Биофизика курс лекций
 Скачать 1.18 Mb.
|
|
С 0 – емкость единицы площади мембраны, не содержащей дефектов; φ – мембранный потенциал. Таким образом, чем больше мембранный потенциал, тем меньше зна- чение энергии поры. Высота энергетического барьера с учетом поля равна: Е* = πγ 2 / (σ + 2 2 С ), т.е. с ростом мембранного потенциала и поверх- ностного натяжения высота барьера снижается. Критический радиус поры может быть рассчитан по формуле: r* = γ / (σ + 2 2 С ). Из формулы следует, что зависимость критической поры от мембранного потенциала становится заметной лишь при значитель- ном превышении электрической составляющей над величиной поверхност- ного натяжения. Расчеты показывают, что для липидного бислоя в жидкок- 64 ристаллическом состоянии величина мембранного потенциала не может быть меньше 0,23 В. Стабильность бислойных мембран определяется вероятностью появле- ния пор критического радиуса. Очевидно, что любой фактор, снижающий высоту энергетического барьера, будет увеличивать эту вероятность. К таким факторам следует отнести снижение краевой энергии поры, рост поверхност- ного натяжения и рост мембранного потенциала. Рост пробойного напряже- ния до 1 В сопровождается смещением критического радиуса к значениям меньшим 0,5 нм, что близко радиусам природных ионных каналов клеточной мембраны. Отсюда следует, что электрический пробой сопровождается появ- лением широкого спектра липидных пор различного радиуса, включая ра- диусы ионоселективных белковых каналов. В настоящее время метод воздей- ствия внешним электрическим полем является одним из основных в совре- менной биотехнологии. Известно его применение с целью увеличения порис- тости мембран (электропорация), введения ДНК (электротрансфекция), осво- бождение клеток от крупных молекул (электропермеабилизация), слияния клеток (электрослияние). Температурный фазовый переход мембранных липидов . Заморажива- ние липидного бислоя в результате фазового перехода из жидкокристалличе- ского состояния в гель сопровождается появлением липидных пор. Очевид- но, что, как и в случае с электрическим пробоем, судьбу мембраны будет оп- ределять соотношение радиусов образовавшихся пор и критических пор для данного состояния бислоя. Реальные поры во всех случаях меньше критического размера пор, ха- рактерного для жидкокристаллического состояния мембранных липидов. Та- ким образом, мембраны в различных стрессовых состояниях обладают зна- чительным запасом прочности. При фазовом переходе из жидкокристаллического состояния в гель по данным рентгеноструктурного анализа, происходит изменение толщины бис- лоя и площади на молекулу липида. Относительно равновесного состояния молекулы в домене гель-фазы будут растянуты, а в жидкокристаллическом состоянии – сжаты. Появится упругое напряжение, которое приведет к нару- шению структуры бислоя. Если считать, что в гель-фазу перешло N молекул одного монослоя, то упругая энергия деформированного участка бислоя задается в соответствии с формулой Юнга: ΔW = τ f a a N 2 ) ( , где τ – коэффицент упругости (50 Н/м), Δа – изменение эффективной площади молекул в плоскости бислоя при фазовом переходе, а f – площадь на молекулу в жидкокристаллическом состоянии. Напряжения, возникающие в мембране, могут уменьшиться или исчез- нуть, если появится гидрофобная пора с последующим превращением в гид- рофильную пору. При образовании поры появляется энергия натяжения кромки поры. Общее изменение энергии бислоя при образовании поры ра- диуса r будет равно: 65 ΔG = τ Na r a N 2 2 ) ( + 2πγr, где γ – линейное натяжение кромки поры. Число молекул, одновременно переходящих в твердое состояние – N (кооперативная единица): N = ΔH ВГ / ΔН Т , где ΔH ВГ – энтальпия Вант-Гоффа, ΔН Т – энтальпия перехода, определяемая по теплоте поглощения. Липидные поры и проницаемость мембран . С точки зрения проницае- мости липидные поры принципиально отличаются от белковых каналов сво- им происхождением и исключительной динамичностью. В то время как бел- ковые каналы имеют строго определенные размеры, сохраняющиеся в