Биофизика курс лекций
 Скачать 1.18 Mb.
|
d S 0 , где ε 0 – электрическая постоянная = 8,85∙10 12 Ф/м, d – рас- стояние между пластинами конденсатора, S – площадь пластины. Удельная емкость (на единицу площади) – с уд = d 0 Отсюда можно найти расстояние между пластинами конденсатора, со- ответствующее толщине липидной части мембраны – d = 2 12 0 10 5 , 0 2 10 85 , 8 уд С 3,5 нм. Важную роль в выяснении морфологии мембран сыграли два метода: дифракция рентгеновских лучей и электронная микроскопия. Дифракция рентгеновских лучей . При исследовании высокоупорядо- ченных кристаллических образцов с помощью метода дифракции рентгенов- ских лучей удаётся получить информацию о структуре с высоким разреше- 51 нием. В случае же малоупорядоченных препаратов возможности этого мето- да ограничены. Некоторые специализированные мембранные системы уже имеют регулярную структуру, и поэтому их можно изучать рентгенострук- турными методами. Примером такого рода служит миелиновая оболочка пе- риферических нервных волокон; она представляет собой мембрану, которая, многократно оборачиваясь вокруг аксона, формирует регулярную систему из концентрических мембранных структур. Исследования дифракции рентге- новских лучей на миелине подтверждают адекватность бислойной модели мембран. Полученные данные показывают, что структура всех мембран сходна: они имеют гидрофобную внутреннюю область с низкой электронной плотностью и два слоя полярных группировок с высокой электронной плот- ностью. Электронная микроскопия . Информацию о расположении мембранных белков дают методы замораживания-скалывания и замораживания- травления. Последовательность действий такова. 1. Замораживание образца. 2. Скалывание с помощью ножа при низкой (- 100 0 С) температуре в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию сре- за, проходящего через образец. Когда плоскость среза проходит через мем- брану, она раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны. 3. При необходимости об- разец подвергают травлению – проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран. 4. После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Именно эту реплику и изучают под электронным микроскопом. Результаты показали, что не все липиды в мембране расположены по принципу бислоя. Физические методы исследования показывают, что липид- ная фаза мембран содержит участки, где липидные молекулы не образуют двойной слой. Основная область приложения биофизики – структурная основа мем- браны, а именно двойной слой фосфолипидных молекул. Динамика мембран Режим функционирования мембраны в значительной степени зависит от микровязкости липидного бислоя и подвижности фосфолипидных моле- кул в мембране, фазового состояния мембранных липидов. Отклонения био- физических характеристик липидного бислоя от нормы связано с разного ро- да патологиями. Важную роль в физиологии клетки играют фазовые перехо- ды в биологических мембранах. Липидная фаза биологических мембран при физиологических условиях (температуре, давлении, химическом составе окружающей среды) находится в жидком агрегатном состоянии. Это доказано тремя биофизическими мето- дами. Флуоресцентный анализ . В нормальном состоянии мембрана не флуо- ресцирует. Чтобы провести исследования мембраны флуоресцентным мето- дом, надо вводить в мембрану молекулы или молекулярные группы, способ- 52 ные к флуоресценции. В качестве флуоресцентных зондов используются: ДМХ – диметиламинохалкон; МБА – 3-метоксибензантрон; АНС – 1-анилин- нафталин-сульфонат. Флуоресцентный анализ дает возможность исследовать подвижность фосфолипидных молекул в мембране, оценить вязкость липид- ной фазы (т.н. микровязкость мембран). Это можно оценить по изменениям спектров флуоресценции, а также по степени поляризации флуоресцентного излучения при освещении мембраны поляризованным светом. Степень связи поляризации и микровязкости мембраны выражается формулой Перрена- Яблонского – ) 1 )( 3 1 1 ( 3 1 1 0 V RT P P , где P 0 – степень поляризации света на неподвижных молекулах; R – универсальная газовая постоянная = 8,31 Дж/(К·моль); Т [K] – температура; V – молярный объем флуоресцирующих молекул; η – микровязкость мембраны; τ – время жизни возбужденного со- стояния. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) . Это явление резкого воз- растания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамаг- нитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле при резонансной частоте волны ν рез : ν рез = h B g , где В – индукция магнитного поля, h – постоянная Планка (6,626176·10 -34 Дж·с), g – гидромагнитное отношение, или g-фактор, зависящий от природы парамагнитных частиц (для свободного электрона g ≈ 2), β – магнетон Бора (0,927 · 10 23 Дж/Тл). Практически удобнее оставлять частоту электромагнит- ной волны постоянной, а медленно менять индукцию магнитного поля. Резо- нансное поглощение энергии будет наблюдаться при В рез = g h . В ЭПР ис- пользуются частоты электромагнитного поля ν10 10 Гц и индукция В0,3 Тл. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения электромаг- нитной волны от величины магнитной индукции. Чем сильнее взаимодейст- вие между атомами и молекулами образца, тем шире спектры ЭПР. Соответ- ственно, чем слабее взаимодействие между частицами (т.е. подвижность мо- лекул выше), тем спектры ЭПР уже. Так как молекулы фосфолипидов диа- магнитны, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-зонды и спин-метки – молекулы или молекулярные группы с неспаренными электро- нами. Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану, спектры поглощения спин-зондами электромагнитной волны дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности о подвижности липидных мо- лекул в мембране. Недостаток метода – внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) . Это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой атомных ядер, обла- дающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны – ν рез = g я · h В я , где g я – ядерный множи- тель Ландье, имеющий разные значения для разных парамагнитных ядер (для 53 протона = 5,58); μ я – ядерный магнетон (составляет 1/1836 часть магнетона Бора). Магнитным моментом обладают, например, такие ядра, как Н 1 1 , С 13 6 , Р 31 15 . Не обладают магнитным моментом Не 4 2 , О 16 8 , С 12 6 . В биологических объ- ектах содержится много протонов ( Н 1 1 ), что дает возможность применять для их исследования ЯМР. В ЯМР используются более сильные магнитные поля (В ≈ 1 Тл), а частоты переменного электромагнитного поля меньше (5·10 7 Гц) чем в ЭПР. Биофизические исследования показали, что подвижность фосфолипид- ных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. В нормаль- ных физиологических условиях липидная часть мембраны находится в жид- ком агрегатном состоянии. Изменение микровязкости липидного окружения мембранных белков- ферментов резко сказывается на их функционировании. Некоторые экспери- ментальные данные свидетельствуют о том, что значительное снижение вяз- кости липидной фазы мембраны обусловливает канцерогенез. При старении вязкость увеличивается. Высокая подвижность липидных молекул обусловливает латеральную (боковую) диффузию. Это хаотическое перемещение молекул липидов и бел- ков в плоскости мембраны. При латеральной диффузии рядом расположен- ные молекулы липидов скачком меняются местами и т.о. молекула переме- щается вдоль поверхности мембраны. Среднее квадратическое перемещение молекул при диффузии за время t можно оценить по формуле Эйнштейна S кв =2 t D , где D – коэффициент латеральной диффузии. Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t оп- ределено экспериментальным методом флуоресцентных меток. Оказалось, что среднее квадратичное перемещение за секунду фосфолипидной молеку- лы по поверхности мембраны эритроцита составило около 5 мкм, что срав- нимо с размерами клеток, т.е. за секунду молекула может обежать всю по- верхность небольшой клетки. Для белковых молекул S кв составляет около 0,2 мкм/с. Рассчитанные по формуле Эйнштейна коэффициенты латеральной диффузии D лип = 6 · 10 -12 м 2 /с, D б = 10 -14 м 2 /с. Частота перескоков молекулы вследствие латеральной диффузии мо- жет быть найдена по формуле ν = 2 f D 3 , где f – площадь, занимаемая одной молекулой в мембране. Для молекул фосфолипидов f ≈ 7 · 10 -19 м 2 , ν = 3 · 10 7 с -1 . Каждая моле- кула, т.о., в среднем претерпевает десятки миллионов перестановок в плос- кости мембраны за секунду, т.е. характерное время одного перескока τ =10 -7 - 10 -8 с. Флип-флоп – диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны. Скорость перескоков молекул с одной поверхности мембраны на другую определена методом спиновых меток на модельных липидных мем- 54 бранах – липосомах. Установлено, что половина меченых молекул претерпе- вает флип-флоп примерно за 6,5 часов. Таким образом, флип-флоп соверша- ется значительно медленнее, чем перескоки при латеральной диффузии. Бла- годаря затрудненному переходу поперек мембраны поддерживается упоря- доченность в молекулярной структуре мембраны, а также асимметрия распо- ложения липидных и белковых молекул и определенная ориентация белков- ферментов поперек мембраны. Физическое состояние и фазовые переходы липидов в мембранах Липидные бислойные мембраны при физиологических условиях – жидкие, время оседлой жизни фосфолипидных молекул в мембране мало – 10 -7 -10 -8 с. Вместе с тем, молекулы в мембране размещены не беспорядочно, в их расположении наблюдается дальний порядок. Фосфолипидные молеку- лы находятся в двойном слое, а их гидрофобные хвосты приблизительно па- раллельны друг другу. Есть порядок и в ориентации полярных гидрофильных голов. Физическое состояние, при котором есть дальний порядок во взаимной ориентации и расположении молекул, но агрегатное состояние жидкое, назы- вается жидкокристаллическим состоянием. Жидкие кристаллы могут образо- вываться не во всех веществах, а в веществах из длинных молекул (попереч- ные размеры которых меньше продольных). Жидкокристаллические струк- туры могут быть: 1) Нематическая (нитевидная) – длинные молекулы ориентированы па- раллельно друг другу; 2) Смектическая (мылообразная) – молекулы параллельны друг другу и располагаются слоями; 3) Холестерическая – молекулы располагаются параллельно друг другу в одной плоскости, но в разных плоскостях ориентации молекул разные. Бислойная липидная фаза биологических мембран соответствует смек- тическому жидкокристаллическому состоянию. Жидкокристаллические структуры очень чувствительны к изменению температуры, давления, химического состава, электрическому полю. Это оп- ределяет изменение структуры липидных бислойных мембран при различ- ных изменениях внешних условий или химического состава. При определен- ных температурах происходит фазовый переход первого рода. В частности, при понижении температуры в