Билет. 1 билет. 3 билет 4билет 5 билет
 Скачать 7.84 Mb.
|
|
Ферментативный гидролиз важен тем, что протекает селективно, т.е. позволяет расщеплять строго определенные участки пептидной цепи. При медленном, осторожном ферментативном гидролизе белков получаются промежуточные продукты, которые удалось выделить. Это пептоны и полипептиды. Пептоны – это сложно построенные вещества, по ряду свойств еще близкие к белкам, но обладающие уже гораздо меньшим молекулярным весом. Пептоны представляют собой смеси высокомолекулярных продуктов расщепления белков, подобно тому как декстрины представляют собой высокомолекулярные промежуточные продукты гидролиза высшего полисахарида – крахмала. Полипептиды – цепи из многих остатков аминокислот, соединенных пептидной связью. Среди продуктов осторожного гидролиза удалось выделить дипептиды, трипептиды и полипептиды. Которые представляют собой части белковой молекулы, оставшиеся при мягких условиях еще не гидролизованными. РЕАКЦИЯ ПИОТРОВСКОГО (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ) Биуретовая реакция – это качественная реакция на обнаружение белков с фиолетовым окрашиванием при действии солей меди (II) (медного купороса) в щелочном растворе. Белок + CuSO4 + NaOH -----> красно-фиолетовое окрашивание. РЕАКЦИЯ РУЭМАННА (НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ) a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции. Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов. Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах. При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге. Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов. Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения. Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника (катионита, анионита) и на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп. Для органических ионов на электростатическое взаимодействие с фиксированными зарядами ионита накладывается гидрофобное взаимодействие органической части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание органических ионов и добиться оптимальной селективности их разделения, к водному элюенту добавляют органический компонент (1–25% метанола, изопропанола, ацетонитрила). 4. Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация. Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрическогозаряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда.Понятие изоэлектрической точки белков. Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация Физико-химические свойства белков: - высокая вязкость растворов; - незначительная диффузия; - способность к набуханию в больших пределах; -оптическая активность; -подвижность в электрическом поле; - низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление; - способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм. Белки как и аминокислоты амфотерны. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза. Так же они обладают ярко-выраженными гидрофильными свойствами. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемую искусственную мембрану ( целлофан, пергамент) Различия белков по форме молекул Глобулярный и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы спрятаны в гидрофобное ядро, растворяются в воде. Фибриллярные белки имеют вытянутую нитевидную структуру,не растворяются в воде. Различия белков по молекулярной массе Белки – ВМС от 6000 до 1 000 000 и выше Молекулярная масса белка зависит от количества аминокисотных остатков в полипетидной цепи, а для олигомерных белков – и от количества входящих в него протомеров ( субъединиц) Ионизация или суммарный заряд белков Благодаря наличию в своем составе свободных амино- и карбоксильных групп белки являются полиэлектролитами (амфотерными электролитами). Белки в растворах находятся преимущественно в виде биполярных ионов (цвиттерионов, амфионов). При этом свободные карбоксильные группы белков оказываются диссоциированными (_-СОО-), а свободные аминогруппы оказываются протонироваными (-NН3+). Таким образом, ионизация белков является следствием диссоциации свободных карбоксильных групп и протонирования свободных аминогрупп. В свою очередь степень ионизации зависит от рН среды Гидратация Большинство глобулярных белков относятся к гидрофильным веществам, хорошо растворяющимся в воде. Это свойство обусловлено расположенными на поверхности белка группами, способными гидратироваться. Под гидратацией понимается связывание диполей воды с ионными и полярными группами белка, такими как -СОО` , -NН3+, -СОNH2, -OH, -SH , в результате чего образуется гидратная оболочка белков (рис. 1.3). Благодаря этому каждая молекула белка покрывается несколькими молекулярными слоями воды, т.