ГЛАВА 12. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И МЕХАНИЗМ
ДЕЙСТВИЯ ЭНЗИМОВ
Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии.
Согласно этим законам, общая энергия химической системы и еѐ окружения остаѐтся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для преодоления энергетических барьеров и увеличения скорости химического процесса ферменты изменяют механизм и снижают энергию активации медленных (лимитирующих) стадий.
В ферментативных реакциях выделяют три основных этапа, описывающихся схемой:
( ) , где Е – энзим (фермент), S – субстрат, Р – продукт.
I этап – присоединение молекулы субстрата к активному центру фермента посредством слабых взаимодействий и образование фермент- субстратного комплекса (ES). Изменение энергии активации на этом незначительно (рис. 19). Для этого этапа важно сближение и правильная ориентация фермента и субстрата, что повышает эффективность дальнейших преобразований. Кроме того, встраивание субстрата в активный центр приводит к удалению гидратной оболочки с молекулы субстрата, и создаются совершенно иные условия для проведения реакции в безводной среде. В сумме эти факторы приведят к ускорению реакции в 10 4
раз.
Рис. 19. Изменение свободной энергии катализируемой и не катализируемой ферментом реакции.
II этап – преобразование фермент-субстратного комплекса в один или несколько последовательных (промежуточных) комплексов, с образованием в активном центре конечного продукта реакции (EP). Для этого этапа характерно образование переходных состояний, срок существования которых крайне мал (10
–14
-10
–13
с). При этом важным фактором является стабилизация
69 переходного состояния вследствие взаимодействия между функциональными группами субстрата и аминокислот активного центра энзима. Энергия взаимодействия фермента с субстратом называется энергией связывания, и она обеспечивает не только стабилизацию фермент-субстратного комплекса, но и является основным источником свободной энергии, позволяющей снизить энергию активации реакции (рис. 19).
Механизмы действия ферментов на этом этапе объясняются эффектом деформации субстрата, кислотно-основным и ковалентным катализом.
Эффект деформации субстрата объясняет действие гидролаз, лиаз и трансфераз. После связывания с активным центром молекула субстрата изменяет свою геометрию и растягивается относительно структур активного центра. В результате длина связей увеличивается, их прочность, и энергия разрыва уменьшается.
Если в активном центре энзима происходит перенос протонов (Н
+
) в безводной среде, то структура молекулы субстрата также в значительной мере изменяется (за счѐт перераспределения электронных плотностей и зарядов). Этот ферментативный кислотно-основный катализ более эффективен, чем обмен протонов с кислотами и основаниями в растворе (так как вода выступает конкурентом за катионы водорода). При связывании субстрата с активным центром фермента на него оказывают влияние электрофильные и нуклеофильные группы радикалов аминокислот каталитического участка
(а также кофакторы), что вызывает перераспределение электронной плотности на участках субстрата, атакуемого кислотно-основными группами.
Возможен и процесс обратимого переноса функциональных групп от молекул субстрата к аминокислотным остаткам фермента с образованием и разрушением ковалентных связей – ковалентный катализ. Ковалентный катализ подразумевает наличие реакционных групп в активном центре энзима, чаще всего нуклеофильного типа, которые вступают во временные ковалентные связи с субстратом в ходе катализа (таким способом реализуется протеолитическое действие, например, химотрипсина).
Второй этап лимитирует скорость всего катализа. Скорость катализируемого процесса очень чувствительная к величине энергии активации, так уменьшение примерно на 5,7 кДж/моль приводит к увеличению скорости в 10 раз (например, изменение Е
а
соответствующее образованию всего одной водородной связи, может ускорить реакцию в миллион раз). На этом этапе возможно разделение реакции на 2-3 стадии, каждая из которых требует меньшей энергии активации, чем, если бы процесс осуществлялся в одну стадию (рис. 19). При такой разбивке суммарная величина энергии активации будет такой же, как и при одностадийном процессе, но энергетический барьер будет гораздо меньшим.
В результате всех механизмов катализа второго этапа скорость реакции может увеличиться до 10 10
раз.
