Белки. УП Белки (2). Биохимия белки и ферменты учебное пособие
 Скачать 5.92 Mb.
|
|
ГЛАВА 16. ИЗОФЕРМЕНТЫ Изоферментами называют каталитически сходные множественные формы фермента у организмов одного вида, отличаемые по своим физико- химическим и иммунологическим свойствам. Различают следующие изоферменты: • Генетически независимые белки, кодируемые разными генами. Например, цитозольная и митохондриальная формы малатдегидрогеназы (МДГ), катализирующие обратимую реакцию дегидрирования малата: 87 • Олигомерные ферменты, состоящие из разных субъединиц. Например, фермент гликолиза лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию дегидрирования молочной кислоты (лактата): Фермент является тетрамером, который может быть построен из двух типов субъединиц – H и M. Они получили своѐ название по первым буквам органов, из которых были выделены (от англ. heart – сердце и muscle – мышца). Субъединичный состав ЛДГ в разных тканях зависит от того, какие гены в них экспрессируются. В организме человека присутствует пять изоферментов ЛДГ, образованных Н- и М-субъединицами. Изоферменты ЛДГ различают по оптимуму рН, сродству к субстратам реакции, электрофоретической подвижности (рис. 37). Рис. 37. Изоформы лактатдегидрогеназы. Строение различных изоформ ЛДГ. Распределение на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах. Содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы – слева и фотометрическое сканирование – справа). Преобладание того или иного изофермента в определѐнных тканях имеет большое биологическое значение. Например, в тканях с преобладанием анаэробного метаболизма (скелетных мышцах, печени) присутствует ЛДГ 5 . Данный изофермент нечувствителен к ингибированию физиологическими концентрациями пирувата. Это способствует эффективному протеканию гликолиза (так называют процесс расщепления глюкозы до молочной кислоты, сопровождаемый образованием АТФ) в анаэробных условиях. ЛДГ 1 находится в тканях с преимущественно 88 аэробным типом метаболизма. Активность этого фермента ингибирует пируват. Это препятствует накоплению лактата и создаѐт условия для аэробного окисления пирувата. ГЛАВА 17. ФЕРМЕНТЫ В МЕДИЦИНЕ Исследование активности внутриклеточных ферментов в биоптатах тканей или форменных элементах крови позволяет обнаружить увеличение, снижение, а также полное их отсутствие в организме. В одних случаях изменение активности ферментов может являться критерием предрасположенности человека или фактором риска развития определѐнных заболеваний. В других – позволяет диагностировать врождѐнные или приобретѐнные энзимопатии. Большинство ферментативных реакций в организме протекает внутри клеток в определѐнных субклеточных компартментах. В биологические жидкости, в первую очередь в кровь, внутриклеточные ферменты попадают в результате гибели клеток или увеличения проницаемости клеточных мембран. Кроме того, в крови циркулируют секреторные ферменты, уровень которых при различных заболеваниях также может изменяться. В ходе нормальной жизнедеятельности внутриклеточные ферменты в незначительном количестве поступают в кровоток и другие биологические жидкости. Однако при массовой гибели клеток их количество и активность значительно возрастает, что может быть использовано для дифференцированного анализа. Такой подход в лабораторной диагностике получил называние энзимодиагностика. Примером является изучение активности в плазме ЛДГ, креатинкиназы 25 , аланин- (АлАТ или АЛТ) и аспартатаминотрасфераз (АсАТ или АСТ), а также белка тропонина при заболеваниях сердца и печени. При инфаркте миокарда наблюдают достоверные изменения в крови активности изоферментов креатинкиназы (МВ), ЛДГ 1 и ЛДГ 2 и аспартатаминотрансферазы – АСТ, которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от зоны тканевого повреждения (рис. 38). Дополнительным подтверждением диагноза инфаркта миокарда служит обнаружение активностей ферментов АСТ и ЛДГ в крови больных. При инфаркте миокарда активность АСТ повышается через 4-6 ч; максимум активности наблюдают в течение 2-3 дней. Уровень ЛДГ также увеличивается в плазме крови через несколько часов после закупорки кровеносного сосуда; максимум активности наблюдают на 3-4-й день, затем наступает постепенная нормализация активности. Уровень повышения активности ЛДГ коррелирует с размерами повреждения сердечной мышцы. 