е. одна молекула белка отделена от другой слоем воды и находится в состоянии истинного раствора. Растворимость Зависит от всех перечисленных свойств, определяется составом растворителя и наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков. При изучении химического состава белка было установлено, что в его молекуле имеются свободные аминные (NH2) и карбоксильные (СООН) группы, которые в растворе находятся в виде NH3 и СООН. Следовательно, белки в растворе обладают амфотерными свойствами (амфолит, амфион). При пропускании электрического тока белки будут передвигаться в зависимости от заряда белковой молекулы к катоду или аноду. Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрического заряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда. Понятие изоэлектрической точки белков. При изучении химического состава белка было установлено, что в его молекуле имеются свободные аминные (NH2) и карбоксильные (СООН) группы, которые в растворе находятся в виде NH3 и СООН. Следовательно, белки в растворе обладают амфотерными свойствами (амфолит, амфион). При пропускании электрического тока белки будут передвигаться в зависимости от заряда белковой молекулы к катоду или аноду.  Таким образом, фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов, или значение рН среды. При повышении концентрации водородных ионов (среда кислая - рН 0-7) белок становится катионом, при ее понижении (среда щелочная- рН 7 -14), наоборот, белковые частицы становятся анионами. Такая способность белка проявлять или кислотные, или щелочные свойства характеризует его как амфотерное соединение. Однако при определенных значениях рН число положительных зарядов белка будет равно числу отрицательных и заряд молекулы в целом будет практически равен нулю. Белковая молекула не будет перемещаться в электрическом поле. При этих условиях белок находится в изоэлектрическом состоянии; рН раствора, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой. Изоэлектрическая точка большинства природных белков лежит в слабокислой среде (рН 4,8-5,4). Молекула таких белков содержит больше карбоксильных групп, чем аминных. Это свидетельствует о том, что в их составе содержится больше дикарбоновых аминокислот. В изоэлектрической точке белок находится в наименее устойчивом состоянии и при незначительных изменениях рН среды в кислую или щелочную сторону он легко выпадает в осадок. Амфотерность белков лежит в основе белковой буферной системы, которая участвует в поддержании определенной реакции среды крови. Амфотерные свойства белков используются для разделения их на отдельные фракции (метод электрофореза) с целью диагностики различных заболеваний и контроля за состоянием больного. 2) 41.Строение и номенклатура основных пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Первичная структура ДНК и основных разновидностей РНК. Вторичная и третичная структура ДНК и РНК. В каждом живом организме присутствуют 2 типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК и РНК состоят из мономерных единиц - нуклеотидов, поэтому нуклеиновые кислоты называют полинуклеотидами. А. Строение нуклеотидов Каждый нуклеотид содержит 3 химически различных компонента: гетероциклическое азотистое основание, углевод (пентозу) остаток фосфорной кислоты. Нуклеотиды, содержащие пуриновые основания (аденин, гуанин) называют пуриновыми нуклеотидами. Нуклеотиды, содержащие пиримидиновые основания (цитозин; тимин, в молекуле РНК вместо тимина - урацил) называют пиримидиновыми нуклеотидами. Пентозы в нуклеотидах представлены либо рибозой (в составе РНК), либо дезоксирибозой (в составе ДНК). Нуклеотиды, в которых пентоза представлена рибозой, называют рибонуклеотидами, а нуклеиновые кислоты, построенные из рибонуклеотидов, - рибонуклеиновыми кислотами, или РНК. Нуклеиновые кислоты, в мономеры которых входит дезоксирибоза, называют дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или ДНК.  Уникальность структуры и функциональная индивидуальность молекул ДНК и РНКопределяются их первичной структурой -последовательностью азотистых оснований в полинуклеотидной цепи.Первичная структура ДНК - порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи. Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, а на 3'-конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5'- и 3'-концами. Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращённо записывают с помощью однобуквенного кода, например -A-G-C-T-T-A-C-A- от 5'- к 3’-концу. Связь между мономерами обозначают 3', 5'-фосфодиэфирной. В каждом мономере нуклеиновой кислоты присутствует остаток фосфорной кислоты. При рН 7 фосфатная группа полностью ионизирована, поэтому in vivo нуклеиновые кислоты имеют множественный отрицательный заряд. Остатки пентоз тоже проявляют гидрофильные свойства. Азотистые основания почти нерастворимы в воде, но некоторые атомы пуринового и пиримидинового циклов способны образовывать водородные связи. Вторичная структура ДНК. