирусов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток. Механизмы реакции гемадсорбции и гемагглютинации сходны. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых вирусов в культуре клеток можно использовать реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью, т.е. с питательной средой, содержащей размножившиеся вирусы. Присутствие в культуре клеток популяции вирусов можно также выявить с помощью цветной реакции,которая регистрируется по цвету индикатора питательной среды для культур клеток. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут) и среда сохраняет свой первоначальный цвет. Если же вирусы не размножаются в культуре клеток, то клетки, оставаясь жизнеспособными, в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие рН среды и соответственно цвета индикатора. 72 3.4. Бактериофаги (вирусы бактерий) Бактериофаги (от «бактерия» и греч. phagos - пожирающий) - вирусы, специфически проникающие в бактерии, использующие их биосинтетические системы для своей репродукции и вызывающие их лизис (растворение, разрушение клеток). Впервые явление самопроизвольного лизиса сибиреязвенных бактерий наблюдал один из основоположников отечественной микробиологии Н.Ф. Гамалея (1898). Английский бактериолог Ф. Туорт (1915) описал способность фильтрата стафилококков растворять свежую культуру этих же бактерий. Однако лишь французский ученый Ф. д'Эрелль (1917) правильно оценил это явление, выделив фильтрующийся литический агент из испражнений больных дизентерией. Добавление литического агента к мутной бульонной культуре дизентерийных бактерий приводило к полному просветлению среды. Аналогичный эффект д'Эррель наблюдал и на плотных питательных средах, засеянных смесью литического агента с соответствующими бактериями. На фоне сплошного бактериального роста появлялись стерильные пятна круглой или неправильной формы - участки лизиса бактерий, названные негативными колониями, или бляшками. Предположив, что имеет дело с вирусами, д'Эрелль выделил этот литический агент с помощью бактериальных фильтров и назвал его бактериофагом - пожирателем бактерий. Бактериофаги широко распространены в природе. Они обнаружены в воде, почве, пищевых продуктах, различных выделениях из организма людей и животных (фекалии, моча, мокрота, гной и т.д.). Особенно большое количество бактериофагов выделяется в период выздоровления больного человека. В настоящее время эти вирусы выявлены у большинства бактерий, а также у некоторых других микроорганизмов, в частности у грибов. Поэтому бактериофаги в широком смысле слова часто называют просто фагами. Бактериофаги принято обозначать буквами латинского, греческого или русского алфавита, часто с цифровым индексом, перед которым стоит название вида бактерий (например, фаги Е. coli T2). Для обозначения группы родственных фагов используют родовые и видовые названия микробов, из которых выделены соответствующие фаги: колифаги, стафилофаги, актинофаги, микофаги и т.д. Морфология и химический состав. Морфологию бактериофагов изучают с помощью электронной микроскопии. Фаги, как и просто организованные вирусы человека, состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белковой оболочки - капсида. Однако между собой они в значительной степени различаются по морфологии. В зависимости от формы, структурной организации и типа нуклеиновой кислоты фаги подразделяют на несколько морфологических типов (рис. 3.9). К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, взаимодействующие с мужскими особями бактерий (см. раздел 2.2 и главу 5). Геном фагов представлен однонитевой ДНК, заключенной в спиральный капсид. II тип включает мелкие РНК-содержащие и однонитевые ДНК-содержащие фаги, геном которых находится внутри икосаэдрического капсида (головки) с аналогом отростка. К III типу относятся икосаэдрические фаги с коротким отростком, содержащие двунитевую ДНК. IV и V типы - сложные по морфологии ДНК-содержащие фаги, имеющие форму сперматозоида: икосаэдрический капсид головки соединен с длинным хвостовым отростком. V тип фагов отличается от VI типа тем, что чехол их отростков способен к сокращению. Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм (нитевидный тип). 