70 III этап – отделение продукта реакции от фермента ( Е + Р). Стадия непродолжительная и определяется скоростью диффузии продуктов реакции в окружающую среду. Фермент освобождается без изменений. Суммарное повышение скорости катализируемой реакции может достигать 10 14 -10 16 раз. Взаимодействие субстрата с активным центром фермента объясняют следующие теории: 1. Модель «ключ-замок», предложенная в 1890 г. Э. Фишером, предполагает, что субстрат имеет полное геометрическое соответствие активному центру энзима, то есть эти структуры полностью комплементарны друг другу. Данная модель позволяет описывать взаимодействие субстратов с энзимами, имеющими абсолютную специфичность, однако большинство ферментов имеют групповую специфичность. 2. Модель индуцированного соответствия, предложенная в 1958 г. Д. Кошландом, предполагает, что активный центр фермента изменяет конформацию при присоединении субстрата. Кроме того, происходит и перестройка молекул субстрата, что объясняет групповое действие ферментов. Рис. 20. Модели взаимодействия активного центра (АЦ) фермента с субстратом. ГЛАВА 13. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА Основная функция ферментов заключается в повышении скорости химических реакций в соответствии с потребностями живого организма. Для понимания функционирования энзимов изучают кинетику их действия. В 1913 г. Л. Михаэлис и М. Ментен предложили простую модель расчѐта характеристик катализируемой ферментами реакции. Согласно математической модели на скорость ферментативной реакции влияют концентрации фермента и субстрата, температура, рН, наличие активаторов и ингибиторов.
71
Зависимость скорости от количества фермента – линейная, то есть чем больше молекул энзима, тем скорость выше. Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента. Одна международная единица активности (МЕ)
18
соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции:
⁄
Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов.
В 1973 г. была принята новая единица активности ферментов: 1 катал
(кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с.
19
Следует отметить, что в клетке концентрация ферментов всегда на несколько порядков меньше, чем их субстратов, и находится под жестким контролем генома. По этой причине данный фактор изменяется в ограниченных пределах в ходе жизни клеток и организма.
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации
субстрата представлена на рис. 21.
Рис. 21. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.
На гиперболической кривой графика выделяют три участка. При низкой концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональная
18
Количество единиц активности nME определяют по формуле:
( )
( )
19
Количество каталов определяют по формуле:
( )
( )
. Международная единица ферментативной активности МЕ связана с каталом следующими равенствами: 1 кат = 1 моль S
(субстрата)/с = 60 моль S/мин = 60·10 6
мкмоль S/мин = 6·10 7
МЕ, 1 МЕ = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с 160 мккат = 16,67 нкат.
Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную
активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (nME) в образце ткани, делѐнному на массу (мг) белка в этой ткани за единицу времени:
( )
( ) ( )
По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.
72 концентрации субстрата и подчиняется кинетике первого порядка (рис. 21 и 22 А). На средней части графика эта зависимость нарушается, так как практически все активные центры заняты молекулами субстрата и имеют оптимум скорости (реакция смешенного порядка) (рис. 21 и 22 В). На участке, где кривая становится практически параллельной оси ординат, скорость реакции для данных условий максимальна и не зависит от концентрации субстрата (нулевой порядок реакции) (рис. 21 и 22 С). Рис. 22. Взаимодействие молекул субстрата (S) с активными центрами фермента (E) в зависимости от концентрации субстрата. Согласно модели Михаэлис–Ментен было предложено уравнение, описывающее взаимосвязь скорости ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата: , где v – скорость реакции при данной концентрации субстрата, vmax – максимальная скорость реакции, [S] – концентрация субстрата, Km – константа Михаэлиса. В зависимости от концентрации субстрата, можно рассчитать эффективность ферментативной реакции. Одним из важнейших следствий уравнения Михаэлиса–Ментен 20 является величина константы Михаэлиса, которая равна половине максимальной скорости реакции ( ) (рис. 21). Для ряда ферментов этот показатель экспериментально определѐн и его значение заключается в оценке сродства субстрата (аффинности) к ферменту. Высокое значение Kmсвидетельствует о слабом связывании субстрата с активным центром энзима, напротив, низкое значение константы характеризует высокую аффинность (сродство) субстрата к ферменту. Обычно значение Km энзима близко к значению концентрации его субстрата в клетке. Фермент, субстрат которого имеет очень низкую концентрацию в клетке, обычно характеризуется более низким значением Km, чем фермент, субстрат которого имеет более высокую концентрацию. Оптимальной является концентрация субстрата от 0,1 Km до 10 Km, при которой нет утраты контроля со стороны субстрата за скоростью ферментативной реакции. 20 На самом деле уравнение в данном виде предложили Бриггс и Холдейн, но в честь основоположников оно носит название Михаэлиса–Ментен.
