Биофизика курс лекций
 Скачать 1.18 Mb.
|
|
+ zF (φ 2 – φ 1 )=0. В равновесии могут находиться субстраты (А) и продукты (В) биохи- мической реакции (А ↔ В) или ионы по две стороны мембраны. Экспериментальное определение термодинамических параметров биологических систем Для определения термодинамических параметров биологических сис- тем используются два метода: определение теплопродукции (калориметрия) и измерение констант равновесия. Так как объект, находящийся в калоримет- ре, не производит работы, изменение энергии (энтальпии) можно считать равным количеству выделившегося тепла ΔQ. Так находят изменение энталь- 23 пии (ΔН), например, в ходе изучаемого биофизического процесса или биохи- мической реакции. Независимо от этого производят вычисление свободной энергии про- цесса (реакции) на основании определения константы равновесия К, т.е. из- мерения равновесных концентраций субстратов и продуктов реакции. Зная ΔН, температуру Т и ΔG, можно по уравнению рассчитать измене- ние энтропии в данном процессе (ΔS). Существует также другой подход к изучению термодинамических параметров процесса, основанный на измере- нии констант равновесия при разных температурах. Этот метод пригоден только в том случае, когда ни изменение энтальпии системы (ΔН), ни изме- нение энтропии (ΔS) от температуры не зависят. В этом случае получаем для 1 моля вещества: lnK = - R S RT H Это соотношение называется уравнением Вант-Гоффа. График зависи- мости lnK от 1/Т представляет собой прямую линию, пересекающую ось абс- цисс в точке ΔS/ΔН, ось ординат – в точке ΔS/R. Как известно, для построения прямой достаточно знания координат двух точек. Поэтому часто ΔН и ΔS и находит, определив константу равнове- сия всего при двух температурах. Для гидролиза АТФ при рН = 7,0 и 37°С этим способом было найдено ΔН = 20 кДж/моль, ΔS = 0,0396 кДж/(моль·град). Второй закон термодинамики и живые организмы В литературе неоднократно высказывалось удивление по поводу того, что в живых организмах в ходе их роста и развития может происходить уве- личение упорядоченности, которое, казалось бы, противоречит второму за- кону термодинамики. Противоречие это кажущееся. С одной стороны, как справедливо указывают многие авторы (Л.А. Блюменфельд, Л.А. Николаев и др.), понятие энтропии вообще нецелесообразно использовать, когда речь идет о порядке в макроскопическом смысле, скажем, о дифференциации кле- ток, специализации клеточных структур и т.д. С другой стороны, организм постоянно совершает работу и растет, следовательно, общее количество сво- бодной энергии в нем должно увеличиваться, что на первый взгляд противо- речит второму закону термодинамики. Такой вывод, однако, основан на не- доразумении. Свободная энергия не может увеличиваться лишь в изолиро- ванных системах. Ни один живой организм не является изолированной сис- темой. Организм питается и с пищей (а растения и со светом) потребляет свободную энергию, которую потом расходует. В полном смысле слова изо- лированной можно считать систему организм-среда. Внутри такой системы в ее «живой» части, т.е. в организме, свободная энергия может увеличиваться, а энтропия – соответственно уменьшаться, но при непременном условии од- новременного его увеличения в неживой части системы. Так, например, раз- витие зеленых растений на Земле происходило благодаря увеличению энтро- пии в системе Солнце-Земля. 24 Известно, что и в состоянии покоя, и при выполнении работы может происходить рост и развитие организма, но одновременно идет непрерывное выделение тепла живыми организмами. Эта теплота диссипации представля- ет собой результат окисления веществ, заключенных в пище, которое сопро- вождается ростом энтропии, значительно большим, чем снижение энтропии за счет роста организма и дифференцировки его клеток. «Энергосопрягающие» системы клетки Изменение свободной энергии в ходе любого процесса определяет на- правление этого процесса: он идет в сторону уменьшения G. Например, для гидролиза фосфатной связи в комплексе Мg 2+ –АТФ при рН 7,0 и 37°С по схе- ме АТФ + Н 2 O→ АТФ + Ф (где Ф – ион фосфорной кислоты) получено зна- чение ΔG = –30,5 кДж/моль. В реакции АДФ + Н2O → АМФ + Ф, ΔG = 30 кДж/моль. Значительное понижение свободной энергии при гидролизе АТФ и АДФ побудило биохимиков назвать