Белки. УП Белки (2). Биохимия белки и ферменты учебное пособие
 Скачать 5.92 Mb.
|
|
ГЛАВА 7. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВ Протеомика (англ. Proteomics) – область молекулярной биологии, посвящѐнная идентификации и количественному анализу белков организмов при использовании биохимических, молекулярно-клеточных и генетических методов исследования. Совокупность всех белков организма определяется геномом, их набор индивидуален для разных клеток, тканей и органов, и называется протеом. Протеом крайне изменчив, однако его изменение может трактоваться, и использоваться в диагностике многих заболеваний. 41 Методов идентификации отдельных белков или их изоформ (изобелков) в клинической и лабораторной диагностике на современном этапе развития биохимии немного, так как это требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также более глубокого представления о роли этих протеинов в метаболизме. К таким методам относят двухмерный электрофорез в полиакриламидном геле с последующим определением конкретных белков методом масс-спектрометрии. Структуру индивидуальных белков исследуют методом рентгеноструктурного анализа и для медико-биологических исследований они представлены на различных информационных ресурсах, например, Protein Data Bank [https://www.rcsb.org/]. Однако в практическом здравоохранении данные методы используются ограничено, из-за высокой стоимости и низкой диагностической ценности. Важными являются методы количественного определения общего белка или отдельных фракций (реже индивидуальных белков или изоформ). К ним относят различные фотометрические методы, электрофорез, хроматографию, диализ, ультрафильтрацию, а также полуколичественный анализ методом «сухой химии» (реакция с определяемым компонентом биожидкости протекает на поверхности тест-полоски) и качественным анализом. Самыми быстрыми и простыми являются качественные реакции и созданные на их основе полуколичественные методы. Например, для определения наличия в моче белков применяются тест-полоски, однако их использование ограничено специфичностью белков, выделяющихся с мочой. При выделении с мочой альбуминов чувствительность тест-систем высокая, однако, степень взаимодействия их с глобулинами ниже, что может приводить к неправильной трактовке результатов лабораторной диагностики. Более точными, и относительно быстрыми являются оптические методы определения белков в плазме, моче или в других жидких системах. Для ориентировочной оценки используют ультрафиолетовый метод, основанный на сильном поглощении УФ-лучей (при λ=260 и λ=280 нм) остатками ароматических аминокислот, однако, в этом же спектре активно поглощают лучи нуклеиновые кислоты, что завышает результат анализа. В биохимических анализаторах используют фотометрию в видимой части спектра, для чего предварительно к раствору, содержащему белок, добавляют вещества, образующие окрашенные продукты с протеинами. К таким методам относят биуретовый метод, метод Лоури, метод Брэдфорда и другие. Биуретовый метод – основан на образовании биуретового комплекса (фиолетового цвета) между пептидными связями белков с Cu 2+ . В методе используют биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO 4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540-560 нм. К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к 42 посторонним веществам, невысокую погрешность. Чувствительность метода – 2-10 мг/мл. Метод Лоури – основан на взаимодействии пептидных связей в щелочной среде с ионами Cu 2+ , которые восстанавливаются до Cu + и реагируют со сложным по составу реактивом Фолина-Чокальтеу 14 . Растворы фотометрируют при 750 нм. Возникающая ярко-синяя окраска раствора пропорциональна количеству белка в растворе. Метод примерно в 100 раз чувствительнее, чем биуретовый. Однако имеет множество ограничений, из- за неустойчивости продуктов реакции и высокой чувствительности к восстановителям. Метод Брэдфорда – основан на реакции красителя кумасси (Coomassie Brilliant Blue G-250) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм; окраска пропорционально количеству белка в растворе. Метод позволяет определить концентрацию белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл и является очень быстрым и высокоэффективным. Электрофоретический метод в биохимии – это способ пространственного разделения белковых молекул, имеющих разный заряд