тече- ние всей жизни клетки, размеры липидных пор в процессе затекания варьи- руют в широких пределах. Однако эта изменчивость имеет предел. Если ра- диус поры меньше критического, то пора в процессе затекания должна прой- ти все промежуточные радиусы и достигнуть минимального размера. Вопрос о возможности полного затекания липидных пор остается открытым. Пред- полагается, что полному затягиванию поры препятствуют мощные силы гид- ратации, проявляющиеся при сближении стенок гидрофильных пор. Липидные поры в отличие от белковых ионных каналов не обладают выраженной избирательностью, что коррелирует с их сравнительно больши- ми исходными размерами. В процессе затекания липидные поры могут дос- тигать сколь угодно малых размеров, в том числе сравнимых с размерами белковых ионных каналов, что может приводить к перераспределению ион- ных токов в мембране, например, при возбуждении. Известно далее, что по- сле выключения стрессового воздействия бислойная липидная мембрана мо- жет вернуться в состояние с низкой проводимостью, что подразумевает дос- тижение порами размера, недостаточного для прохождения гидратированных ионов. Таким образом, гидрофильные липидные поры универсальны в том отношении, что могут быть использованы клеткой для транспорта высокомо- лекулярных веществ, ионов и молекул воды. Исследования проницаемости липидных пор развиваются в настоящее время в двух направлениях: в первом исследуются максимально большие по- ры, во втором, наоборот, – липидные поры минимального радиуса. В первом случае речь идет об электротрансфекции – способе введения в живые клетки или липосомы молекул ДНК с целью переноса и внутриклеточного введения чужеродного генетического материала. Оказалось, что внешнее электриче- ское поле высокой напряженности способствует проникновению гигантской молекулы ДНК внутрь мембранной частицы. Второе направление исследования проницаемости мембран с участием липидных пор связано с трансмембранным переносом молекул и ионов воды. Известное в биологии явление высокой водной проницаемости клеточных мембран полностью воспроизводится на искусственных липидных бислоях, что подразумевает участие в этом процессе гидрофильных липидных пор. 66 Лекция 8. БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ПОТЕНЦИАЛЫ Одна из важнейших функций биологических мембран – генерация и передача биопотенциалов. Это явление лежит в основе возбудимости клеток, регуляции мышечного сокращения, рецепции. В процессе жизнедеятельности в клетках и тканях могут возникать разности электрических потенциалов: а) окислительно-восстановительные потенциалы – вследствие переноса электронов от одних молекул к другим; б) мембранные – вследствие градиента концентрации ионов и переноса ионов через мембрану. Биопотенциалы, регистрируемые в организме, – это преимущественно мембранные потенциалы. Мембранный потенциал – разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями мембраны. В исследовании биопотенциалов используют: 1) микроэлектродный метод внутриклеточного измерения потенциалов; 2) специальные усилители биопотенциалов; 3) исследование крупных клеток (аксон кальмара) – диаметр аксона кальмара – 0,5 мм. Стеклянный микроэлектрод представляет собой стеклянную микропи- петку с оттянутым очень тонким кончиком. Металлический электрод такой толщины (0,1-0,5 мкм) пластичен и не может проколоть мембрану, кроме то- го, он поляризуется. Потенциал покоя в клетках Потенциал покоя – стационарная разность электрических потенциалов, регистрируемая между внутренней и наружной поверхностями мембраны в невозбужденном состоянии. Потенциал покоя определяется разной концен- трацией ионов по разные стороны мембраны и диффузией ионов через мем- брану. Если концентрация какого-либо иона внутри клетки отлична от кон- центрации этого иона снаружи и мембрана проницаема для этого иона, воз- никает поток заряженных частиц через мембрану, вследствие чего нарушает- ся электрическая нейтральность системы, образуется разность потенциалов внутри и снаружи клеток. При установлении равновесия выравниваются зна- чения электрохимических потенциалов по разные стороны мембраны: т.