73
В целом уровень аффинности ферментов к субстратам в сравнении с другими взаимодействиями белков с лигандами характеризуется низкими значениями, что связано с выполняемой функцией. Слишком прочное связывание в комплексе «энзим-субстрат» сделало бы невозможным обратимый процесс ферментативного катализа. Сравнение величин аффинности приведено на рис. 23.
Рис. 23. Сравнение аффинности (сродства) белков к лигандам.
Экспериментально установлено, что V
max
зависит от константы скорости диссоциации фермент-субстратного комплекса до свободного энзима и продукта реакции (k
кат.
) и общей концентрации фермента.
Кинетическая константа (k
кат.
) по другому называемая числом оборота фермента характеризует количество молекул субстрата, превращѐнных в продукт за единицу времени простым активным центром энзима, полностью насыщенным субстратом. Число оборота большинства ферментов от 1 до 10 4
за секунду, и имеет максимумы у совершенных ферментов (до 10 9
) и определяется скоростью диффузии энзима и субстрата в водной фазе.
Величина отношения
⁄
используется для оценки эффективности энзима, у совершенных ферментов этот показатель имеет наибольшие значения (например, для ацетилхолинэстеразы число оборотов равно 1,6·10 8
, для карбоангидразы – 8,3·10 7
, для каталазы – 4·10 7
). Для большинства ферментов клеток человека для уменьшения скорости диффузии и увеличения эффективности характерно образование четвертичных комплексов (мультиэнзимов), в результате чего метаболический процесс протекает как по конвейеру.
Использование графика, предложенного Михаэлисом и Ментен, не позволяет точно определить величины V
max и K
m
. Для более удобного графического представления Г. Лайнуивер и Д. Берк преобразовали уравнение Михаэлис–Ментен по методу двойных обратных величин:
⁄
⁄
⁄
⁄
Для ферментов, подчиняющихся кинетике Михаэлиса–Ментен, график зависимости
⁄ от
⁄
(в двойных обратных координатах по отношению к использованным ранее координатам v от [S] (рис. 21) представляет собой прямую линию (рис. 24)). Угол наклона прямой равен
⁄
, точка пересечения прямой с осью ординат соответствует
⁄
, а точка
74 пересечения с осью абсцисс соответствует
⁄
. Таким образом, величину
К
m
можно вычислить из данных наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений (рис. 24).
Рис. 24. График в двойных обратных координатах (график Лайнуивера–
Берка).
Графики в двойных обратных координатах очень удобны для выявления различий в механизмах ферментативного катализа, например, при действии на энзимы конкурентных и неконкурентных ингибиторов.
Физиологические концентрации субстратов обычно близки к величине
K
m
, поэтому скорость работы ферментов не достигает предельных значений, которые могут быть достигнуты при изменениях внешних и внутренних условий протекания биохимической реакции.
Аллостерические ферменты (регуляторные ферменты, имеющие четвертичную структуру) не подчиняются кинетике Михаэлиса–Ментен. У таких энзимов зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имеет S-образную (сигмовидную) форму и описываются механизмами кооперативного взаимодействия протомеров друг с другом при последовательном присоединении молекул лигандов (рис. 25).
75 Рис. 25. Сравнение кривых ферментов имеющих третичную и четвертичную структуры строения молекул. ГЛАВА 14. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ Зависимость активности ферментов от температуры Повышение температуры до определѐнных пределов оказывает влияние на скорость ферментативной реакции, подобно влиянию температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, которыйдля большинства ферментов человека составляет 37-38 °С. Однако при температурах выше 40-45 °С активность ферментов начинает снижаться, что связано с тепловой инактивацией и денатурацией структуры белков при высоких температурах (рис. 26). Несмотря на то что критической для человека считают 42 °С, ряд ферментов в пробирке могут выдержать и более высокую температуру. Такие ферменты называют термостабильными. Например, щелочная фосфатаза плаценты (но не других органов) выдерживает 60-минутное нагревание при температуре 60 °С без какой-либо потери каталитической активности. Знание такой закономерности позволяет при анализе активности щелочной фосфатазы крови дифференцировать плацентарный фермент от энзимов печени и других органов.