25 Креатинкиназа (КК) – фермент, катализирующий обратимую реакцию переноса остатка фосфорной кислоты на молекулу креатина с образованием резервного макроэрга креатинфосфата. Фермент представляет собой димер, в образовании которого могут участвовать два типа субъединиц: М (мышечный) и В (мозговой; от англ. brain – мозг). Именно поэтому существует три варианта изоферментов КК: ММ – мышечный, ВВ – мозговой, и МВ, который обнаруживают в основном в миокарде. 89 Рис. 38. Схема выделения внутриклеточных ферментов в кровь при заболеваниях. Изменения активности креатинкиназы (изоформа МВ), АСТ и ЛДГ, и повышение концентрации сердечного тропонина при инфаркте. При гепатите возрастает активность изоформ ЛДГ 4 и ЛДГ 5 , аланинаминотрансферазы (АЛТ), орнитинкарбамоилтрансферазы, уроканиназы и некоторых других, что связано с разрушением гепатоцитов (рис. 37). Нарушение синтеза определѐнных ферментов обычно приводит к возникновению заболеваний, получивших название энзимопатий. В результате нарушений в работе фермента возникают следующие последствия: - избыточно накапливаемые вещества становятся токсичными в высоких концентрациях; - физиологически нормальные вещества препятствуют нормальному проявлению функции энзимов; - продукты реакции, образуемые ферментом чрезвычайно необходимы другим энзимам. Различают врождѐнные и приобретѐнные энзимопатии. Врождѐнные энзимопатии – это патологии, которые являются следствием изменений участков ДНК (генов) в результате мутаций или действия веществ блокирующих нормальные матричные синтезы и репарацию ДНК. Эти заболевания являются довольно редкими, часто, чем раньше диагностируется 90 такая энзимопатия, тем эффективнее терапия. Приобретѐнные энзимопатии могут быть следствием отравлений, действия инфекций, профессиональными заболеваниями. Например, тяжѐлые врождѐнные заболевания развиваются при отсутствии ферментов, участвующих в обмене гликогена (гликогенозы), а примером приобретѐнных энзимопатий может быть непереносимость лактозы (не толерантность к лактозе), свойственная взрослым и пожилым людям. Энзимотерапия – использование ферментов и регуляторов действия ферментов (активаторов и ингибиторов) в качестве лекарственных средств. В одних случаях это может быть заместительная терапия – применение ферментных препаратов, которые восполняют дефицит собственного фермента в организме. Примером такого рода лечения может быть назначение натурального желудочного сока или смеси соляной кислоты с пепсином при гастритах с пониженной секрецией. Ещѐ одним примером служит использование ферментов поджелудочной железы животных или полученных методами биоинженерии для улучшения пищеварения в кишечнике при энтероколитах. В других случаях врачи используют ферментные препараты, основываясь на знании механизмов их действия. Для очистки гнойных ран, например, применяют протеолитические ферменты (трипсин). Они эффективно расщепляют некротизированные ткани, не влияя на здоровые. Цитохром с – белок, участвующий в процессах тканевого дыхания. Его применяют при асфиксии новорождѐнных, при гипоксии тканей – астматические состояния, сердечная недостаточность, нарушения мозгового и периферического кровообращения и т.п. Рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза входят в состав глазных капель для лечения вирусных конъюнктивитов, также при нанесении на рану они разжижают гной, при ингаляциях уменьшают вязкость слизи, деполимеризуя нуклеиновые кислоты в мокроте. Стрептокиназа и урокиназа используются как активаторы фибринолиза при тромбозах. Трипсин ингалируют при бронхолѐгочных заболеваниях для разжижения густой и вязкой мокроты. Фицин используется в фармацевтической промышленности в качестве добавки к зубным пастам для удаления зубного налѐта. 91 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2 «ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ» Цель: определить активность и специфичность действия ферментов, изучить влияние внешних факторов на скорость ферментативной реакции. Специфичность действия фермента Абсолютная специфичность проявляется в случае, если фермент катализирует превращение единственного субстрата. Опыт 1. Исследуемый материал: фильтрат из арбузных семечек. Реактивы: раствор мочевины (5 %), раствор тиомочевины (5 %), фенолфталеин (0,1 %), дистиллированная вода. Оборудование: пробирки, ступка, фильтровальная бумага, ножницы для очистки семян. Ход работы: в ступке тщательно измельчите 5 очищенных арбузных семян, добавьте 5 мл воды и перемешайте. Приготовьте две пробирки. В первую внесите 1 мл раствора мочевины, во вторую – 1 мл раствора тиомочевины. Затем в обе пробирки добавьте по 1 мл надосадочной жидкости (содержащей уреазу), полученной из арбузных семян, и 2-3 капли фенолфталина. Содержимое пробирок перемешайте и оставьте при комнатной температуре на несколько минут. Активность уразы определяется по обнаружению аммиака: раствор окрашивается в малиновый цвет за счет смещения рН в щелочную сторону. Оформление результатов эксперимента: Внесите результаты опыта в таблицу, сравните интенсивность распада субстратов. Субстрат Мочевина Тиомочевина Цвет раствора Опыт 2. Исследуемый материал: гомогенат дрожжей. Реактивы: дистиллированная вода, раствор крахмала (0,5 %), раствор сахарозы (20 %), раствор гидроксида натрия (10 %), раствор сульфата меди (II) (1 %). Оборудование: пробирки, ступка, фильтровальная бумага, ножницы для очистки семян. Ход работы: для получения сахаразы навеску 0,5 г дрожжей тщательно разотрите в ступке, добавьте 5 мл воды и перемешайте. Приготовьте две пробирки: в первую внесите 1 мл раствора сахарозы, во вторую – 1 мл раствора крахмала, в каждую прилейте по 1 мл полученной надосадочной жидкости раствора дрожжей (для получения фильтрата, полученную суспензию можно отфильтровать или осторожно собрать надосадочную 92 жидкость), содержимое пробирок перемешайте и проинкубируйте при температуре 37º С в течение 15 мин. Далее проведите пробу Троммера (проба положительная в присутствии глюкозы, что свидетельствует об активности сахаразы): в обе пробирки прилейте 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия, а затем по каплям 1 % раствор сульфата меди (II) до образования мути голубого цвета (гидроксид меди – Cu(OH) 2 ). Верхнюю часть содержимого пробирки осторожно нагрейте. Проба считается положительной, если образуется жѐлтый (CuOH) или красный (Cu 2 O) осадок. Оформление результатов эксперимента: Заполните таблицу, сравните полученный результат в пробах сделайте вывод. Субстрат Сахароза Крахмал Образование осадка Сравнение каталитической активности фермента и минерального катализатора. Влияние температуры и рН среды на работу ферментов. Исследуемый материал: фильтрат из картофеля или взвесь соевой муки. Реактивы: дистиллированная вода, 3% раствор пероксида водорода, раствор гидроксида натрия (10 %), раствор серной кислоты (1 н), раствор хлорида железа (III) (5 %). Оборудование: пробирки, фильтровальная бумага, ступка, спиртовка, спички. Ход работы: тщательно измельчите картофель, отожмите и профильтруйте 10 мл сока, либо растворите 4 г соевой муки в 10 мл воды, перемешайте. В четыре пробирки внесите по 1 мл полученной жидкости, в пятую пробирку раствор хлорида железа (III). Содержимое пробирки № 1 прокипятите, в пробирку № 2 добавьте 5 капель раствора серной кислоты, в пробирку № 3 – 5 капель раствора гидроксида натрия, в пробирку № 4 – 5 капель воды (нейтральная среда). Далее в каждую пробирку добавьте по 2 мл 3% раствора пероксида водорода (Н 2 О 2 ) и наблюдайте за пенообразованием (выделение газа – кислорода), что свидетельствует о работе энзима – каталазы или неорганического катализатора – ионов железа. Оформление результатов эксперимента: Внесите результаты опыта в таблицу (количество и скорость пенообразования). Сравните полученные результаты и сделайте вывод. Пробирка №1 №2 №3 №4 №5 Аналитический эффект Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов Исследуемый материал: слюна. 93 Реактивы: дистиллированная вода, раствор хлорида натрия (3 %), раствор сульфата меди (II) (1 %), раствор крахмала (0,5 %), аптечный раствор йода (разбавленный в 5 раз). Оборудование: пробирки, маркер. Ход работы: Приготовление раствора слюны. Ротовую полость ополосните дистиллированной водой в течение 1 минуты. Соберите слюну в пробирку и разведите водой в 3-5 раз. Приготовьте три пробирки. В первую внесите 1 мл дистиллированной, во вторую – 1 мл 3 % раствора хлорида натрия, в третью – 1 мл 1 % раствора сульфата меди (II). Далее в каждую пробирку добавьте по 2 мл разведенной слюны и по 3 мл 0,5 % раствора крахмала, перемешайте и проинкубируйте при температуре 37 ºС в течение 5 мин. Далее в три чистые пробирки внесите по 1 мл полученных растворов (пробирки подпишите) и добавьте по капле раствора йода. Наблюдайте окрашивание в зависимости от степени гидролиза крахмала амилазой: крахмал с йодом даѐт синее окрашивание; продукты гидролиза амилодекстрины – синее и фиолетовое, эритродекстрины – красно-бурое, ахродекстрины и мальтодекстрины не дают окраски с йодом. Сравните интенсивность распада крахмала в зависимости от действия добавленных растворов и сделайте выводы. Если характерной окраски проб не наблюдается, то вторую часть опыта повторите через 10 и 15 минут. Оформление результатов эксперимента: Заполните таблицу, сравните полученный результат в пробах сделайте вывод. Время действия амилазы (мин) Окраска раствора Проба 1 (Н 2 О) Проба 2 (NaCl) Проба 3 (CuSO 4 ) 5 10 15 94 СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ К РАЗДЕЛУ «ФЕРМЕНТЫ» 1. Белки пищи гидролизуются ферментом желудочного сока пепсином. В норме оптимум рН пепсина – 1,5-2,0. Почему у больных с гипоацидным гастритом, при котором повышается рН желудочного сока, нарушается переваривание белков в желудке? При ответе: а) укажите, к какому классу и подклассу ферментов относится пепсин, и какие связи расщепляет пепсин в белках пищи; б) нарисуйте график зависимости активности пепсина от рН и объясните, что такое оптимум рН ферментов; в) объясните, почему повышение рН желудочного сока снижает активность пепсина и нарушает переваривание белков пищи в желудке. 2. У студента на фоне длительной умственной нагрузки появились симптомы повышенной раздражительности, утомляемости, учащѐнное сердцебиение. Врач назначил месячный курс приѐма препарата магнеВ 6 , и уже через неделю студент заметил улучшение состояния здоровья. В состав препарата входят ионы магния и витамин. Каков механизм активации метаболизма и улучшения состояния студента при приѐме магнеВ 6 ? При ответе: а) объясните, какую роль играют ионы металлов в функционировании ферментов, как называется небелковая часть, входящая в состав ферментов; б) укажите роль иона магния в функционировании ферментов; в) объясните роль витаминов в работе ферментов. 