эти соединения богатыми энергией, или макроэргическими. Однако в живой клетке протекает множество реакций, которые сопровождаются увеличением свободной энергии (ΔG > 0). Напри- мер, синтез пептидной связи при образовании дипептида: аланин + глицин → аланилглицин характеризуется ΔG = 17,2 кДж/моль, а фосфорилирование глюкозы при гликолизе по схеме глюкоза + Ф → глюкозо-6-фосфат + Н 2 О характеризуется ΔG = 13,4 кДж/моль. Эти процессы не могут идти самопро- извольно, они протекают за счет сопряжения с другими химическими реак- циями, изменение свободной энергии которых отрицательно. Объединив первую и последнюю реакции, можно записать: АТФ + глюкоза → АДФ + глюкозо-6-фосфат. Складывая изменения свободной энергии реакций при их совместном протекании, получаем для фосфорилирования глюкозы с участи- ем АТФ: ΔG = – 30,5 кДж/моль + 13,4 кДж/моль = –17,1 кДж/моль. Этот пример иллюстрирует основной способ преобразования энергии в клетке: химическая работа совершается путем подключения к реакции с «не- благоприятным» изменением свободной энергии реакций с большим отрица- тельным изменением свободной энергии. Чтобы осуществлять такое «сопря- жение» процессов, клетке пришлось создать в ходе эволюции специальные молекулярные «энергопреобразующие» устройства, которые представляют собой ферментные комплексы, как правило, связанные с мембранами. Особенности организмов как термодинамических систем При применении термодинамики к биологическим системам необхо- димо учитывать особенности организации живых систем: 1) биологические системы открыты для потоков вещества и энергии; 2) процессы в живых сис- темах, в конечном счете, имеют необратимый характер; 3) живые системы далеки от равновесия; 4) биологические системы гетерофазны, структуриро- ваны и отдельные фазы могут иметь небольшое число молекул. Все это отличает биологические системы от изолированных и близких к состоянию равновесия систем, в которых, как это делалось в предыдущих разделах, рассматриваются обратимые процессы в гомогенной среде, содер- 25 жащей огромное множество молекул. Для более адекватного описания свойств биологических систем во многих случаях полезно применение тер- модинамики необратимых процессов, основателями которой считают лауреа- тов Нобелевской премии по химии Л. Онзагера и И. Пригожина. В отличие от классической термодинамики, в термодинамике необра- тимых процессов рассматривается ход процессов во времени. Фундаменталь- ное понятие классической термодинамики – равновесное состояние. В тер- модинамике необратимых процессов столь же важным понятием можно счи- тать стационарное состояние системы. Различие между равновесием и стационарным состоянием хорошо видно на примере ионного баланса клетки. Концентрация К + внутри клеток теплокровных примерно в 15 раз выше, чем во внеклеточной среде, но это не приводит к выходу этих ионов из клетки, так как на клеточной мембране имеется потенциал со знаком минус внутри клетки, который удерживает К + от выхода из цитоплазмы. Система близка к равновесию, условия которого описываются уравнением Нернста: φ м = φ 2 – φ 1 = zF RT ln 2 1 c c . Иная ситуация с ионами Na + . Их концентрация в клетке примерно в 15 раз меньше, чем в окружающей среде. Постоянный градиент концентрации и разность потенциалов на мембране приводят к тому, что имеется хотя и не- большое, но постоянное просачивание ионов Na + в клетку. Тем не менее, по- стоянная концентрация ионов Na + в клетке поддерживается насосами, выка- чивающими этот ион и работающими за счет энергии гидролиза АТФ. Из этого примера видно, что в отличие от термодинамического равновесия ста- ционарное состояние характеризуется: 1) постоянным притоком веществ в систему и удалением продуктов обмена (в данном случае – приток АТФ и удаление Na + ); 2) постоянной затратой свободной энергии, которая поддерживает по- стоянство концентраций веществ в системе; 3) постоянством термодинамических параметров (включая внутрен- нюю энергию и энтропию) системы, находящейся в стационарном состоянии. Система в стационарном состоянии является открытой системой и мо- жет существовать лишь за счет притока энергии извне (в форме АТФ в на- шем примере) и оттока энергии в окружающую среду (в нашем случае в форме тепла). В биологических системах наиболее важными потоками явля- ются потоки вещества и электрических зарядов. 