76
Рис. 26. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
Выделенные в чистом виде ферменты наиболее стабильны при низких температурах, поэтому ферментные препараты, используемые в медицине, обычно хранят при температуре 2-8 °С.
Влияние рН на активность ферментов
Известно, что изменение рН влияет на степень ионизации функциональных групп аминокислотных остатков белка. Именно поэтому изменение рН обычно сопровождается изменением каталитической активности ферментов, хотя известны ферменты, сохраняющие свою активность в широком диапазоне рН.
Рис. 27. Зависимость активности ферментов от значений рН.
В большинстве случаев ферменты наиболее активны в узком диапазоне значений рН, получившем название оптимума рН (рис. 27), отклонение от
77 которого сопровождается резким снижением их каталитической активности.
Чаще всего оптимум рН ферментов организма человека находится в области нейтральных значений, а также в слабощелочной (рН 7,0-8,0) или слабокислой (рН 5,0-6,0) среде. Вместе с тем в организме человека есть ферменты, оптимум рН которых находится в сильнокислой (пепсин) или щелочной (аргиназа и др.) среде. В то время как рН желудочного сока может соответствовать оптимуму рН пепсина, то внутриклеточная среда далеко не всегда обеспечивает оптимум рН для работы ряда ферментов, например аргиназы. Именно поэтому в клетке ферменты могут функционировать в условиях, далѐких от идеальных, а рН среды является важным фактором, влияющим на каталитическую активность ферментов.
ГЛАВА 15. РЕГУЛЯЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Тысячи биохимических реакций, составляющих основу процессов жизнедеятельности, формируют тесно переплетѐнные и связанные между собой сети метаболических путей. Быстрая ответная реакция клетки на постоянно меняющиеся условия внешней среды требует тонкой и согласованной регуляции скоростей химических реакций. По этой причине активность ферментов в клетке непостоянна во времени и регулируется двумя группами механизмов, долговременной регуляцией и быстрым ответом.
К первой группе относятся механизмы контролирующие количество ферментов в клетке, что связано как с изменением скорости синтеза, так и скоростью разрушения энзимов (компартментализация
21
и генетическая регуляция).
Наиболее значимой в этом способе регуляции ферментативных реакций является генетическая регуляция. С этой точки зрения ферменты можно подразделить на три группы:
Конституитивные – такие ферменты, которые образуются в клетке постоянно, независимо от наличия субстрата и их количество меняется незначительно (NO-синтаза, ферменты гликолиза, β-окисления жирных кислот, репарации ДНК).
Индуцируемые (адаптивные) – синтез этих ферментов возрастает при наличии соответствующих стимулов (индукторов).
Репрессируемые – образование таких ферментов в клетке при необходимости подавляется.
Изменение скорости синтеза фермента (индукция или репрессия) обычно зависит от количества определѐнных гормонов или метаболитов процесса. При быстром изменении условий этот путь не может поддерживать гомеостаз.
21
Компартментализация – это сосредоточение ферментов и их субстратов в одном компартменте (одной органелле) – в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, лизосомах, ядре, плазматической мембране и т.п.