73 Рис. 3.9. Морфологические типы бактериофагов (объяснение в тексте) Рис. 3.10. Строение Т-четного фага (электронограмма) 74 Наиболее изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида и сокращающийся чехол отростка (рис. 3.10), например колифаги T2, Т4, Т6 (от англ. type - типовые). У этих фагов молекула двунитевой суперспирализованной ДНК находится внутри головки размером 65-100 нм и защищена капсидом. Капсид состоит из белковых молекул - идентичных полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (кубическому) типу симметрии. В состав головки также входит полипептид, состоящий из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный белок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК. Хвостовой отросток длиной более 100 нм имеет внутри полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, а снаружи - чехол (футляр), способный к сокращению наподобие мышцы. Чехол хвостового отростка образован белковыми субъединицами, уложенными по спиральному типу симметрии, содержит АТФ и ионы Ca. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная пластинка с шипами, от которых отходят нитевидные структуры - фибриллы. У некоторых фагов (например, T2) в дистальной части отростка содержится фермент лизоцим. Антигенные свойства. Бактериофаги содержат группоспецифические и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, вызывая синтез специфических антител в организме. Антитела, взаимодействуя с бактериофагами, могут нейтрализовать их литическую активность в отношении бактерий. По типоспецифическим антигенам фаги делят на серотипы. Резистентность. По сравнению с вирусами человека бактериофаги более устойчивы к факторам окружающей среды. Они инактивируются под действием температуры 65-70 °С, УФ- облучения в высоких дозах, ионизирующей радиации, формалина и кислот. Длительно сохраняются при низкой температуре и высушивании. Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой. Взаимодействие фагов с бактериями может протекать, как и у других вирусов, по продуктивному, абортивному и интегративному типам. При продуктивномтипе взаимодействия образуется фаговое потомство, бактерии лизируются; при абортивном типе фаговое потомство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность, при интегративномтипе геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней. В зависимости от типа взаимодействия различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Проникнув в бактерию, они репродуцируются с образованием 200-300 новых фаговых частиц и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия с бактериями в достаточной мере изучен у бактериофагов, имеющих отросток с сокращающимся чехлом. Он состоит из последовательно сменяющих друг друга стадий и весьма схож с процессом взаимодействия вирусов человека и животных с клеткой хозяина. Однако имеются и некоторые особенности. Специфическая адсорбция фагов происходит только при соответствии прикрепительных белков вирусов и рецепторов бактериальной клетки липополисахаридной или липопротеиновой природы, находящихся в ее клеточной стенке. На бактериях, лишенных клеточной стенки (протопласты, сферопласты), бактериофаги не могут адсорбироваться. Фаги, имеющие хвостовой отросток, прикрепляются к бактериальной клетке свободным концом отростка (фибриллами базальной пластинки). В результате активации АТФ чехол хвостового отростка сокращается и стержень с помощью лизоцима, растворяющего прилегающий фрагмент клеточной стенки, как бы просверливает оболочку клетки. При этом ДНК фага, содержащаяся в его головке, проходит в форме нити через канал хвостового стержня и инъецируется в клетку, а капсидные оболочки фага остаются снаружи бактерии. Инъецированная внутрь бактерии нуклеиновая кислота подавляет биосинтез компонентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки фага. Процесс синтеза вирусных 75 белков и репликация фаговых геномов в бактериальной клетке аналогичны процессу репродукции других вирусов, содержащих двунитевую ДНК. РНК-полимераза клетки транскрибирует некоторые гены фаговой ДНК, в результате чего образуются ранние иРНК. Рибосомы клетки транслируют иРНК, при этом синтезируется целый ряд ферментов, включая те, которые необходимы для репликации фаговой ДНК. Репликация двунитевой ДНК фагов протекает в соответствии с общим механизмом репликации. После начала репликации фаговой ДНК начинается синтез поздних вирусных иРНК, в результате трансляции которых