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная, полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельный т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3'→5', то вторая - в направлении 5'→3'. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счёт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи). Последовательность нуклеотидов одной цепи полностью комплементарна последовательности нуклеотидов второй цепи. Поэтому, согласно правилу Чаргаффа, число пуриновых оснований (А + G) равно числу пиримидиновых оснований (Т + С). Комплементарые основания уложены в стопку в сердцевине спирали. Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникают гидрофобные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль. Третичная структура ДНК (суперспирализация ДНК) Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится 46 хромосом. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определёнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином. Гистоны - белки содержащие много остатков аргинина и лизина. Благодаря положительному заряду гистоны образуют ионные связи с отрицательно заряженными фосфатными группами, расположенными на внешней стороне двойной спирали ДНК. Молекула ДНК "накручивается" на поверхность гистонового октамера, Такой комплекс гистоновых белков с ДНК служит основной структурной единицей хроматина, её называют "нуклеосома". ДНК, связывающую нуклеосомные частицы, называют линкерной ДНК. В среднем линкерная ДНК составляет 60 пар нуклеотидных остатков. Негистоновые белки хроматина В ядре эукариотической клетки присутствуют сотни самых разнообразных ДНК-связывающих негистоновых белков. Каждый белок комплементарен определённой последовательности нуклеотидов ДНК. К негистоновым белкам принадлежат ферменты репликации, транскрипции и репарации. При участии структурных, регуляторных белков и ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить нуклеосом преобразуется в высококонденсированный комплекс белков и ДНК. Образованная структура в 10 000 раз короче исходной молекулы ДНК. Первичная структура РНК - порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной цепи. В РНК, как и в ДНК, нуклеотиды связаны между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями. Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5'-углеродного атома, на другом конце - ОН-группа 3'-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5'- и 3'-концами цепи РНК. Вторичная структура РНК Молекула рибонуклеиновой кислоты построена из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки цепи РНК образуют спирализованные петли - "шпильки", за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями A-U и G-C. Участки цепи РНК в таких спиральных структурах антипараллельны, но не всегда полностью комплементарны, в них встречаются неспаренные нуклеотидные остатки или даже одноцепочечные петли, не вписьюающиеся в двойную спираль. Наличие спирализованных участков характерно для всех типов РНК. Третичная структура РНК Одноцепочечные РНК характеризуются компактной и упорядоченной третичной структурой, возникающей путём взаимодействия спирализованных элементов вторичной структуры. Так, возможно образование дополнительных водородных связей между нуклеотидными остатками, достаточно удалёнными друг от друга, или связей между ОН-группами остатков рибо-зы и основаниями. Третичная структура РНК стабилизирована ионами двухвалентных металлов, например ионами Mg2+, связывающимися не только с фосфатными группами, но и с основаниями. Основные типы РНК: (Они различаются по первичной структуре, молекулярной массе, конформации, продолжительности жизни и, самое главное, по функциональной активности) Транспортные РНК (тРНК) Пространственную структуру любых тРНК, независимо от различий в последовательности нуклеотидов, описывают универсальной моделью "клеверного листа". В каждой молекуле тРНК есть участки цепи, не участвующие в образовании водородных связей между нуклеотидными остатками. В состав нуклеотидов тРНК входят минорные основания (в среднем 10-12 оснований на молекулу). Они представлены метилированными основаниями, изомерами и аналогами пиримидинов Минорные основания выполняют 2 функции: они делают тРНК устойчивыми к действию нуклеаз цитоплазмы и поддерживают определённую третичную структуру молекулы, так как не могут участвовать в образовании комплементарных пар, и препятствуют спирализации определённых участков в полинуклеотидной