78 Вторая группа механизмом регуляции обеспечивает быстрое изменение скорости ферментативной реакции ( доступность субстрата или кофермента; ограниченный (частичный) протеолиз проферментов; аллостерическая регуляция; белок-белковое взаимодействие; ковалентная (химическая) модификация). Также следует отметить, что среди множества ферментов, катализирующих химические реакции в клетках, объектами регуляции являются немногие из них. Они получили название регуляторных или ключевых ферментов. Как правило, ключевые ферменты: - катализируют неравновесные (необратимые) реакции; - находятся в самом начале метаболического пути и(или) на развилке нескольких путей; - являются катализаторами самых медленных (лимитирующих) реакций, определяющим скорость потока субстратов через весь метаболический путь. 15.1. Ингибирование активности ферментов Ингибиторы – вещества, которые взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию фермент-субстратного комплекса. Ингибиторы делятся на две группы неспецифические и специфические. Действие неспецифических ингибиторов не связано с механизмом действия ферментов, а специфических наоборот. К неспецифическим ингибиторам можно отнести соли тяжѐлых металлов. Денатурирующие агенты тоже изменяют скорость ферментативной реакции, но они не являются ингибиторами. Ингибиторы (I) взаимодействуют с ферментами (Е), образуя разные по степени прочности комплексы (ЕI). На основании этого признака ингибирование может быть обратимым и необратимым. По механизму действия ингибиторы делятся на два больших класса: конкурентные и неконкурентные. Необратимое ингибирование происходит в случае образования прочных ковалентных связей между ингибитором и ферментом. Чаще всего модификации подвергается активный центр. Если вещества блокируют определѐнные группы активного центра энзима, то они называются специфическими. Если группа участвует непосредственно в катализе, то ингибирование будет необратимым. Например, диизопропилфторфосфат – необратимый ингибитор сериновых ферментов – образует прочную связь с остатком серина в активном центре фермента, участвующем в катализе (рис. 28). 79 Рис. 28. Необратимое ингибирование активности химотрипсина. В малых концентрациях ионы тяжелых металлов (например, Hg 2+ ) необратимо блокируют HS-группы в активном центре ферментов. В то время как в больших концентрациях они способны вызывать инактивацию ферментов не специфически, связываясь с любыми HS-группами. Ряд лекарственных препаратов являются аналогами субстратов ферментов, однако в ходе их метаболизма образуются вещества, прочно связывающиеся с активным центром фермента и полностью прекращающие его работу. Такие вещества называются суицидными субстратами 22 Обратимые ингибиторы связываются с ферментом, образуя слабые нековалентные связи. Результатом взаимодействия обратимого ингибитора с ферментом является его эффективное, практически мгновенное замедление скорости реакции, которое полностью исчезает при удалении эффектора. Степень торможения зависит от концентрации ингибитора и степенью сродства к нему фермента. Обратимое ингибирование может быть конкурентным, неконкурентным и бесконкурентным. Конкурентное обратимое ингибирование Ингибитор имеет структурное сходство с субстратом и конкурирует с ним за активный центр фермента 23 (рис. 29). Особенностью конкурентного 22 Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, – широко используемый препарат аспирин. Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счѐт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH 2 -группе одной из субъединиц циклооксигеназы. Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления. 23 В качестве ингибиторов ферментов по конкурентному механизму в медицинской практике используют вещества, называемые антиметаболитами. Эти соединения, будучи структурными аналогами природных субстратов, вызывают конкурентное ингибирование ферментов, с одной стороны, и, с другой – могут использоваться этими же ферментами в качестве псевдосубстратов, что приводит к синтезу аномальных продуктов. Аномальные продукты не обладают функциональной активностью; в результате наблюдают снижение скорости определѐнных метаболических путей. В качестве лекарственных препаратов используют следующие антиметаболиты: сульфаниламидные препараты (аналоги пара-аминобензойной кислоты и еѐ производного витамина В с (фолиевой кислоты)), применяемые при лечении бактериальных инфекционных заболеваний, аналоги нуклеотидов для лечения онкологических заболеваний.
80 ингибирования является возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата
24
Рис. 29. Взаимодействие ингибитора с ферментом в ходе конкурентного и неконкурентного ингибирования.
24
Метиловый спирт (метанол) – сильный яд, к которому особенно чувствительна центральная нервная система. Приѐм даже небольшого количества метанола (30-50 мл) может привести к слепоте, парезам и параличам. Более высокие дозы смертельны для человека. Одним из способов лечения отравления метанолом считают введение (внутрь или внутривенно) большого количества этанола, что позволяет насытить все активные центры алкогольдегидрогеназы и, таким образом, затормозить метаболизм метанола.
В результате этанол является конкурентным ингибитором алкогольдегидрогеназы по отношению к метанолу. Хотя взятые по отдельности оба вещества – субстраты одного фермента.
81
Классическим примером конкурентного обратимого ингибирования является ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой. В норме малоновая (пропандиовая) кислота образуется из ацетил-
КоА в процессе биосинтеза жирных кислот. Патологический путь еѐ образования связан с активацией процессов перекисного окисления липидов
(ПОЛ), в этом случае малоновая кислота токсична для организма. Она имеет структурное сходство с сукцинатом (янтарной кислотой – бутандиовой), и, связываясь с активным центром сукцинатдегидрогеназы, блокирует реакцию дегидрирования, в результате скорость образования фумарата снижается.