к. = μ 0 + RTlnC + ZFφ – отсюда: RTlnC вн + ZFφ вн = RTlnC нар + ZFφ нар Тогда формула Нернста для равновесного мембранного потенциала: φ м = φ вн – φ нар = - ZF RT ln нар вн C C Если мембранный потенциал обусловлен переносом ионов К + , для ко- торого Квн>Кнар и Z = +1, равновесный мембранный потенциал: φ м, К = - F RT ln Кнар Квн < 0. Для ионов Na + - Naвн 67 φ м, Na = - F RT ln Naнaн Naвa > 0. Для ионов хлора – Clвн φ м, Cl = - F RT ln Clнlн Clвl < 0. Согласно Бернштейну (1902), причина мембранного потенциала покоя – диффузия ионов калия из клетки наружу. По формуле Нернста равновесный мембранный потенциал составляет 120 мВ, что несколько больше модуля экспериментально измеренных значений потенциала покоя. Следует учиты- вать одновременную диффузию через мембрану ионов натрия, калия и хлора. В таком случае используют уравнение Гольдмана: φ м = F T R ln 0 0 0 ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ Cl P Na P K P Cl P Na P K P Cl i Na i K i Cl Na K , где φ м – мембранный потен- циал; P K , P Na , P Cl – проницаемость мембраны для соответствующих ионов; [K + ] 0 , [Na + ] 0 , [Cl - ] 0 – концентрации ионов снаружи клетки; [K + ] i ,[Na + ] i ,[Cl - ] i – концентрации ионов внутри клетки. В состоянии покоя проницаемость мембраны для ионов калия больше, чем для ионов хлора и значительно больше, чем для ионов натрия. Мембранный потенциал, рассчитываемый по уравнению Гольдмана, оказывается по абсолютной величине меньше мембранного потенциала, рас- считанного по уравнению Нернста, ближе к экспериментальным данным в крупных клетках. И формула Нернста и уравнение Гольдмана не учитывают активного транспорта ионов через мембрану, наличие в мембранах электро- генных ионных насосов, играющих важную роль в поддержании ионного равновесия в мелких клетках. В цитоплазматической мембране работают ка- лий-натриевые АТФ-азы, перекачивающие калий внутрь клетки, а натрий из клетки. С учетом работы электрогенных ионных насосов для мембранного потенциала было получено уравнение Томаса (1972): φ м = F T R ln i Na i K Na K Na P K mP Na P K mP ] [ ] [ ] [ ] [ 0 0 , где m – отношение количества ионов натрия к количеству ионов калия, перекачиваемых ионными насосами через мем- брану. Чаще всего натрий-калиевая АТФ-аза работает в режиме, когда m = 3/2, но всегда >1. (для хлора нет ионных насосов). Коэффициент m>1 усили- вает вклад градиента концентрации калия в создание мембранного потенциа- ла, поэтому мембранный потенциал, рассчитанный по Томасу, дает совпаде- ние с экспериментальными значениями для мелких клеток. Потенциал действия Потенциал действия – это электрический импульс, обусловленный из- менением ионной проницаемости мембраны и связанный с распространением по нервам и мышцам волны возбуждения. В опытах по исследованию потенциала действия (Ходжкин) использо- вали 2 микроэлектрода, введенных в аксон. На первый микроэлектрод пода- ется импульс от генератора прямоугольных импульсов, меняющий мембран- 68 ный потенциал. Мембранный потенциал измеряется при помощи второго микроэлектрода высокоомным регистратором напряжения. Возбуждающий импульс вызывает лишь на короткое время смещение мембранного потенциала, которое быстро пропадает с восстановлением по- тенциала покоя. Когда возбуждающий импульс смещается еще дальше в от- рицательную сторону, он сопровождается гиперполяризацией мембраны. По- тенциал действия не формируется, когда возбуждающий импульс (деполяри- зующий), но его амплитуда ниже порогового значения. Однако, если ампли- туда положительного деполяризующего импульса окажется больше порого- вого значения, то мембранный потенциал становится выше порогового по- тенциала и в мембране развивается процесс, в результате которого происхо- дит резкое повышение мембранного потенциала и он становится положи- тельным. Достигнув некоторого положительного значения – потенциала ревер- сии, мембранный потенциал возвращается к значению потенциала покоя, со- вершив нечто вроде затухающего колебания. В нервных волокнах и скелетных мышцах длительность потенциала действия составляет около 1 мс, в сердечной мышце – около 300 мс. После снятия возбуждения еще в течение 1-3 мс в мембране наблюдаются некото- рые остаточные явления, во время которых мембрана рефрактерна (невозбу- дима). Новый деполяризующий потенциал может вызвать образование нового потенциала действия только после полного возвращения мембраны в состоя- ние покоя. Причем амплитуда потенциала действия не зависит от амплитуды деполяризующего потенциала. Если в покое мембрана поляризована (т.