фосфолипидной мембране происходит пере- ход из жидкокристаллического в гель-состояние, которое условно иногда на- зывают твердокристаллическим. В гель-состоянии молекулы расположены еще более упорядочено. Все гидрофобные хвосты фосфолипидных молекул в гель-фазе полностью вытянуты строго параллельно друг другу. Поэтому толщина мембраны в гель-фазе больше, чем в жидком кристалле. Однако при переходе из твердого в жидкокристаллическое состояние несколько увеличивается объем, так как возрастает площадь мембраны, при- ходящаяся на одну молекулу. Поскольку в твердокристаллическом состоянии больше порядок, чем в жидком кристалле, ему соответствует меньшая энтро- пия. 55 Для нормального функционирования мембрана должна быть в жидкок- ристаллическом состоянии. Поэтому в живых системах при продолжитель- ном понижении температуры окружающей среды наблюдается адаптацион- ное изменение химического состава мембран, обеспечивающее понижение температуры фазового перехода. Температура фазового перехода понижается при увеличении числа ненасыщенных связей в жирнокислотных хвостах. В хвосте молекулы может быть до четырех ненасыщенных связей. В зависимо- сти от химического состава липидных мембран температура фазового пере- хода гель – жидкий кристалл меняться от -20 (для мембран из ненасыщенных липидов) до +60 0 С (для насыщенных липидов). Модельные липидные мембраны Липосомы (фосфолипидные везикулы) получают обычно при набуха- нии сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембра- ны. При этом все неполярные гидрофобные хвосты находятся внутри мем- браны, и ни один из них не соприкасается с полярными молекулами воды. Чаще получаются несферические липосомы, состоящие из нескольких бимо- лекулярных слоёв – многослойные липосомы. Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомы отделены водной средой. Однослойные липо- сомы можно получить из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточ- ных мембран и используются в медицине. Плоские бислойные липидные мембраны – другой тип модельных мембран. Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластине из фторопласта, погруженной в водную среду. На от- верстие наносят каплю раствора липидов (в спирте, хлороформе, гептане). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образу- ется бимолекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка у краев отверстия. 56 Лекция 7. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Живые системы на всех уровнях организации – открытые системы. По- этому транспорт веществ через биологические мембраны – необходимое ус- ловие жизни. С переносом веществ через мембраны связаны процессы мета- болизма клетки, биоэнергетические процессы, образование биопотенциалов, генерация нервного импульса и др. Большое значение для описания транспорта веществ имеет понятие электрохимического потенциала. Химическим потенциалом данного вещест- ва называется величина, численно равная энергии Гиббса, приходящаяся на один моль этого вещества. Для разбавленного раствора с концентрацией ве- щества С: μ = μ 0 + RTlnC, где μ 0 – стандартный химический потенциал, численно равный химиче- скому потенциалу данного вещества при его концентрации 1 моль/л в рас- творе. Электрохимический потенциал – величина, численно равная энергии Гиббса на один моль данного вещества, помещенного в электрическом поле. Для разбавленных растворов: = μ 0 + RTlnC + ZFφ, где F = 96500 Кл/моль – число Фарадея, Z – заряд иона электролита (в элементарных единицах заряда), φ – потенциал электрического поля, Т [К] – температура. Пассивный перенос веществ через мембрану Пассивный транспорт – это перенос вещества из мест с большим зна- чением электрохимического потенциала к местам с его меньшим значением. Пассивный транспорт идет с уменьшением энергии Гиббса, и поэтому этот процесс может идти самопроизвольно без затраты энергии. Плотность потока вещества при пассивном транспорте подчиняется уравнению Теорелла: j m = - UC ∙ dx d , где U – подвижность частиц, С – концентрация, частное – градиент электрохимического потенциала. Знак минус показывает, что перенос проис- ходит в сторону убывания Плотность потока вещества – это величина, численно равная количест- ву вещества, перенесенного за единицу времени через единицу площади по- верхности, перпендикулярной направлению переноса: j m = t S m (моль/м 2 ∙с) Подставив в уравнение Теорелла выражение для электрохимического потенциала, получим для разбавленных растворов при μ 0 = const уравнение Нернста-Планка: j m = - URT dx dC -UCZF dx d 57 В целом, могут быть две причины переноса вещества при пассивном транспорте: градиент концентрации dx dC и градиент электрического потен- циала dx d Знаки минусов перед градиентами показывают, что градиент концен- трации вызывает перенос вещества от мест с большей концентрацией к мес- там с его меньшей концентрацией; а градиент электрического потенциала вызывает перенос положительных зарядов от мест с большим к местам с меньшим потенциалом. В отдельных случаях вследствие сопряжения этих двух причин может происходить пассивный перенос вещества от мест с меньшей концентрацией к местам с большей концентрацией, если второй член уравнения Нернста- Планка по модулю больше первого, и может происходить перенос вещества от мест с меньшим потенциалом к местам с большим потенциалом, если пер- вый член уравнения по модулю больше второго. В случае неэлектролитов ( |