26 ЛЕКЦИЯ 4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ БИОФИЗИКИ Живая система принципиально гетерогенна. Она построена из множе- ства различных низко- и высокомолекулярных веществ. Очевидно, что свой- ственные живым системам механизмы управления и регуляции, механизмы молекулярной сигнализации не могли бы функционировать в гомогенной системе, построенной из однотипных молекул. Гетерогенность присуща всем уровням биологической организации вплоть до структуры отдельной биоло- гической макромолекулы – нуклеиновой кислоты или белка. Эти информа- ционные макромолекулы представляют собой своего рода тексты, записан- ные соответственно четырех- или двадцатибуквенным алфавитом. Сущест- венны именно структурно-функциональные различия между разными «бук- вами» одного и того же текста. Гомогенные макромолекулы гомополимеров содержатся в живых организмах, но не участвуют в наиболее важных про- цессах биосинтеза и метаболизма. Они выполняют опорную функцию (на- пример, целлюлоза в растениях), служат в качестве депо необходимых ве- ществ (крахмал, гликоген) и т. д. Уже малые индивидуальные различия в структуре функциональных атомных групп (например, различия изомерных углеводородных радикалов), практически не играющие роли в обычной химии, оказываются весьма суще- ственными для реализации тонкого химического баланса в живой системе. Высокий уровень химической и структурной индивидуализации неразрывно связан с биологической функциональностью. Одно из проявлений такой ин- дивидуализации – хиральностьбиологических молекул, обладающих опреде- ленными оптически-активными конфигурациями. Хиральными являются все те молекулы, у которых отсутствуют зеркально-поворотные оси симметрии. Симметрия любой молекулы определяется как наличием тех или иных взаи- мосвязей между ее структурными субъединицами, так и характером (т.е. идентичностью или неидентичностью) и геометрическим расположением. При этом в молекулах различных классов возможны самые разные типы вза- имного расположения составляющих их субъединиц (лигандов) и их струк- турные сочетания. Однако каково бы ни было при этом структурное разнооб- разие возможных молекулярных систем, в молекулах самых различных клас- сов всегда можно выделить то или иное число воображаемых структурных элементов упорядоченности, основными из которых являются точка, ось, плоскость или спираль. Связанные с этими элементами типы хиральности принято подразделять соответственно на центральную, аксиальную, планар- ную или спиральную хиральность. Чрезвычайное многообразие молекул в живых системах не означает очень широкого многообразия «химических мотивов», в них представлен- ных. Напротив, оно возникает в результате различного комбинирования ог- раниченного числа атомных групп, принадлежащих к еще меньшему числу классов органических соединений. Все белки, начиная с вирусных и заканчи- вая белками, образующими наиболее сложные организмы растений и живот- ных, строятся из двадцати канонических аминокислот, все ДНК – из четырех нуклеотидов. Те же или сходные группировки фигурируют в ряде биорегуля- 27 торов. Это химическое единство живой природы непосредственно связано с пройденным ею путем химической и биологической эволюции. Основные биологически функциональные вещества – биополимеры, белки и нуклеиновые кислоты – представляют собой макромолекулы, содер- жащие единичные связи, не сопряженные с двойными связями. Внутренние повороты вокруг единичных связей приводят к появлению поворотных изо- меров (ротамеров), т.е. к различным конформациям цепи. Статистическая механика макромолекул основана именно на рассмотрении их флуктуирую- щего ротамерного строения. Конформационная гибкость биополимерных мо- лекул определяет их важнейшие физико-химические и, в конечном счете, биологические свойства – возникновение и динамику специфической про- странственной структуры, отбираемой в процессе эволюции. Отсутствие делокализованных π-электронов в биополимерной цепи не- посредственно доказывается ее гибкостью. Гибкая цепь не содержит сопря- женных связей. Конформационная подвижность означает отсутствие π- электронной подвижности. Особо важная роль конформационных движений в биологической функциональности