е. по- тенциал цитоплазмы отрицателен по отношению к внеклеточной среде), то при возбуждении происходит деполяризация мембраны (потенциал внутри клетки положителен) и после снятия возбуждения происходит реполяризация мембраны. Характерные свойства потенциала действия: 1) наличие порогового значения деполяризующего потенциала; 2) закон «все или ничего», т.е., если деполяризующий потенциал боль- ше порогового, то развивается потенциал действия, амплитуда которого не зависит от амплитуды возбуждающего импульса; если деполяризующий по- тенциал меньше порогового, то потенциал действия не развивается; 3) есть период рефрактерности, невозбудимости мембраны во время развития потенциала действия и остаточных явлений после снятия возбужде- ния; 4) в момент возбуждения резко уменьшается сопротивление мембраны. Положительный потенциал реверсии имеет натриевую природу, т.к. именно диффузия натрия создает положительную разность потенциалов ме- жду внутренней и наружной поверхностями мембраны. Можно менять амплитуду импульса потенциала действия, изменяя концентрацию натрия в наружной среде. При уменьшении наружной концен- трации натрия амплитуда потенциала действия уменьшается, т.к. меняется 69 потенциал реверсии. Если из окружающей клетку среды полностью удалить натрий, то потенциал действия вообще не возникает. При возбуждении проницаемость мембраны для натрия резко возраста- ет. Возбуждение мембраны описывается уравнениями Ходжкина-Хаксли: I m = C m dt d m + Σ I i , где I m – ток через мембрану, C m – емкость мембраны, ΣI i – сумма ионных токов через мембрану. Электрический ток через мембрану складывается из ионных токов: ио- нов калия, натрия и других ионов (в том числе хлора), тока утечки, а также емкостного тока. Емкостный ток обусловлен перезарядкой конденсатора, ко- торый представляет собой мембрана, перетеканием зарядов с одной ее по- верхности на другую. Его величина определяется количеством заряда, пере- текающего с одной обкладки на другую за единицу времени. Каждый ионный ток определяется разностью мембранного потенциала и равновесного нерн- стовского потенциала, создаваемого диффузией ионов данного типа. В целом, согласно теории Ходжкина-Хаксли, возбуждение элемента мембраны связано с изменением проводимости мембраны для ионов натрия и калия. Проводимости мембраны сложным образом зависят от мембранного потенциала и времени. Если в каком-либо участке возбудимой мембраны сформировался по- тенциал действия, мембрана деполяризована, возбуждение распространяется на другие участки мембраны. Локальные токи образуются и внутри клетки и на наружной ее поверх- ности. Локальные электрические токи приводят к повышению потенциала внутренней поверхности невозбужденного участка мембраны и к понижению наружного потенциала невозбужденного участка мембраны, оказавшегося по-соседству с возбужденной зоной. Таким образом, отрицательный потен- циал покоя уменьшается по абсолютной величине, т.е. повышается. В облас- тях, близких к возбужденному участку, мембранный потенциал повышается выше порогового значения. Под действием изменения мембранного потен- циала открываются натриевые каналы, и дальнейшее повышение происходит уже за счет потока ионов натрия через мембрану. Происходит деполяризация мембраны, развивается потенциал действия. Затем возбуждение передается дальше на покоящиеся участки мембраны. Величина деполяризующего потенциала, передаваемого от возбужден- ных участков мембраны, зависит от расстояния: |