образуется второй набор вирусспецифических белков, в том числе капсидных белков фагов. После образования компонентов фага происходит самосборка частиц: сначала пустотелые капсиды головок заполняются нуклеиновой кислотой, затем сформированные головки соединяются с хвостовыми отростками. При литической инфекции в клетке появляется еще один поздний вирусспецифический белок - фаговый лизоцим. Этот фермент воздействует на пептидогликановый слой стенки бактерии, делая ее менее прочной. В конце концов под действием внутриклеточного осмотического давления оболочка клетки разрывается и фаговое потомство выходит в окружающую среду вместе с остальным содержимым бактериальной клетки. Весь литический цикл от адсорбции бактериофага на бактерии до его выхода из нее занимает 20-40 мин. У некоторых фагов механизм адсорбции, проникновения и высвобождения из клеток совершенно иной. Например, у нитевидных фагов на концах капсидной оболочки имеются минорные белки, с помощью которых эти фаги прикрепляются к половым пилям бактерии (см. главу 5). Фаговая ДНК вместе с минорным белком проникают в цитоплазму клетки через ее половые пили. После репликации нуклеиновой кислоты фагов вновь синтезированные белки фаговой оболочки располагаются на клеточной мембране. Сборка и высвобождение нитевидных фагов происходят путем просачивания ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, во время которого они приобретают белковые капсиды. Бактериальная клетка при этом сохраняет свою жизнеспособность. Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности, что явилось основанием для подразделения их на поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными типами (вариантами) данного вида бактерий. Умеренные бактериофаги, в отличие от вирулентных, взаимодействуют с чувствительными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет в той же последовательности, что и у вирулентных фагов, и заканчивается лизисом клетки. При интегративном типе взаимодействия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, причем в строго определенную гомологическую область хромосомы, реплицируется синхронно с геномом размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий, содержащих профаг, - лизогенной. Само же биологическое явление сосуществования бактерии и умеренного бактериофага носит название лизогении (от греч. lysis - разложение, genea - происхождение). Профаг, ставший частью хромосомы размножающейся бактерии, передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Лизогенные бактерии не образуют структурные вирусные белки и, следовательно, фаговое потомство. В основе сдерживающего механизма репродукции фагов лежит образование в бактерии специфического репрессора -- низкомолекулярного белка, подавляющего траскрипцию фаговых генов. Биосинтез репрессора детерминируется генами профага. Наличием репрессора можно объяснить способность лизогенных бактерий прибретать иммунитет (невосприимчивость) к последующему заражению гомологичными или близкородственными фагами. Под иммунитетом в данном случае понимается такое состояние бактерии, при котором исключаются процесс вегетативного размножения вышеуказанных фагов и лизис клетки. Однако термин «лизогения» 76 отражает потенциальную возможность лизиса бактерии, содержащей профаг. Действительно, профаги некоторой части лизогенной культуры бактерий могут спонтанно (самопроизвольно) или направленно под действием ряда физических или химических факторов дерепрессироваться, исключаться из хромосомы и переходить в вегетативное состояние. Этот процесс заканчивается продукцией фагов и лизисом бактерий. Частота спонтанного лизиса бактерий в лизогенных культурах весьма незначительна. Частоту лизиса бактерий можно значительно увеличить, воздействуя на лизогенную культуру индуцирующими агентами: УФ-лучами, ионизирующим излучением, перекисными соединениями, митомицином С и др. Сам же феномен воздействия, приводящий к инактивации репрессора, называется индукцией профага. Явление индукции используют в генетической инженерии. Однако спонтанный лизис лизогенных культур может нанести вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ - оказываются лизогенными, существует опасность перехода фага в вегетативное состояние, что приведет к лизису производственного штамма этого микроба. Геном профага может придавать бактерии новые, ранее отсутствовавшие у нее свойства. Этот феномен изменения свойств микроорганизмов под влиянием профага получил название фаговой конверсии (от лат. conversion - превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, только лизогенные культуры дифтерийной палочки способны вызвать болезнь (дифтерию), так как содержат в хромосоме профаг, ответственный за синтез белкового экзотоксина. Умеренные фаги могут быть дефектными, т.