последовательности тРНК. Матричные РНК (мРНК) Первичная структура всех мРНК, независимо от уникальности их кодирующей последовательности, имеет одинаковое строение 5'- и З'-концов. Так, на 5'- конце присутствует модифицированный нуклеотид - кэп. Несколько десятков нуклеотидов отделяют кэп от инициирующего кодона, обычно это триплет -AUG-. За кодирующим участком следует один из терминирующих кодонов -UGA-, -UUA-, -UAG-. На 3'-конце большинства мРНК присутствует последовательность нуклеотидов из 100-200 аденозинмонофосфатных остатков. Рибосомальные РНК (рРНК) Рибосомальные РНК имеют многочисленные спирализованные участки. Различают рРНК - 5S, 5,8S, 28S и 18S (S - коэффициент седиментации). Рибосомальные РНК содержат несколько модифицированных нуклеотидов, чаще всего это метилированные производные азотистых оснований или рибозы (2'-метилрибоза). рРНК образуют комплексы с белками, которые называют рибосомами. Каждая рибосома состоит из двух субъединиц - малой (40S) и большой (60S). Субъединицы рибосом различаются не только набором рРНК, но и количеством и структурой белков. 3)Легкая Задача 34 К препарату митохондрий печени крыс добавили НАД+. Активность каких ферментов цикла Кребса при этом увеличится? Ответ Изоцитратдегидрогеназа, 2-оксоглутаратдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, так как они являются НАД+-зависимыми: 4.Сложная Задача 4 Безуглеводная диета доктора Аткинса и ее разновидность – «кремлевская» – одни из самых популярных в наши дни. Суть их в том, что необходимо резко ограничить поступление углеводов с пищей (не более 15 г в день), а жиры и белки можно есть свободно (в разумных количествах). Задания: - почему при столь обильном потреблении жиров человек сбрасывает вес? - объясните, как повлияет диета на синтез инсулина и почему; - изобразите схему синтеза и гидролиза ТАГ в жировой ткани; покажите на схеме, какие процессы усиливаются и подавляются у человека, сидящего на такой диете; - укажите, концентрация каких липопротеинов повысится в крови при этой диете; - напишите реакции синтеза кетоновых тел в печени и укажите, как изменится скорость этого метаболического пути у человека, придерживающегося «кремлевской» диеты; - объясните, к каким негативным последствиям может привести подобная диета. . Ответ: а) У человека, придерживающегося такой диеты, резко снижено потребление углеводов с пищей, в результате чего не наступает алиментарная гипергликемия. Глюкоза – важнейший (хотя и не единственным) фактор, стимулирующий синтез и секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы. Проникая в β-клетки, глюкоза подвергается процессу гликолиза, благодаря чему увеличивается внутриклеточное содержание АТФ. Последний, блокируя АТФ-зависимые калиевые каналы, вызывает деполяризацию клеточной мембраны. В β-клетки поступают ионы кальция (через открывающийся потенциал-зависимые кальциевые каналы) и высвобождается инсулин способом экзоцитоза. Белок ГЛЮТ-2, переносящий глюкозу в β-клетки поджелудочной железы, имеет низкое сродство к глюкозе. Следовательно, при «кремлевской» диете, когда концентрация глюкозы в крови невысока, она медленно транспортируется в β-клетки и слабо влияет на секрецию инсулина. Секреция инсулина снижается. б)  в) Низкая секреция инсулина ослабляет синтез ЛП-липазы, что увеличивает содержание ЛПОНП и ХМ в крови. Жиры не депонируются в жировой ткани, а поступают в печень, где частично превращаются в ТАГ, транспортируемые из печени в составе ЛПОНП. г) Активация липолиза в жировой ткани приводит к тому, что жирные кислоты поступают в печень в большем количестве, чем в норме, поэтому увеличивается скорость β-окисления. Скорость реакций ЦТК в этих условиях снижена, т.к. оксалоацетат используется для глюконеогенеза. В результате скорость образования ацетил-КоА превышает способность ЦТК окислять его. Ацетил-КоА накапливается в митохондриях печени и используется для синтеза кетоновых тел Увеличение скорости синтеза кетоновых тел резко повышает их содержание в крови – кетонемия и развитие метаболического ацидоза. Его симптомами бывают быстрая утомляемость, раздражимость, боли в желудке, тошнота. Синтез кетоновых те в печени ( ниже) :  5 билет (первый вопрос это 5 и 6 вопросы вместе) 1) 5. Обратимое осаждение белков — высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс. Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны — класс белков, защищающих другие белкиот денатурации в условиях клетки и облегчающих формирование их нативнойструктуры. Обратимое осаждение белков — высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс. Обратимое осаждение – при этом процессе под воздействием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция. Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка. Реактивы: 1) неразведенный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) NaOH, 10% раствор, 4) CuSO4, 1% раствор; 5) дистиллированная вода; 6) сульфат аммония в порошке. Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок - глобулины. Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны — класс белков, защищающих другие белкиот денатурации в условиях клетки и облегчающих формирование их нативнойструктуры. Лабильность белка - склонность к небольшим изменениям конформации за счет разрыва одних и образовании других слабых связей. Конформация белка может меняться при изменении химических и физических свойств среды, а также при взаимодействии белка с другими молекулами. При этом происходит изменение пространственной структуры не только участка, контактирующего с другой молекулой, но и конформация в целом. Денатурация - потеря нативной конформации белка с утратой специфической функции белка. Это происходит когда рвутся многочисленные, но слабые связи в молекуле белка под воздействие различных факторов. ОДНАКО! При денатурации не происходит разрыва пептидных связей, первичная структура БУДЕТ... ЖИТЬ... Самые распространённые факторы денатурации: 1. Высокая температура, более 50 градусов по Цельсию. Увеличивается тепловое движение, связи рвутся. 2. Интенсивное стряхивание раствора, когда происходит контакт с воздушной средой и происходит изменение конфомации молекул. 3. Органические вещества (этиловый спирт, фенол и др.) спсобные взаимодействовать с функциональными группами аминокислот, что приводит, догадайтесь, правильно!, к изменению конформации. 3. Кислоты и щелочи, изменением рН среды приводят к перераспределению связей в белке. 4. Соли ТЯЖЁЛЫХ металлов, образуют прочные связи с функциональными группами, меняя активность и конформацию. 5. Детергенты (мыло) - содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функц. группу. Гидрофобные участки белка и детергента находят друг друга в сложном мире раствора и изменяют конформацию белка, однако не оседают, так как их поддерживают на плаву гидрофильные участки детергента. Шапероны – класс белков, защищающий другие белки от денатурации в условиях клетки и облегчающий формирование их нативной конформации. Шапероны - белки, способные связываться с другими белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны обеспечить их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Среди шаперонов различают: 1. Конститутивные, их количество постоянно в клетке, вне зависимости от внешнего воздействия на неё. 2. Индуцибильные, белки теплового шока, быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул. Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в перебор возможных конформации белка, пока не будет найдена единственная, энергетическая наиболее выгодная конформация. ( и возможно это!!!! 6. Методы выделения индивидуальных белков: гель-фильтрация, ионообменная, афинная хроматография. Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация). Применение. Гель фильтрация. Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов . Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля . На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций . Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной масс. Ионообменная хроматография. Метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нем в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники – полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники и отрицательно заряженные катионообменники. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одно из которых находится искомый белок. Аффинная хроматография Это наиболее специфичные метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными ( иммобилизованными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, приспускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв ее раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Данная хроматография отличается высокой избирательностью помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз. Диализ Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе. Ультрафильтрация Ультрафильтрация это процесс мембранного разделения растворов высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений, а также концентрирования и фракционирования высокомолекулярных соединений. Процесс протекает за счет разности давлений до и после мембраны В отличие от обратного осмоса, ультрафильтрацию применяют для разделения систем, в которых молекулярная масса растворенных компонентов намного больше молекулярной массы растворителя. Например, для водных растворов содержащих органические соединения с молекулярной массой 500 и более. Поскольку осмотические давления высокомолекулярных веществ малы (обычно не более десятых долей МПа), в процессе расчетеовдвижущей силы процесса ультрафильтрации ими, как правило, можно пренебречь. Поэтому ультрафильтрацию проводят при сравнительно невысоких давлениях (0,2 - 1,0 МПа). 