биополимеров связана с тем, что их участие в биохимиче- ских процессах, прежде всего каталитическое. ДНК и мРНК являются мат- ричными катализаторами биосинтеза белка, белки действуют как ферменты. Эти биополимеры сохраняют свою целостность в биохимических процессах. Основой биомолекулярных процессов является молекулярное узнавание,оп- ределяемое слабыми взаимодействиями. Соответственно динамика таких процессов есть, прежде всего, конформационная динамика, так как само су- ществование различных конформаций и их изменения также определены слабыми невалентными взаимодействиями, что дает возможность реализо- вать биомолекулярные процессы в мягких условиях и поддерживать эти ус- ловия. В отличие от обычной химии, в которой конформационные превраще- ния имеют значение второстепенное по сравнению с электронными пере- стройками, в биохимии и те и другие процессы связаны неразрывно. Катали- тическая функция белков и нуклеиновых кислот означает их непосредствен- ное участие в электронных перестройках соответствующих субстратов, но это участие реализуется посредством конформационной подвижности. Тем самым, актуальной проблемой молекулярной биофизики является исследова- ние электронно-конформационных взаимодействий(ЭКВ) в биологических молекулярных и надмолекулярных системах. Именно явления ЭКВ, а не осо- бые электронные (например, полупроводниковые) свойства белков и нуклеи- новых кислот (свойства, по-видимому, несуществующие или несуществен- ные) ответственны за их биологическую значимость. Специфические элек- тронные свойства, сводящиеся, прежде всего к делокализации π-электронов в системе сопряженных связей, присущи многим низкомолекулярным соучаст- никам ферментативных процессов – ряду коферментов, простетическим группам и т. д. Эти свойства регулируют ЭКВ в биополимере. Биологически функциональна целостная пространственная структура молекулы белка. Эта конформационная структура полипептидной цепи под- 28 держивается и стабилизируется слабыми взаимодействиями. Возникает гло- була – апериодический кристалл, своеобразная молекулярная машина, пове- дение и свойства которой зависят от индивидуального поведения и положе- ния каждого ее элемента. Все элементы белковой молекулы связаны друг с другом сильными химическими взаимодействиями вдоль полипептидной це- пи и целой гаммой слабых невалентных взаимодействий. Белковая глобула есть система.Иными словами, поведение ее кооперативнона всех уровнях строения, начиная с первичной структуры. Кооперативна любая полимерная цепь, так как конформация данного ее звена не независима от конформаций соседних звеньев. В этом смысле рассмотрение свойств биологических мак- ромолекул основывается на ряде положений физики конденсированного со- стояния, физики твердых и жидких тел. Процессы денатурации биополиме- ров, в частности переходы спираль-клубок, подобны фазовым переходам, в частности, плавлению кристалла. Изучение денатурации белков проводится с целью получения инфор- мации о структуре и свойствах нативных молекул. Это – грубый способ. Све- дения о сложной машине получаются путем ее разрушения. Наиболее мощ- ный метод познания структуры биополимеров – рентгенографический. Вме- сте с тем очень велика и роль ряда других методов, прежде всего спектраль- ных и оптических, являющихся сегодня более доступными и дающих более разнообразную информацию, чем рентгенография. Конечно, эта информация гораздо менее точна и детальна. В молекулярной биофизике как таковой, т. е. в физике белков и нук- леиновых кислот, не возникают проблемы, связанные с неравновесным пове- дением живой открытой системы. Биополимеры исследуются in vitroна тех же основаниях, как и любые другие вещества, не участвующие в процессах жизнедеятельности. Именно это обстоятельство определило быстрое разви- тие молекулярной биофизики, ставшей сегодня наиболее разработанной об- ластью биофизики в целом. Молекулярное узнавание Узнавание (распознавание) сигнала рецептором есть основное свойство регулируемой и регулирующей системы, будь то человеческий мозг или электронная вычислительная машина. Такого рода системы являются уз- нающими. Они осуществляют классификацию объектов, информация о кото- рых сообщается рецепторам. Эта классификация основывается на некотором принципе, заложенном в системе. Узнающие системы могут быть не обучающимися и обучающимися. Вторые представляют особый интерес для кибернетики, теории автоматиче- ского регулирования, для моделирования деятельности головного мозга жи- вотных и человека и т. д. В качестве примера обучаемой узнающей системы можно назвать перцептрон – схему, моделирующую важные черты работы мозга, прежде всего его способность узнавать и классифицировать сигналы, получаемые полем рецепторов. Очевидно, что возможность обучения узнающей системы определяется ее способностью обучаться, т. е. наличием в ее устройстве элементов памяти. 