Поскольку данная реакция является одной из стадий цикла трикарбоновых кислот, скорость данного процесса в целом также уменьшается. Это в свою очередь приводит к снижению скорости синтеза АТФ.
При данном ингибировании максимальная скорость реакции остаѐтся вполне достижимой при создании высоких концентраций субстрата. В данном случае максимальная скорость реакции (V
max
) не изменяется, константа Михаэлиса (K
m
) увеличивается (рис. 30).
Рис. 30. А. Влияние конкурентного ингибитора на график зависимости скорости реакции (V
o
) от концентрации субстрата ([S]). В. Участок конкурентного торможения фермента в двойных обратных координатах
(график Лайнуивера-Берка).
Неконкурентное обратимое ингибирование
В этом случае ингибирования конкуренция между субстратом и ингибитором отсутствует. Ингибитор связывается с другими участками молекулы фермента, изменяется конформация, в том числе и активного центра, в результате скорость ферментативной реакции снижается (рис. 29).
Особенностью неконкурентного ингибитора является его способность связываться с ферментом независимо от субстрата. То есть изменение концентрации субстрата никак не влияет на образование комплекса фермент- ингибитор. В данном случае максимальная скорость реакции (V
max
) уменьшается, константа Михаэлиса (K
m
) субстрата не изменяется (рис. 31).
82 Рис. 31. А. Влияние неконкурентного ингибитора на график зависимости скорости реакции (V o ) от концентрации субстрата ([S]). В. Участок неконкурентного торможения фермента в двойных обратных координатах (график Лайнуивера-Берка). Неконкурентное ингибирование в чистом виде встречают очень редко. Чаще наблюдают смешанное ингибирование, когда под действием ингибитора происходит не только снижение Vmax, но и изменение Кm (рис. 32, Б). При этом ингибитор может связываться не только с ферментом, но и с фермент-субстратным комплексом. В случае если кинетика ингибирования ферментативной активности характеризуется снижением Vmax Кm такой тип ингибирования называют бесконкурентным (рис. 32, А).Бесконкурентный ингибитор связывается с фермент-субстратным комплексом. Повышение концентрации субстрата, увеличивает количество фермент-субстратных комплексов, и в тоже время усиливает и связывание ингибитора с ними. Таким образом, бесконкурентное ингибирование более сложно, чем другие типы ингибирования. А Б Рис. 32. А – бесконкурентное ингибирование, Б – смешанное ингибирование.
83
На практике бесконкурентное и смешанное ингибирование наблюдается только для ферментов с несколькими субстратами.
15.2. Аллостерическая регуляция
Этот тип регуляции свойственен ферментам, в структуре которых, помимо активного центра, есть ещѐ один центр, называемый
аллостерическим (от греч. alios – другой и stereos – пространственный). Он может находиться на значительном расстоянии от активного центра. Как правило, аллостерические центры обнаруживают у ферментов, обладающих четвертичной структурой. При этом аллостерический центр может располагаться на одной субъединице, а активный центр на другой.
Регуляторы
(ингибиторы или
активаторы) присоединяются к аллостерическому центру с помощью нековалентных связей. Это приводит к конформационным изменениям в структуре всей молекулы, в результате чего каталитическая активность фермента либо увеличивается, либо снижается.
Аллостерическое ингибирование может быть положительным и
отрицательным. В качестве отрицательного регулятора может выступать конечный метаболит биохимического процесса или продукт данной реакции, т.е. включается механизм обратной отрицательной связи или
ретроингибирование (рис. 33, А). Он сигнализирует клетке о том, что количество синтезируемого вещества достигло определѐнного уровня, превышение которого нежелательно.
А.
Б.
Рис. 33. А. Механизм регуляции активности фермента по принципу отрицательной обратной связи (схема). Конечный продукт метаболического пути (F) является аллостерическим ингибитором первого фермента этого пути (Е
1
). Б. Механизм регуляции активности фермента по принципу положительной прямой связи (схема). Начальный субстрат метаболического пути (А) является аллостерическим активатором последнего фермента этого пути (Е
5
).
Если регуляторами являются начальный метаболит или субстрат реакции, то говорят о прямой регуляции, она может быть как положительной, так и отрицательной (рис. 33, Б). Также регулятором могут быть метаболиты биохимических путей, каким то образом связанных с данной реакцией.