и размеры, путѐм помещения их в электрическое поле. Для замедления процесса перемещения заряженных полиионов смесь разделяемых белков вносят на пластинку покрытую гелем, а сам процесс проводят в буферном растворе, подбирая рН которого можно изменять подвижность биополимеров. В результате разделения на пластинке возникают пятна, содержащие близкие по размеру молекул и зарядам белки – электрофореграмма. При этом пятна, после проявления имеют разную интенсивность окраски, что позволяет определить и количественное содержание каждой фракции белков с помощью денситометра и для получения более точных данных можно составить денситограмму 15 (рис. 16). 14 Реактив Фолина-Чокальтеу состоит из смеси фосфорно-вольфрамовой H 3 PW 12 O 40 и фосфорно- молибденовой Н 3 РМо 12 О 40 кислот. В результате действия восстановителей происходит восстановление смеси оксидов вольфрама (W 8 О 23 ) голубого цвета и молибдена (Мо 8 О 23 ). 15 Денситометрия – метод, основанный на измерении оптической плотности светопоглощающей средой. Денситограмма – кривая изменения оптической плотности. 43 Рис. 16. Электрофореграмма и денситограмма белков сыворотки человека в агаровом геле. Электрофореграмма белков биологических жидкостей человека (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.) позволяет врачам получить значительную диагностическую информацию. Для выделения белкового сгустка иногда используют метод высаливания, основанный на внесении в раствор солей, обладающих высокой гидратируемостью и нарушающих строение гидратной оболочки белковых молекул. Данный процесс не нарушает нативности и позволяет выделить биологически активные биополимеры. От низкомолекулярных примесей белковый раствор может быть очищен методом диализа. Если при диализе, относительно мембраны создают постоянное электрическое поле, то метод называется электродиализом. В основе этих способов лежит неспособность белков проходить через полупроницаемую мембрану и оставаться в растворе, тогда как ионы и молекулы вымываются. Ионообменная хроматография – метод, позволяющий разделять ионы и полярные молекулы на основе их заряда. Она может быть использована для разделения практически любых заряженных молекул, в том числе крупных белков, небольших нуклеотидов и аминокислот. Белки имеют многочисленные функциональные группы, которые могут иметь как положительные, так и отрицательные заряды. Во время ионообменной хроматографии белки разделяются в соответствии с их суммарным зарядом. Разделение осуществляется изменением pH или концентрации ионов подвижной фазы. Изменения вносят поэтапно или непрерывным градиентом. Чаще всего образцы элюируют градиентом соли (NaCl) (рис. 17, а). 44 Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография – разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счѐт их разной способности проникать в поры сферических частиц геля, размером 10-500 мкм. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (большей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры (рис. 17, б). 45 Рис. 17. Методы хроматографического разделения белков. 46 Аффинная хроматография – метод разделения биологических молекул, который основан на специфичных взаимодействиях между белком (или белковым компонентом) и специфическим лигандом связанным с матрицей (рис. 17, в). Методика обладает высокой селективностью и, следовательно, даѐт высокое разрешение, а само вещество может быть очищено в несколько тысяч раз. Аффинная хроматография является уникальной технологией очистки, так как только она позволяет выделить биомолекулы на основе их биологических функций или химической структуры, без потери биологических свойств. Биологическое взаимодействие между лигандом и молекулой-мишенью может быть результатом образования водородных связей, электростатического или гидрофобного взаимодействия. Элюция (вымывание) осуществляется использованием конкурентного лиганда, либо неспецифически изменения рН, ионной силы или полярности. Успешная аффинная очистка требует биоспецифического лиганда, который может быть ковалентно связан с хроматографической матрицей. К лиганду предъявляются два требования: во-первых он должен сохранить своѐ сродство после вымывания не связываемого материала, во-вторых связь между лигандом и молекулой-мишенью должна быть обратимой, чтобы целевое вещество могло быть удалено в активной форме. Некоторые типичные биологические взаимодействия, часто используемые в аффинной хроматографии представлены ниже: – Фермент – субстрат, ингибитор, кофактор; – Антитело – антиген, вирус, клетка; – Лектин – полисахарид, гликопротеин, рецептор на клеточной поверхности, клетка; – Нуклеиновые кислоты – комплементарные последовательности, гистоны, ДНК или РНК полимеразы, белки, связывающие нуклеиновые кислоты; – Гормон, витамин – рецептор, белок-переносчик; – Ионы металлов – белки с полигистидиновым участком в структуре, белки с цистеновыми и/или триптофановыми остатками на поверхности. 