29 Узнавание сигналов такой системой и является обучением с последующим «экзаменом». Способность обучаться, т. е. узнавать, запрограммирована в устройстве системы. Обращаясь к глубинным уровням биологической организации, мы встречаемся с обучаемыми клеточными системами и с необучаемыми моле- кулярными системами узнавания. Клеточное узнавание имеет принципиаль- ное значение для процессов развития, в частности, для возникновения имму- нитета. Молекулярное узнавание определяет все важнейшие молекулярно- биологические процессы – ферментативную активность, редупликацию ДНК, все этапы биосинтеза белка, взаимодействие антиген-антитело и т.д. Молекула белка-фермента узнает молекулу субстрата или некоторую ее часть, как, например, в случае протеолитических ферментов, катализи- рующих гидролиз пептидных связей. Узнавание выражается в образовании реакционного комплекса со специфическим субстратом. Комплексы с инги- биторами и активаторами, с аллостерическими эффекторами также возника- ют в результате специфического узнавания. В узнавании участвуют непо- средственно активный центр фермента, включающий и соответствующий кофактор, и косвенно вся белковая глобула. Само образование глобулы мож- но трактовать как результат узнавания, в частности, узнавания гидрофобных остатков гидрофобными же остатками, вследствие чего формируется ядро глобулы. Более простой случай узнавания реализуется при комплементарном связывании нуклеотидов в двойной спирали ДНК, в гибридной двойной спи- рали ДНК-РНК, в синтетических полинуклеотидах, при взаимодействии ко- дон-антикодон. В биосинтезе белка мы встречаемся с ферментативным узнаванием, происходящем в акте транскрипции, в котором необходимым образом участ- вует РНК-полимераза, и в акте трансляции, где узнающими системами, наря- ду с мРНК, служат аминоацил-тРНК-синтетаза, вся рибосома и ряд других факторов. Из приведенных выше данных следует определение термина «молеку- лярное узнавание». Это понятие имеет смысл применительно к системам, в которых узнающее устройство сохраняет свою целостность в акте узнавания и в ряде случаев возвращается в исходное состояние, совершив преобразова- ние молекулярного сигнала. Одна молекула фермента перерабатывает мно- жество молекул субстрата, одна рибосома «читает» весь текст, записанный в цепи мРНК. Можно было бы говорить о молекулярном узнавании и применительно к обычным химическим реакциям, причем с тем большим основанием, чем они специфичнее. Однако «узнающий» реагент изменяется радикальным об- разом в ходе реакции и утрачивает способность к дальнейшим актам узнава- ния. Таким образом, применяемое здесь определение молекулярного узна- вания указывает на специфичность слабых, главным образом нехимических взаимодействий молекул. Для узнавания существенно стерическое соответ- 30 ствие структуры рецептора и структуры сигнальной молекулы, соответствие, фиксированное или индуцируемое. Специфическое понижение свободной энергии происходит вследствие многоточечного взаимодействия, которое и описывается как континуальное соответствие молекулярных поверхностей и находит свое наглядное выражение в атомных моделях. В сущности, старое представление Фишера о соответствии «ключ-замок» и сводится к узнава- нию. Достижение соответствия, как правило, связано с определенной пере- стройкой взаимодействующих систем и, следовательно, с конформационны- ми превращениями. Реализуются электронно-конформационные взаимодей- ствия – ЭКВ. Молекулярное кодирование в биологии основывается, в конечном сче- те, на молекулярном узнавании. Генетический код связан с функционирова- нием ряда узнающих систем. Естественно возникает вопрос о ферментном коде |