84 15.3. Ковалентная модификация Ещѐ один быстрый способ регуляции активности фермента – ковалентная модификация, в ходе которой к белку присоединяется определѐнная химическая группа. В предыдущем разделе уже говорилось о фосфорилировании – присоединении фосфата к аминокислотным остаткам белка-субстрата. Эту реакцию катализируют ферменты класса трансфераз – протеинкиназы. При физиологических значениях рН фосфатная группа несет отрицательный заряд. Именно поэтому присоединение при участии протеинкиназ одного или нескольких остатков фосфата изменяет третичную (четвертичную) структуру и каталитическую активность фосфорилированного фермента. Ковалентная модификация ферментов, как правило, обратима. В клетках существуют ферменты, возвращающие ковалентно модифицированные белки в исходное состояние. Например, протеинфосфатазы катализируют реакцию дефосфорилирования фермента (рис. 34). Рис. 34. Регуляция активности ферментов способом ковалентной модификации (фосфорилирование–дефосфорилирование). Примером регуляции активности ферментов путѐм ковалентной модификации является фосфорилирование и дефосфорилирование ключевых ферментов синтеза и распада гликогена. При снижении уровня глюкозы в клетке (например, при интенсивной физической нагрузке) оба фермента фосфорилируются, при этом гликогенфосфорилаза становится активной и запускается процесс расщепления гликогена, а гликогенсинтаза при этом ингибируется, то есть гликоген не синтезируется. При увеличении концентрации глюкозы в крови (например, при после приѐма пищи) оба фермента дефосфорилируются, гликогенсинтаза при этом становится активной, фосфорилаза – неактивной.
85
Фосфорилирование – не единственный способ обратимой ковалентной модификации ферментов в клетке. Необратимо к ферменту могут присоединиться метильные группы (метилирование), моносахариды
(гликозилирование), жирные кислоты (ацилирование) и другие молекулы.
Изменение конформации молекул энзима приводит к изменению сродства активного центра к субстрату.
15.4. Частичный протеолиз (активация зимогена)
Ограниченный (частичный) протеолиз белков подразумевает, что синтез некоторых ферментов осуществляется в виде более крупного предшественника (профермента или зимогена) и при поступлении в нужное место этот энзим активируется через отщепление от него одного или нескольких пептидных фрагментов.
Примером служит активация протеолитических ферментов желудочно- кишечного тракта (трипсиноген, пепсиноген, химотрипсин (рис. 35) прокарбоксипептидазы), факторов свѐртывающей системы крови, лизосомальных ферментов (катепсины).
Рис. 35. Ограниченный протеолиз и связанные с ним конформационные изменения молекулы образуют активный цент химотрипсина (ХТ).
Последовательный протеолиз образует про-химотрипсин (Про-ХТ), π- химотрипсин (π-ХТ) и, в конечном итоге, α-химотрипсин (α-ХТ) представляет собой активную протеазу, три олигопептида которой остаются связанными ковалентными межцепочечными дисульфидными связями.
Секреция ряда ферментов за пределы клетки в неактивном состоянии позволяет предохранить клетки от повреждения (пищеварительные ферменты) или сохранить белок в плазме крови до наступления определенного момента (факторы свѐртывания крови, белки системы комплемента, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем).
Частичный протеолиз – пример регуляции, когда активность фермента изменяется необратимо. Такие ферменты функционируют, как правило, в
86 течение короткого времени, определяемого временем жизни белковой молекулы. 15.5. Белок-белковое взаимодействие (ассоциация-диссоциация четвертичных ферментных комплексов) Белок-белковое взаимодействие – это обладающие высокой специфичностью физические контакты между двумя и более белками. Термин белок-белковое взаимодействие обозначает ситуацию, когда в качестве регулятора выступают не метаболиты биохимических процессов, а специфичные белки. В целом ситуация схожа с аллостерическим механизмом: после влияния каких-либо факторов на специфичные белки изменяется активность этих белков, и они, в свою очередь, воздействуют на нужный фермент. Рис. 36. Организация четвертичного комплекса активного фермента. При диссоциации регуляторных субъединиц активность может как уменьшаться, так и увеличиваться (например, при действии на протеинкиназу А цАМФ происходит диссоциация неактивного тетрамера и образование активного димера (рис. 36)). | 
Скачать 5.92 Mb.