Биофизика курс лекций
 Скачать 1.18 Mb.
|
|
, т. е. о классификации соответствий между активными центрами фер- ментов и субстратами. Громадное число комбинаций из 20 видов аминокислотных остатков на поверхности реактивной полости фермента, в его активном центре, обеспе- чивает практически неограниченное многообразие функциональности фер- ментов. Можно думать о наличии фиксированных комбинаций, кодирующих узнавание характерных атомных групп субстратов. Точнее, следует говорить о кодовых сорбирующих комбинациях и о кодовых каталитических комби- нациях, действующих согласованно, но пространственно разделенных. Име- ются некоторые указания на возможность существования такого кода. Взаимодействие, определяющее узнавание субстрата или ингибитора белком, есть процесс передачи информации молекулярным сигналом рецеп- тору. В большинстве реальных случаев передается не вся информация, со- держащаяся в данном объекте, но лишь некоторая ее часть, именуемая сигна- турой. Сигнатурой молекулы служат все те ее особенности, благодаря кото- рым она становится участником данной реакции. В случае образования фермент-субстратного комплекса сигнатурой субстрата являются его функ- циональные группы, взаимодействующие с активным центром. В свою оче- редь, сигнатура фермента есть его активный центр, т. е. ограниченная сово- купность аминокислотных остатков, непосредственно взаимодействующих с субстратом. Узнавание сводится здесь к структурному соответствию молеку- лярных сигнатур, реализуемому в результате многоточечных слабых взаимо- действий. Если обратиться к обучаемым узнающим системам, возникающим на более высоких уровнях биологической организации, то станет очевидным, что в результате обучения система должна перестать «обращать внимание» на несущественные обстоятельства. Иными словами, система обучается уз- наванию сигнатуры. Совершенство молекулярного узнавания имеет первостепенное значе- ние для молекулярной биологии и биофизики, в частности, для процессов развития и эволюции. 31 Специфичность ферментов не абсолютна. Данный фермент зачастую катализирует не определенную реакцию одного строго заданного субстрата, а однотипные реакции группы сходных субстратов. Это определяется двумя причинами. Первая непосредственно связана с общей программой онтогенеза и филогенеза, приводящей к оптимальной экономии числа действующих бел- ков. В тех ситуациях, в которых биологически существенна одна и та же ре- акция группы родственных субстратов, она может быть эффективно реализо- вана единственным ферментом. Конечно, вся названная группа должна ха- рактеризоваться одной и той же сигнатурой или близкими сигнатурами. Вторая причина наличия конечного интервала специфичности имеет молекулярно-кинетический характер. Реальная молекулярная узнающая сис- тема, фермент, предназначена не только для узнавания сигнала, но и для его достаточно быстрого преобразования. Степень специфичности узнавания выражается свободной энергией взаимодействия. Если выигрыш свободной энергии слишком велик, то прочность фермент-субстратного комплекса мо- жет быть настолько большой, что число оборотов фермента окажется чрез- мерно низким. Необходимо оптимальное соотношение между стабильностью и скоростью преобразования. Эта ситуация с особенной ясностью проявляет- ся в более простых случаях узнавания в полинуклеотидах и нуклеиновых ки- слотах. Характеристики узнавания, определяемые константами стабильности, относятся, конечно, лишь к термодинамическому равновесию. Биологиче- ские процессы редупликации ДНК, транскрипции и трансляции – кинетиче- ские процессы, идущие с участием соответствующих ферментов. В их основе лежит узнавание ДНК ДНК-полимеразой, лигазами, РНК-полимеразой, узна- вание мРНК и тРНК рибосомой. Межклеточные взаимодействия Молекулярное узнавание в биологических системах реализуется не только на уровне самих молекул, но и на уровне надмолекулярных клеточ- ных структур. Межклеточные взаимодействия имеют определяющее значение для существования и развития многоклеточного организма. Взаимодействия эти в высокой степени специфичны в смысле контактов клеток определенного сорта. Они имеют динамический характер – направленные перемещения кле- ток ответственны за морфогенетическое развитие организма. В результате взаимодействий клеток возникают тканевые структуры. Можно считать установленным, что межклеточные взаимодействия осуществляются посредством молекулярных, химических сигналов. Это до- казывается, в частности, прямыми опытами, в которых взаимодействие кле- ток нарушалось введением между ними кусочка целлофана. При замене цел- лофана полосками агара, через который