47 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 «ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ БЕЛКОВ» Цель: научиться использовать качественные реакции для обнаружения и определения количественного содержания белков в биологических объектах, исследовать причины, вызывающие денатурацию белков. Нингидриновая реакция Нингидриновая реакция – качественная реакция на свободную альфа- аминогруппу. При нагревании с избытком нингидрина аминокислота или пептид подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию, а нингидрин восстанавливается. Восстановленный нингидрин конденсируется с аммиаком и образует окрашенное соединение. Если аминокислота или пептид содержит свободную аминогруппу, то образуется пигмент сине-фиолетового цвета. Данная реакция не специфична, так как ее дают некоторые амины и амиды кислот. Исследуемый материал: 1 % раствор яичного белка, 1 % раствор желатины, 1 % раствор глицина. Реактивы: 1 % раствор нингидрина. Оборудование: пробирки, пипетки, спиртовки. Ход работы: к 5 каплям исследуемого раствора приливают 5 капель водного раствора нингидрина и кипятят 1-2 мин. Оформление результатов эксперимента: Укажите аналитический эффект. В какой пробирке степень окрашивания максимальна? Ксантопротеиновая реакция Ксантопротеиновая реакция обусловлена присутствием в белке циклических аминокислот – фенилаланина, тирозина и триптофана, которые при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные желтого цвета (реакция нитрования бензольного кольца). 48 Исследуемый материал: 1% раствор яичного белка, 1 % раствор желатины. Реактивы: концентрированная HNO 3 , 10 % раствор NaOH. Оборудование: пробирки, пипетки и спиртовки. Ход работы: к 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной HNO 3 и осторожно кипятят. После охлаждения в пробирку добавляют по каплям 10 % раствор NaOH (до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина). Оформление результатов эксперимента: Укажите аналитический эффект. Какие изменения происходят с раствором вначале и после проведения реакции и кипячения? Какой цвет приобретает раствор? Полуколичественная оценка содержания белка в биологических жидкостях Биуретовая реакция на белки обусловлена наличием между аминокислотными остатками пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с ионами меди окрашенные комплексные соединения (красно- фиолетового или сине-фиолетового цвета). Исследуемый материал: молочная сыворотка, исследуемые образцы мочи и слюны. Реактивы: биуретовый реактив, реактив Фолина-Чокалтеу (ФЧ). Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы: Приготовление раствора слюны. Для исследования используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку соберите 1 мл слюны (предварительно полость рта прополаскивают водой) и доведите дистиллированной водой до метки 10 мл (1 мл слюны + 9 мл воды). Приготовление растворов сравнения (необходимы в качестве эталона содержания белка). В пробирку вносят 1 мл молочной сыворотки и добавляют 9 мл дистиллированной воды (получается 0,8 г/л раствор). Повторяют операцию с приготовленным 0,08 г/л раствором и получают в третьей пробирке раствор белка с концентрацией 0,008 г/л. 49 Полученные эталонные растворы вносят в пробирки и добавляют реактивы согласно таблице: Раствор Биуретовый метод Метод Лоури Эталонный раствор белка 0,8 г/л 1 мл белка + 5 мл биуретового реактива 1 мл белка + 5 мл биуретового реактива. Через 10 минут 0,5 мл реактива ФЧ Эталонный раствор белка 0,08 г/г Эталонный раствор белка 0,008 г/л Исследуемая моча № 1 1 мл мочи + 5 мл биуретового реактива 1 мл мочи + 5 мл биуретового реактива. Через 10 минут 0,5 мл реактива ФЧ Исследуемая моча № 2 Раствор слюны 1 мл слюны + 5 мл биуретового реактива 1 мл слюны + 5 мл биуретового реактива. Через 10 минут 0,5 мл реактива ФЧ Оформление результатов эксперимента: Через 2-3 минуты сравните получившиеся окраски экспериментальных проб с эталоном. Внесите результаты опыта в таблицу и сделайте вывод о приблизительном содержании белка в жидкости. Эталонные растворы Исследуемые растворы 0,8 г/л 0,08 г/л 0,008 г/л Моча №1 Моча №2 Слюна Аналитический эффект Осаждение белков при нагревании Почти все белки осаждаются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. Полное и быстрое осаждение белков происходит при достижении изоэлектрической точки. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН около 5,0). Исследуемый материал: раствор яичного белка. Реактивы: 1 % раствор CH 3 COOH, 10 % раствор CH 3 COOH, 10 % раствор NaOH, насыщенный раствор NaCl. Оборудование: пробирки, капельницы, спиртовка. Ход работы: в 5 пробирок наливают по 1 мл раствора яичного белка (без NaCl). В первой пробирке раствор белка нагревают до кипения. Во 2-й пробирке к раствору белка нагревают до кипения и прибавляют 10-15 капель 1 % раствора CH 3 COOH (для слабого подкисления). В 3-ю пробирку добавляют 1 мл 10 % раствора уксусной кислоты (для получения более кислой реакции среды) и нагревают. В 4-ю пробирку добавляют 10-15 капель 10 % раствора NaOH, создавая щелочную среду, и нагревают. В 5-ю пробирку наливают 10-15 капель 1 % раствора уксусной кислоты и 5 капель насыщенного раствора NaCl и нагревают. 50 Оформление результатов эксперимента: Внесите результаты опыта в таблицу и укажите причины наблюдаемых изменений. Пробирка № Наблюдаемые изменения Причина изменений 1 … Осаждение белка органическими растворителями В органических растворителях белки не растворяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации органических растворителей. Исследуемый материал: раствор яичного белка или молочной сыворотки. Реактивы: ацетон, насыщенный раствор NaCl. Оборудование: пробирки, капельницы. Ход работы: в пробирку наливают 1 мл раствора яичного белка и 1-2 мл ацетона и после наблюдаемых изменений – несколько капель насыщенного раствора NaCl. Оформление результатов эксперимента: Объясните причину изменений в растворе белка при добавлении ацетона и усиление процесса при добавлении соли. Необратимая денатурация белков солями тяжѐлых металлов Осаждение белков солями тяжелых металлов происходит при небольших концентрациях солей. Белки адсорбируют ионы тяжелых металлов и образуют с ними нерастворимые солеобразные и комплексные соединения. Исследуемый материал: раствор яичного белка, молоко или молочная сыворотка. Реактивы: 10 % раствор CuSO 4 , 5 % раствор (CH 3 COO) 2 Pb. Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы: в 2 пробирки вносят по 1 мл раствора белка. В первую пробирку добавляют 10 капель раствора ацетата свинца. Во вторую пробирку 1-2 капли раствора сульфата меди и через 1-2 минуты ещѐ 8 капель раствора сульфата меди. Оформление результатов эксперимента: Укажите, какие изменения наблюдаются и почему. Объясните, с какой целью используют растворы белка при пищевом отравлении солями тяжелых металлов. Качественное определение фосфопротеинов в молочной сыворотке Исследуемый материал: молочная сыворотка, растворы, содержащие белок. 51 Реактивы: молибденовый реактив, раствор или кристаллы хлорида олова (II). Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы: в пробирку приливают 1 мл сыворотки и 1 мл молибденового реактива. По каплям вносят раствор SnCl 2 (либо насыпают 1- 2 кристалла соли и перемешивают). Проделайте опыт с другими, имеющимися в наличии растворами белков. Оформление результатов эксперимента: Отметьте, какой цвет приобрѐл раствор в пробирке с молочной сывороткой. Какие компоненты раствора обуславливают развитие окраски? Укажите аналитический эффект с растворами в других пробирках и объясните наличие или отсутствие качественной реакции с исследуемыми растворами. 52 СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ К РАЗДЕЛУ «БЕЛКИ» 1. При некоторых заболеваниях у больных повышается температура тела, рассматриваемая врачами как защитная реакция организма, повышающая его сопротивляемость патогенным бактериям или вирусам. Однако высокие температуры губительны для организма. Объясните, почему при температуре выше 40 °С возникает угроза для жизни человека. При ответе: а) опишите строение глобулярных белков, уровни их структурной организации; укажите связи, удерживающие эти структуры в нативной конформации; б) укажите причину разрыва этих связей при повышении температуры и опишите структурные и функциональные изменения белков в этих условиях; назовите этот процесс и укажите структуру белка, остающуюся неизменной после воздействия высокой температуры; в) назовите белки, помогающие сохранить нативную конформацию белкам клеток, и опишите особенности их строения и функций. 