3. При террористической атаке в 1995 г. в токийском метро, где пострадали более 6000 человек и 18 погибли, было использовано одно из самых сильных отравляющих веществ – зарин, относящийся к группе органических фторфосфатов. Основными симптомами отравления были сужение зрачков, затруднение дыхания в результате спазмов дыхательных мышц, нарушение работы вегетативной нервной системы и гибель от остановки дыхания и сердца. На чем основано нервно-паралитическое действие зарина? При ответе: а) назовите ферменты-мишени, с которыми взаимодействуют органические фторфосфаты, и опишите особенности строения их активного центра; б) укажите, с какой аминокислотой активного центра взаимодействуют органические фторфосфаты, и обратимо ли это взаимодействие; в) напишите реакцию, снижение скорости которой вызывает перечисленные выше симптомы, и объясните механизм развития токсического действия ФОС. 4. Фермент креатинкиназа (КК) может использоваться в качестве биохимического маркера при диагностике инфаркта миокарда, а также при травмах и повреждениях скелетных мышц. Какая изоформа КК указывает на поражение сердечной мышцы, а какая – на травму скелетных мышц? При ответе: 95 а) опишите олигомерное строение КК, раскройте термин «изоферменты», назовите изоформы КК, укажите, в каких клетках преобладают те или иные изоформы КК; б) назовите данное направление использования фермента в медицине и укажите, на чем оно основано; в) объясните, почему определение изоформ КК в крови помогает в постановке диагноза и почему одна из изоформ практически не определяется в крови, даже при поражении соответствующих клеток. 5. При инфаркте миокарда в сыворотке крови больных изменяется активность ЛДГ, которая поступает из повреждѐнных клеток сердечной мышцы. Обоснуйте целесообразность применения энзимодиагностики для установления причины заболевания. При ответе: а) напишите реакцию, катализируемую ЛДГ; б) назовите кофермент ЛДГ, напишите формулу витамина, входящего в его состав; в) опишите строение изоферментов ЛДГ, особенности распределения их в тканях; г) назовите другие белки – биомаркеры инфаркта миокарда и обоснуйте важность биохимического анализа крови при мониторинге лечения. 6. Метанол (древесный спирт) очень токсичен: приѐм внутрь всего лишь 30 мл может привести к смерти. Это обусловлено действием не столько самого спирта, сколько продукта его катаболизма – формальдегида. Метанол, этанол, изопропанол окисляются под действием алкогольдегидрогеназы печени, причѐм самое низкое значение К м фермент имеет для этанола: NAD + + CH 3 OH → NADH+H + + H 2 C=O (формальдегид) NAD + + C 2 H 5 OH → NADH+H + + CH 3 СН=O (ацетальдегид) Почему при отравлении метанолом больному в качестве антидота вводят 100 мл 30 % этанола? Для ответа: а) дайте определение кинетической характеристике фермента К м ; нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации спирта, на графике покажите К м для этанола и метанола, если известно, что максимальная скорость реакции окисления у них одинаковая; б) объясните, к какому из спиртов (метанолу или этанолу) фермент имеет более высокое сродство; укажите, к какому классу относится алкогольдегидрогеназа; в) поясните, какое значение для процесса катаболизма метанола имеет отношение NAD + /NADH; г) сделайте вывод об эффективности антидотовой терапии. 7. Мужчине 50 лет поставили диагноз «алкоголизм». Когда его в очередной раз доставили в больницу, врач обнаружил симптомы кардиомиопатии (поражение сердечной мышцы) – аритмию, тахикардию. Кроме того, были выявлены потеря чувствительности в области рук и ног, нарушение психического равновесия, ухудшение памяти, депрессия, периодически наблюдались судороги, тошнота и рвота. Врач, зная 96 механизмы токсического действия алкоголя, предположил, что часть симптомов связана с недостаточностью витамина В 1 . Объясните, почему недостаточность какого-либо витамина, в данном случае В 1 , приводит к заболеваниям, а в случае полного отсутствия витамина – к смерти. Для ответа: а) дайте определение понятию «витамин» и «кофермент»; б) приведите примеры реакций, в которых участвует