могут проходить более крупные мо- лекулы, взаимодействие восстанавливалось. Еще в 1907 г. Уилсон показал, что разделенные клетки морской губки объединяются вновь при помещении в морскую воду, причем образуются вполне сформировавшиеся маленькие губки. Позднее было установлено, что 32 такого рода регенерация видоспецифична – из смеси клеток, принадлежав- ших губкам разных видов, образуются разные виды губок. Сходные явления наблюдаются и у клеток гораздо более сложных организмов. Очевидно, что такого рода узнавание, приводящее к упорядочению клеток, требует молекулярной сигнализации, контакта и адгезии клеточных поверхностей. Прямые опыты показывают, что при контакте и взаимодействии клеток происходит резкое увеличение проницаемости клеточных мембран. Наличие межклеточной коммуникации доказывается прохождением малых неоргани- ческих ионов (в частности, Са 2+ ) из одной клетки в другую. Установлено также, что сравнительно большие молекулы флуоресцирующих красителей способны переходить из клетки в клетку, если между клетками имеется функциональный контакт. Образованию контакта предшествует химическая сигнализация между клетками. Сигнализация осуществляется, по-видимому, путем выделения в окружающую среду веществ, являющихся факторами агрегации, узнаваемых клетками. Эти вещества специфичны для сорта ткани, но не для вида. Если поместить в один и тот же сосуд клетки зародыша мыши и зародыша цып- ленка, принадлежащие к разным тканям, то образуются раздельные скопле- ния клеток. Если же смешать клетки, взятые у зародышей двух разных видов, но принадлежащие одной и той же ткани, то образуется единое скопление. В некоторых случаях удалось выделить эти сигнальные вещества. Они представляют собой гликопротеидные частицы, содержащие 47% аминокис- лот и 49% сахара. Константа седиментации равна 62,55. Частицы имеют вид сфер диаметром 80 нм, снабженных рядом радиальных отростков длиною 110 нм и толщиною 4,5 нм. Таким образом, частица обладает достаточно сложной структурой, функциональность которой пока остается неизвестной. Перемещение клеток, приводящее к их сортировке, можно объяснять различными способами. Первая гипотеза исходит из представления о хемо- таксисе – о миграции клеток определенного типа по направлению к сигналь- ному веществу, образуемому только клетками этого типа. Вторая гипотеза исходит из предположения о том, что поверхность клетки изменяется под влиянием диспергирующих агентов. Ее изменение приводит к появлению механической активности, клетки приобретают подвижность и беспорядочно движутся в агрегате до тех пор, пока не восстановится прежняя структура их поверхности. При этом возрастает их адгезивность. В таком случае все клет- ки одного типа будут постепенно накапливаться в кортикальной области аг- регата, и оттеснять другие клетки к его середине. Третья гипотеза исходит из дифференциальной адгезивности клеток. Сегрегация обусловлена случайны- ми движениями и количественными различиями в адгезивности клеток. Про- блема сводится к рассмотрению термодинамического равновесия в образую- щейся системе. Экспериментальные данные лучше всего объясняются треть- ей гипотезой. Однако нельзя считать, что мы располагаем сейчас сколько- нибудь полной теорией рассматриваемых явлений. Приведенные факты сви- детельствуют о специфической химической сигнализации между клетками, о 33 направленных механохимических процессах и о специфических контактных взаимодействиях, определяемых свойствами клеточных мембран. Узнавание на клеточном уровне является сложным процессом и влечет за собой ряд яв- лений биоэнергетического характера. Сколько-нибудь полную физическую теорию этих явлений пока нельзя построить, так как имеющиеся биохимиче- ские сведения для этого недостаточны. Однако предложен ряд моделей, по- лезных для дальнейшего развития теории. В работах предложена теория самосортировки клеток, исходящая из того, что подвижность и дифференцированная адгезивность достаточны для такого процесса. Предполагается, что конечная конфигурация, образуемая клетками, отвечает минимуму свободной энергии их поверхностей. Анало- гом такой системы являются капли несмешивающихся жидкостей. Построена двумерная решеточная модель, «клетки» решетки моделируют живые клетки или среду. Вводится величина энергии контакта клеток. Модель, оперирую- щая изотропными клетками, представляет упорядоченные структуры, не имеющие, однако, биологических аналогов. Напротив, в подобных же мо- дельных системах, содержащих анизотропные клетки, оказывается возмож- ным возникновение аналогов биологических структур. Спонтанная сегрегация клеток из смешанных агрегатов