е. неспособными образовывать зрелые фаговые частицы ни в естественных условиях, ни при индукции. Геном некоторых умеренных фагов (Р1) может находиться в цитоплазме бактериальной клетки в так называемой плазмидной форме, не включаясь в ее хромосому. Такого рода умеренные фаги используют в качестве векторов в генетической инженерии. Практическое применение фагов. Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т.е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку Петри с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, бляшки или негативной колонии). Метод фаготипирования позволяет выявить источник инфекции и проследить путь возбудителя от источника до восприимчивого организма (эпидемиологическое маркирование). По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при санитарномикробиологическом исследовании воды. Например, в системах из поверхностных источников воды перед подачей ее в распределительную сеть определяют наличие колифагов. Колифаги являются одними из санитарно-показательных микробов, характеризующих фекальное загрязнение воды. Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных, чаще всего кишечных инфекций. Производят брюшнотифозный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей. Отличительной чертой фагов является полное отсутствие у них побочного действия. Однако лечебный и профилактический эффект фагов умеренный, поэтому их необходимо применять в комплексе с другими лечебными и профилактическими мероприятиями. Бактериофаги широко применяют в генетической инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК. 77 Задания для самоподготовки (самоконтроля) A. Назовите процесс, при котором бактерии получают энергию путем ферментации глюкозы: 1. Гниение. 2. Брожение. 3. Денитрофикация. 4. Анаэробное дыхание. Б. Большинство болезнетворных бактерий, называемых мезофилами, растут при температуре: 1. 15-20 °С. 2. 20-30 °С. 3. 30-37 °С 4. 50-55 °С. B. Назовите процесс, при котором в присутствии кислорода происходит минерализация белка: 1. Денитрофикация. 2. Брожение. 3. Лиофилизация. 4. Гниение. Г. Назовите механизм, который используется бактериями для доставки внутрь цитозоля клетки эффекторных молекул: 1. Активный транспорт. 2. Секреция по III типу. 3. Секреция по II типу. 4. Транслокация радикалов. Д. Некоторые вирусы в составе своих вирионов имеют РНКзависимую РНК-полимеразу. Назовите тип нуклеиновой кислоты этих вирусов: 1. Двунитевая ДНК кольцевой формы. 2. Плюс-однонитевая РНК. 3. Минус-однонитевая РНК. 4. Двунитевая ДНК линейная. Е. Назовите последствия интегративного типа взаимодействия вируса и клетки: 1. Вирусоносительство. 2. Трансформация клетки. 3. Гибель клетки. 4. Образование нового поколения вирионов. Ж. Взвесь культуры E. coli была засеяна в 2 колбы, одна из которых содержала среду ? 1, а другая - среду ? 2. Посевы были поставлены в термостат с температурой 37 °С. Каждый час отбирали пробы для определения плотности бактериальной популяции, на основании чего были построены кривые роста, которые показали, что продолжительность лаг-фазы в среде ? 1 равнялась 20 мин, а в среде ? 2 - 50 мин. Назовите более эффективную среду. 78 З. На 3 чашки с кровяным агаром был произведен посев 4 бактериальных культур: А, Б, В, Г. Чашка ? 1 была поставлена в термостат с температурой 37 °С. Чашка ? 2 была помещена в анаэростат, из которого откачали воздух, и поставили в термостат с температурой 37 °С. Чашка ? 3 была поставлена в СО 2 -инкубатор с температурой 37 °С. Через сутки инкубации были получены следующие результаты. Бактериальная культура А выросла на всех 3 чашках. Бактериальная культура Б выросла только на чашке ? 3 (культивирование в атмосфере 5% СО 2 ). Бактериальная культура В выросла только на чашке ? 1. Бактериальная культура Г выросла только на чашке ? 2. Охарактеризуйте каждый тип культур. Ответ обоснуйте. |