2. Желудочный сок содержит большое количество соляной кислоты, одна из функций которой – денатурация поступающих с пищей белков. Какое значение имеет денатурация пищевых и бактериальных белков в желудке для их переваривания и защиты организма от патогенных микроорганизмов, поступающих с пищей и водой? При ответе: а) представьте схемы строения всех уровней структурной организации белков, и дайте определение термину «нативный белок»; б) укажите связи, которые разрывают протеолитические ферменты в процессе переваривания белков, и их доступность в структуре нативных белков для гидролитического расщепления; в) объясните влияние низкого значения рН (1,5) желудочного сока на конформацию белков, поступающих с пищей, эффективность их переваривания и гибель микроорганизмов в желудке. 3. В реанимационное отделение больницы поступил пациент без сознания. Анализ крови показал повышенную концентрацию глюкозы и кетоновых тел, сниженную концентрацию инсулина, а также изменение рН в кислую сторону – до 7,10 (при норме 7,36-7,40). Улучшение состояния пациента наблюдалось только после введения щелочного раствора и нормализации рН крови с последующим введением инсулина. Почему введение инсулина до восстановления рН крови не приводит к выходу пациента из комы? При ответе необходимо учитывать, что белковый гормон инсулин оказывает своѐ действие на клетки-мишени, взаимодействуя с поверхностными специфическими белками-рецепторами, и снижает концентрацию глюкозы в крови. При ответе: а) опишите строение белков, формирование их конформации и объясните понятие «конформационная лабильность белков»; б) назовите факторы, влияющие на нативную конформацию белков; 53 в) объясните влияние рН на пространственную структуру и функцию белков, предположите механизм снижения действия инсулина на клетки при изменении рН среды. 4. Курильщик, выкуривая одну сигарету, пропускает через свои лѐгкие 20 л дыма, содержащего опасные для здоровья вещества, в том числе и угарный газ. Известно, что монооксид углерода (СО) взаимодействует с гемоглобином. Как влияет угарный газ на функционирование гемоглобина и его способность доставлять кислород тканям? При ответе: а) опишите строение гемоглобина А и его активного центра; б) укажите, в каком участке гемоглобина идѐт присоединение СО, и с каким лигандом он конкурирует; в) объясните, почему длительное пребывание человека в задымленном помещении вызывает вялость, сонливость и сниженную работоспособность гемоглобина. 5. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) – неспецифический показатель воспалительных процессов, который определяют путем добавления в пробу крови 5% раствора цитрата натрия. В норме эритроциты несут отрицательный заряд (дзета-потенциал), за счѐт которого они отталкиваются друг от друга. СОЭ в основном определяется степенью их агрегации (способностью слипаться) за стандартный отрезок времени. Агрегация эритроцитов зависит от величины заряда их мембраны и белкового состава плазмы крови. При воспалительных процессах в крови больных повышается содержание анионных белков острой фазы воспаления – фибриногена, Ig, С-реактивного белка и др. Что вы можете сказать о состоянии здоровья ребѐнка 4,5 мес., у которого анализ крови выявил СОЭ 22 мм/ч? При ответе используйте данные таблицы «Показатели СОЭ в норме»: Возраст СОЭ, мм/ч Новорождѐнные 0-2 Младенцы (до 6 мес.) 12-17 Женщины (моложе 60 лет) До 12 Женщины (старше 60 лет) До 20 Мужчины (моложе 60 лет) До 8 Мужчины (старше 60 лет) До 15 Для ответа: а) напишите в ионизированной форме формулы белковых молекул и их заряд при различных значениях рН; б) укажите, какие аминокислотные остатки преобладают в этих белках, если известно, что их изоэлектрические точки (ИЭТ) лежат в кислой среде; в) объясните, почему при повышении содержания в плазме крови белков – маркеров воспалительного процесса снижается заряд мембраны эритроцитов; г) предположите, назначит врач терапевтическое лечение или повторный анализ СОЭ ребѐнку. |