исследуется на той же основе адгезивности. Рассматривается детализированная модель межмолекулярных взаимодействий, в которой энергия взаимодействия оди- наковых клеточных поверхностей отличается от таковой для разных поверх- ностей. Теория подобна теории разделения несмешиваемых жидкостей. В указанных исследованиях отсутствуют представления о специфиче- ской межклеточной сигнализации. Показано, что система клеток, притяги- вающихся друг к другу посредством хемотаксиса, в ответ на испускаемые ими сигналы может агрегировать. Агрегация инициируется случайными флуктуациями. Если сигнализация кооперативна, то агрегация приводит к характеристическому потоку, подобному наблюдаемому у некоторых миксо- мицетов. Было проведено детальное экспериментальное исследование агре- гации эмбриональных клеток цыпленка. Удалось выделить макромолекуляр- ные факторы, способствующие агрегации, и ввести в них меченые атомы. Оказалось, что эти вещества специфически связываются определенными тка- нями. На клеточных поверхностях имеются, по-видимому, специфические рецепторы, узнающие факторы, промотирующие агрегацию. Кинетика свя- зывания свидетельствует о его кооперативном характере. Идентификация этих факторов и дальнейшие физико-химические исследования должны при- вести к выяснению физических основ клеточной агрегации. Эдельман предложил интересную гипотезу о природе взаимного узна- вания клеток, их движения, а также роста тканей, основанную на поверх- ностной модуляции. Согласно этой гипотезе поверхности клеток данного ти- па содержат молекулы специфических гликопротеидов. Последние расщеп- ляются определенными протеазами, и остающиеся на поверхностях фрагмен- ты узнают друг друга. Таким образом, состояние поверхности модулируется протеазами, которые, тем самым, управляют адгезией клеток в развивающих- 34 ся тканях. Указанные гликопротеиды являются молекулами, ответственными за ассоциацию клеток. Эдельман отмечает общность разнообразных явлений модуляции поверхности: связи AT-АГ, присоединение вирусов, взаимодейст- вия клеток с гормонами, взаимодействия сперматозоида с яйцеклеткой и т.д. Гипотеза Эдельмана важна и может служить основой для дальнейших иссле- дований. Отметим, что представление о существенной функции протеаз согласу- ется с фактами, установленными в совсем иной области биологии. Александ- ров показал, что имеется корреляция между теплоустойчивостью белков ряда организмов и теплолюбивостью этих организмов. Так, ареал травяной ля- гушки (Rana temporaria)простирается от 43° до 70° с. ш., ареал озерной ля- гушки (R. ridibunda)– от 40° до 60° с. ш. Температура денатурации ряда бел- ков озерной лягушки на несколько градусов выше, чем травяной. Конечно, эти температуры существенно выше физиологических. Александров убеди- тельно объяснил эти и подобные им эффекты соответствием между геноти- пически обусловленным уровнем теплоустойчивости белков и средней тем- пературой существования вида. Известно, что протеолиз хорошо коррелиру- ет с денатурацией. Важнейшая роль протеаз, предполагаемая Эдельманом, конкретизирует объяснение фактов, открытых Александровым. Следует подчеркнуть, что распространенные в литературе представле- ния о том, что специфическое взаимодействие сходных надмолекулярных и клеточных структур определяется специфичностью микро- или макроскопи- ческих межмолекулярных сил, нельзя считать убедительными. Эти представ- ления вводились вначале для объяснения синапсиса хромосом – один из соз- дателей квантовой механики Иордан считал, что между тождественными участками двух гомологичных хромосом действуют квантовомеханические резонансные силы. В дальнейшем, Джеле рассмотрел специфическое диспер- сионное взаимодействие. Однако трудно ожидать существенных различий во взаимодействии структур, построенных из сходных биополимеров, и диспер- сионные силы в этих случаях не могут обладать специфичностью. На уровне организма в целом важнейшее значение имеет химическая сигнализация посредством гормонов, регулирующих поведение ряда систем, образующих организм. Гормоны во многих случаях воздействуют не только на клеточные мембраны, но непосредственно влияют на гены, на ДНК и, тем самым, участвуют в регуляции белкового синтеза. Так, гормон альдостерон регулирует прохождение ионов Na + и К + через клеточные мембраны. С по- мощью радиоактивной метки показано, что альдостерон проникает в клеточ- ное ядро. Через некоторое время после того, как концентрация альдостерона стала внутри клетки максимальной, перемещение ионов через мембрану уси- ливается. Это происходит вследствие усилившегося синтеза специфического белка. Действительно, если клетки предварительно обработаны антибиоти- ком пуромицином, то гормон своего действия не оказывает. Между тем из- вестно, что пуромицин блокирует действие генов, препятствует биосинтезу белка. 