2) 42. Источники атомов в биосинтезе пуринового ядра. Последовательность реакций в синтезе пиримидиновых нуклеотидов. В 40-50-х годах XX столетия опытами с мечеными изотопами удалось выяснить происхождение атомов пуринового ядра при синтезе пуринов denovo. Было установлено, что в формировании кольца принимают участие аминокислоты Асп, Гли, Глн, СО2 и два одноуглеродных производных тетрагидрофолата: метенил-Н4-фолат и формил-Н4-фолат. Этим способом образуется основное количество пуриновых нуклеотидов, тогда как нуклеотиды, синтезирующиеся за счёт повторного использования азотистых оснований или нуклеозидов, составляют не более 10-20% общего фонда этих соединений. Фонд пиримидиновых нуклеотидов, подобно пуриновым нуклеотидам, в основном синтезируется из простых предшественников denovo, и только 10-20% от общего количества образуется по "запасным" путям из азотистых оснований или нуклеозидов. Образование пиримидиновых нуклеотидов DE NOVO В отличие от синтеза пуринов, где формирование гетероциклического основания осуществляется на остатке рибозо-5-фосфата, пиримидиновое кольцо синтезируется из простых предшественников: глутамина, СО2 и аспарагиновой кислоты и затем связывается с рибозо-5-фосфатом, полученным от ФРДФ. Процесс протекает в цитозоле клеток. Синтез ключевого пиримидинового нуклеотида - УМФ идёт с участием 3 ферментов, 2 из которых полифункциональны. Образование дигидрооротата У млекопитающих ключевой, регуляторной реакцией в синтезе пиримидиновых нуклеотидов является синтез карбамоилфосфата из глутамина, СО2 и АТФ, в реакции катализируемой карбамоилфосфатсинтетазой II (КФС II), которая протекает в цитозоле клеток. В реакции NH2-гpyппa карбамоилфосфата образуется за счёт амидной группы глутамина, что отличает эту реакцию от реакции синтеза карбамоилфосфата в митохондриях в процессе синтеза мочевины из СО2, NH3 и АТФ с участием КФС I. Карбамоилфосфат, использующийся на образование пирймидиновых нуклеотидов, является продуктом полифункционального фермента, который наряду с активностью КФС II содержит каталитические центры аспартаттранскарбамоилазы и дигидрооротазы. Этот фермент назвали "КАД-фермент" - по начальным буквам ферментативных активностей, которыми обладают отдельные каталитические домены этого белка. Объединение первых трёх ферментов метаболического пути в единый полифункциональный комплекс позволяет использовать почти весь синтезированный в первой реакции карбамоилфосфат на взаимодействие с аспартатом и образование карбамоиласпартата, от которого отщепляется вода и образуется циклический продукт - дигидрооротат. Отщепляясь от КАД-фермента, дигидрооротат подвергается дегидрированию NAD-зависимой дигидрооротатдегидрогеназой и превращается в свободное пиримидиновое основание - оротовую кислоту, или оротат. Образование УМФ В цитозоле оротат становится субстратом бифункционального фермента - УМФ-синтазы, которая обнаруживает оротатфосфорибозилтранс-феразную и ОМФ-декарбоксилазную активности. Первоначально фосфорибозильный остаток от ФРДФ переносится на оротат и образуется нуклеотид - оротидин-5'-монофосфат (ОМФ), декарбоксилирование которого даёт уридин-5-монофосфат (УМФ). Таким образом, шесть последовательных реакций синтеза пиримидиновых нуклеотидов осуществляются тремя ферментами, которые кодируются в геноме человека тремя различными структурными генами. Биосинтез УДФ, УТФ и иитидиловых нуклеотидов УМФ под действием специфических нуклео-зидмонофосфат (НМФ) и нуклеозиддифосфат (НДФ) киназ превращается в УДФ и УТФ в результате переноса γ-фосфатного остатка АТФ на соответствующий субстрат. НМФ-киназа катализирует следующую реакцию: УМФ + АТФ → УДФ + АДФ, а НДФ-киназа: УДФ + АТФ → УТФ + АДФ. ЦТФ синтетаза катализирует амидирование УТФ, осуществляя АТФ-зависимое замещение кетогругшы урацила на амидную группу глутамина с образованием цитидин-5'-трифосфата (ЦТФ). "Запасные" пути синтеза пиримидиновых нуклеотидов Использование пиримидиновых оснований и нуклеозидов в реакциях реутилизации препятствует катаболизму этих соединений до конечных продуктов с расщеплением пиримидинового кольца. В ресинтезе пиримидинов участвуют некоторые ферменты катаболизма нуклеотидов. Так, уридинфосфорилаза в обратимой реакции может рибозилироватъ урацил с образованием уридина. Урацил + Рибозо-1-фосфат → Уридин + Н3РО4. Превращение нуклеозидов в нуклеотиды катализирует уридин-цитидинкиназа. |