вещество, образовавшееся из указанного витамина; укажите значение данных реакций и ответьте на основной вопрос задачи; в) опишите возможные связи между дефицитом витамина В 1 и поражением миокарда. Ответ. а) Витамины – незаменимые органические факторы питания, в организме не синтезируются и поступают с пищей. В организме витамины превращаются в соответствующие коферменты, в частности витамин В 1 превращается в кофермент тиаминдифосфат (ТДФ). Коферменты – низкомолекулярные соединения небелковой природы, специфически соединяющиеся с соответствующими белками, называемыми апоферментами, и играющие роль активного центра или простетической группы молекулы фермента. б) ТДФ участвует как кофермент в реакциях декарбоксилирования альфа-кетокислот, таких как пируват и α-кетоглутарат. Эти реакции обеспечивают клетки энергией в виде АТФ. При алкоголизме развивается дефицит тиамина, потому что алкоголь блокирует транспорт тиамина через клетки кишечной слизистой оболочки. Уменьшение синтеза ТДФ снижает активность работы ферментов, для которых он необходим, что приводит к нарушению энергетического обмена в тканях, в частности в нервной ткани и миокарде (ТДФ также является коферментом транскетолазы в пентозофосфатном пути катаболизма глюкозы, обеспечивающем клетки рибозо-5-фосфатом, необходимым для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот). в) Молекулярные механизмы развития кардиомиопатии могут быть различными: из-за длительного употребления алкоголя гепатоциты повреждаются и печень не справляется с полным обезвреживанием этанола. Продукт его окисления – ацетальдегид – накапливается в печени и выходит в кровяное русло после принятия высоких доз спиртного. Ацетальдегид – химически активное соединение. Его альдегидная группа может образовывать ковалентные связи с аминогруппами белков миокарда, вызывая изменения в их структуре и функции, что и приводит к химически вызванной кардиомиопатии; кроме того, в сердечной мышце нарушается энергетический обмен и снижается сократительная функция миокарда. 97 СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Основная литература 1. Биологическая химия. Ситуационные задачи и тесты : учебное пособие / А.Е. Губарева Т.Л. Алейникова, В.А. Голенченко, Т.А. Титова ; под редакцией А.Е. Губаревой. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2016. – 528 с. – ISBN 978-5-9704-3561-8. 2. Биохимия : учебник / Л.В. Авдеева, Т.Л. Алейникова, Л.Е. Андрианова [и др.] ; под редакцией Е.С. Северина. – 5-е изд., испр. и доп. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2016. – 768 с. : ил., табл. – ISBN 978-5-9704-3762-9. 3. Вавилова Т.П. Биологическая химия. Биохимия полости рта : учебник / Т.П. Вавилова, А.Е. Медведев. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2016. – 560 с. – ISBN 978-5-9704-3634-9. 4. Нельсон Д. Основы биохимии Ленинджера. В 3 т. Т. 1. Основы биохимии, строение и катализ : перевод с английского / Д. Нельсон, М. Кокс. – 3-е изд., испр. – Москва : Лаборатория знаний, 2017. – 694 с. : ил. – (Лучший зарубежный учебник). – ISBN 978-5-00101-014-2. 5. Северин С.Е. Биологическая химия : учебник / С.Е. Северин, Т.Л. Алейникова, Е.В. Осипов, С.А. Силаева. – 3-е изд., испр. – Москва : Медицинское информационное агентство, 2017. – 496 с. : ил. – ISBN 978-5-9986-0284-9. Дополнительная литература 6. Биологическая химия : учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович. – Минск : Асар ; Москва : БИНОМ, 2008. – 688 с. : ил. – ISBN 978-5-9518-0261-3 (БИНОМ) ; ISBN 978-9-8567- 1137-7 (Асар). 7. Чиркин А.А. Биохимия : учебное пособие / А.А. Чиркин, Е.О. Данченко. – Москва : Медицинская литература, 2010. – 624 с. – ISBN 978-5-91803-002-8. 8. Harvey R.A. Biochemistry / R.A. Harvey, D.R. Ferrier. – Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer business, 2011. – 534 p. – ISBN 978-1-60831-412-6. |