35 Активность гормонов связана во многих случаях с функционированием важного сигнального вещества живых клеток – циклической АМФ. Все изложенное подтверждает общие положения современной биоло- гии, согласно которым живой организм следует трактовать как весьма слож- ную химическую машину. Процессы сигнализации, регуляции, управления в такой машине реализуются посредством молекул на основе молекулярного узнавания. 36 Лекция 5. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ Макромолекула – основная структурная единица живого – включает большое количество атомов и атомных групп. Их тепловое движение, пово- роты и вращения вокруг единичных связей обусловливают большое число внутримолекулярных степеней свободы, что придает макромолекуле стати- стические свойства. Одновременно в той же макромолекуле между атомами существуют химические связи, ближние и дальние взаимодействия которых придают вполне определенный детерминистский характер ее конформацион- ным перестройкам. Таким образом, биологическая макромолекула обладает своеобразными свойствами, в основе которых лежит тесное взаимодействие статистических и детерминистских (механических) степеней свободы. В про- стых химических процессах в растворах продукт реакции появляется вслед- ствие активных соударений молекул реагентов. В отличие от этого результат функционирования макромолекулы в биохимических процессах достигается, прежде всего, вследствие взаимодействия частей единого активного макро- молекулярного комплекса. В химии растворов рост температуры вызывает увеличение доли активных кинетических соударений молекул, а в макромо- лекулярных комплексах этот же фактор может повлиять на их структурную организацию и тем самым на механизм и эффективность внутримолекуляр- ных взаимодействий. Для таких систем, строго говоря, неприменимо понятие химического потенциала как движущей силы процесса, зависящей от исход- ного числа реагентов. В случае макромолекулярных комплексов реакция оп- ределяется не их числом как таковым, а внутримолекулярными взаимодейст- виями в каждом из них. Это хорошо видно на примере ферментативного ка- тализа. Основная задача молекулярной биофизики состоит в том, чтобы, исхо- дя из характера взаимодействия атомных групп, определяющих информацию макромолекулы, раскрыть природу ее внутримолекулярной динамики. На этой основе следует перейти к рассмотрению электронных свойств и физиче- ских принципов функционирования макромолекул (белков) в биохимических процессах. Клубок и глобула Полимерная цепь, где взаимодействуют только соседние звенья, свора- чивается в клубок (рис. 1), обладающий большим числом конформаций, пе- реходы между которыми происходят в процессе микроброуновского движе- ния частей цепи. Такой клубок не обладает определенной внутренней струк- турой, он как бы все время "дышит", причем амплитуда "вздоха" порядка раз- меров клубка. Взаимное расположение отдельных частей клубка полностью подчиняется статистическим закономерностям. Однако если имеются объем- ные взаимодействия между атомами, далеко отстоящими друг от друга по цепи, то это существенно меняет всю картину. В реальных макромолекулах объемные взаимодействия элементов цепи создают внутреннее поле, под действием которого образуется глобула с плотной сердцевиной (рис. 2). В отличие от клубка глобула уже обладает определенной пространственной структурой. 37 Рис. 1. Белковый клубок Сердцевина большой глобулы пространственно однородна с постоян- ной концентрацией звеньев, большей по сравнению с "опушкой" глобулы. Температурные переходы между состояниями клубка и глобулы одновре- менно являются переходами между разными фазами и сопровождаются из- менениями агрегатного состояния макромолекулы. В биомакромолекулах наиболее подробно эти процессы изучены в бел- ках. Белковые глобулы претерпевают переходы порядок-беспорядок в отно- сительно малом интервале температуры и напоминают в этом отношений фа- зовые переходы 1-го рода. В экспериментальных исследованиях на калори- метрах к препарату белка обычно подводится тепло с постоянной скоростью и при этом регистрируется скорость повышения температуры белка. Отсюда можно найти теплоемкость белка при различных температурах. Оказывается, что при тепловой денатурации белка и переходах типа порядок-беспорядок происходит одновременно значительное изменение его теплоемкости. Эти изменения не могут быть вызваны только термическим возбуждением внут- римолекулярных степеней свободы, а свидетельствуют о структурных пере- стройках в самой макромолекуле. Детальный характер этих перестроек в белковой глобуле можно понять, зная конкретную природу объемных взаи- модействий в белке. 38 Рис. 2. Белковая глобула Типы объемных взаимодействий Первичная структура полимерной цепи определяется химическими или валентными взаимодействиями. Объемные взаимодействия в основном опре- деляют вторичную структуру макромолекул. Общим критерием стабильно- сти молекулярной структуры является наличие минимума на кривой зависи- мости энергии взаимодействия от расстояния между взаимодействующими частями. На малых расстояниях преобладают силы отталкивания, а на боль- ших расстояниях превалирует притяжение. В образовании вторичной струк- туры белка играют большую роль силы Ван-дер-Ваальса. Они имеют элек- тромагнитную природу и связаны с взаимодействием электрических диполей в соседних молекулах. Наиболее распространены дисперсионные взаимодей- ствия между молекулами, которые не обладают постоянными дипольными моментами. Природа этих сил носит квантовомеханический характер. Дви- жение электрона как квантовой частицы не может быть описано точной ме- ханической траекторией, а имеет "размытый" характер. Электрон не может обладать одновременно строго определенными значениями координаты и импульса. Это значит, что и в основном невозбужденном состоянии существуют быстрые смещения заряда электрона от положения равновесия, а, следова- тельно, в молекуле в состоянии покоя появляются "мгновенные" дипольные моменты. Появление такого момента в одной молекуле индуцирует появле- ние его в соседней молекуле. Возникает взаимодействие двух быстроменяю- 39 щихся дипольных моментов, которые, таким образом, становятся связанны- ми и притягиваются друг к другу. Энергия притяжения двух мгновенных ди- полей, или энергия дисперсионного взаимодействия, быстро убывает с рас- стоянием. Кроме дисперсионного взаимодействия возможно и электростатиче- ское притяжение между постоянными диполями в полярных молекулах. Кроме того, существуют также индукционные взаимодействия, которые воз- никают между постоянным дипольным моментом в одной молекуле и наве- денным им диполем в соседней поляризуемой молекуле. Суммарное ван-дер- ваальсово взаимодействие двух молекул зависит от вклада всех типов ди- польных взаимодействий и составляет по величине от 1,0 до нескольких де- сятков ккал/моль. Для многих биологических макромолекул глубина энерге- тического минимума, создаваемого за счет ван-дер-ваальсового притяжения, составляет 1-3 ккал/моль, что по порядку величины сравнимо с величиной тепловой энергии 0,6 ккал/моль молекул при комнатной температуре. Наряду с силами Ван-дер-Ваальса большую роль в стабилизации био- структур играют водородные связи и электростатические взаимодействия между заряженными и полярными группами. Водородные связи, например, стабилизируют вторичную структуру полипептидных цепей. В энергию во- дородной связи дают вклад электростатические взаимодействия, притяжение и отталкивание, а также энергия делокализации электронов. Величины энер- гии водородной связи сильно варьируют (3-8 ккал/моль). Внутреннее вращение и поворотная изомерия имеют важное значение в конформационной структуре макромолекулы. Энергия ближних взаимо- действий атомных групп зависит от расстояний между ними, которые в свою очередь меняются при вращении этих групп вокруг единичных связей. При близком расположении валентно не связанные атомы начинают отталкивать- ся, и возникает тормозящий энергетический потенциал, препятствующий вращению атомных групп. Энергия вращения атомных групп вокруг единич- ных связей дает основной вклад в общую конформационную энергию поли- мерной цепи. Общая конформационная энергия полимера зависит от взаим- ных углов поворотов звеньев вокруг единичных связей. Подобная система, где энергия составляющих элементов зависит от их взаимодействия друг с другом, называется кооперативной. Конформационная энергия полипептидной цепи определяется всеми видами объемных взаимодействий и зависит от энергии внутреннего враще- ния боковых цепей аминокислотных остатков вокруг единичных связей. В этом случае взаимное влияние звеньев при изменении их положения может передаваться вдоль цепи через большое число связей, и тогда вклад их в общую конформационную энергию трудно учесть. Однако на самом деле двойной характер пептидной связи препятствует вращению вокруг нее. Он обусловлен обобществлением неподеленной пары 2 S электронов атома азота между азотом и углеродом. Вследствие этого происходят выталкивание элек- трона углерода из двойной n |