Белки. УП Белки (2). Биохимия белки и ферменты учебное пособие
 Скачать 5.92 Mb.
|
|
ГЛАВА 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ И ИХ РАСТВОРОВ 18 Белки отличаются по молекулярной массе, форме, суммарному заряду, соотношению полярных и неполярных групп, растворимости, степени устойчивости их растворов. Протеины – высокомолекулярные соединения, их молекулярная масса зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи и количества субъединиц. Она может достигать 1000000 Да (Да – Дальтон – единица массы, равная массе атома водорода) и более. Средняя относительная масса аминокислотного остатка составляет 110, следовательно белок с относительной молекулярной массой 1000000 Да будет состоять приблизительно из 909 аминокислотных остатков. Молекулярная масса белка пропорциональна его коэффициенту седиментации, коэффициенту диффузии и плотности, которые могут быть определены экспериментально. Более простым способом определения молекулярной массы белка является метод гель-фильтрации (молекулярного просеивания). По форме молекул выделят две основные группы белков: глобулярные – цепи уложены в сферические структуры и фибриллярные – полипептидные цепи образуют нити или слои. Пространственная структура функционально- активных белков влияет на такие свойства как гидратация, растворимость и устойчивость растворов. Электрокинетические свойства белков зависят от наличия заряда на поверхности макромолекулы. Белки имеют в своѐм составе радикалы аминокислот способные к ионизации в растворе (кислые – асп и глу, основные – лиз, арг, гис). Суммарный заряд макромолекулы определяется соотношением ионизированных катионных и анионных групп. Таким образом, белки – это полиэлектролиты и полиамфолиты. Так как на поверхности макромолекулы образуется двойной электрический слой, для белков характерна электрофоретическая подвижность. Они, так же как и аминокислоты, проявляют амфотерные (кислотно-основные) химические свойства. Степень ионизации кислых и основных групп радикалов аминокислот зависит от рН среды. В нейтральной среде (рН=7) все ионогенные группы диссоциированы. В кислой среде, с возрастанием концентрации протонов (Н + ), увеличивается положительный заряд (в электрическом поле белок движется к катоду), а в щелочной среде – отрицательный (в электрическом поле белок движется к аноду). Если количество положительно и отрицательно заряженных групп одинаково, такой белок находится в изоэлектрическом состоянии и не может перемещаться в электрическом поле. Значение рН среды, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрическая точка (pI). На свойства белка оказывает влияние соотношение полярных и неполярных групп. Например, на поверхности большинства внутриклеточных белков, преобладают полярные радикалы, а в составе мембранных белков – неполярные. 19 Большинство белков в клетках и межклеточном веществе функционируют в растворѐнном состоянии. Растворимость белков зависит от всех выше перечисленных свойств (молекулярной массы, формы, заряда и т.д.), кроме того от природы растворителя, присутствия в нем растворенных низкомолекулярных веществ. По способности белков растворятся в воде, они делятся на две группы: 1) Растворимые белки (например, белки цитоплазмы, митохондриального матрикса, межклеточной жидкости и др.). 2) Нерастворимые белки (например, мембраносвязанные белки, фибриллярные белки: кератин, коллаген и др.). В водных растворах диполи воды располагаются вокруг полярных и заряженных групп белка и создают гидратную оболочку, которая препятствует агрегации макромолекул. Компактная структура глобулярных белков и наличие заряда на поверхности способствует гидратации и растворению. Чем больше молекула похожа на нить и чем больше на еѐ поверхности гидрофобных аминокислотных остатков, тем хуже еѐ растворимость в воде. Стоит отметить, что все белки на этапе трансляции хорошо растворимы, а на этапе посттрансляционной модификации могут терять это свойство. На растворимость оказывает влияние рН среды, в которой он находится, так как степень диссоциации функциональных групп аминокислотных остатков будет разной. Для большинства водорастворимых белков оптимальные значения рН близки к нейтральным (рН≈7). Лучше растворяются белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, а минимальную растворимость белки имеют в изоэлектрической точке (т.к. отсутствуют силы электростатического отталкивания между молекулами). Присутствие солей в растворе может либо увеличить, либо уменьшить растворимость. При низких концентрациях солей их ионы взаимодействуют с заряженными группами аминокислотных остатков и препятствуют возникновению белок-белковых взаимодействий (т.е. агрегации). Например, глобулины растворимы только в слабых солевых растворах и не растворимы в дистиллированной воде, в то время как альбумины прекрасно растворяются в чистой воде. Высокие концентрации солей, напротив, способствуют агрегации и осаждению белков, что, прежде всего, связано с разрушением гидратной оболочки. Растворы белков имеют свойства сходные с истинными и коллоидными растворами, а также проявляют ряд специфических свойств. Растворимость белков проходит в два этапа – набухание и растворение. Нерастворимые белки способны набухать, то есть увеличивать свою массу и объем за счѐт перераспределения воды между молекулами и включать еѐ в состав гидратных оболочек. Процесс ограниченного набухания приводит к образованию гелей, имеющих свойства и жидкостей, и твѐрдых тел, а также специфические свойства (тиксотропия, синерезис). Большая часть внеклеточных белков межклеточного вещества, соединительной ткани, 20 покровных тканей и структур находится в форме геля. Для них характерно изменение структуры при частичном разрушении межмолекулярных связей при механическом воздействии, и разжижение, что характеризует явление тиксотропии. При нахождении геля в покое связи и структура геля восстанавливаются. Это явление наблюдается при сотрясении мозга. Синерезис – процесс старения геля, за счѐт образования большого числа новых межмолекулярных сшивок и его уплотнения, ведущего к постепенной потере воды. С возрастом многие структуры организма теряют эластичность и упругость (связки, хрящи, кости, кожа, стенки сосудов), что связано с замедлением процессов обмена коллагенов и протеогликанов и развитием синерезиса. В результате неограниченного набухания образуются растворы белков. С коллоидными растворами их сближает большие размеры молекул и молекулярная масса, однако в растворах ВМС отсутствует граница раздела фаз, как и в истинных растворах, и многие свойства коллоидов не реализуются (система является гомогенной и термодинамически устойчивой). Из-за значительных размеров белковых молекул для растворов характерны оптические эффекты – светорассеяние, светопреломление и образование конуса Тиндаля, что используется в методах нефелометрического определения концентрации белков в биологических жидкостях. Также отличием растворов ВМС от коллоидов является их аномально высокое значение осмотического давления. Это явление в крови называется онкотическое давление и создаѐтся белками плазмы. Его физиологическое значение заключается в участии в обмене воды, в артериальной части кровеносного сосуда гидростатическое давление крови (45 мм вод. столба) выше онкотического (30 мм вод. столба), и вода перемещается в ткани. Однако в венозных сосудах гидростатическое давление сильно уменьшается (до 15 мм вод. столба), а онкотическое остаѐтся неизменным. Результатом будет перемещение межклеточной жидкости в сосуд, причѐм интенсивность такого переноса прямо пропорциональна разности давлений. Онкотическое давление крови составляет 0,5 % от общего осмотического давления (740-780 кПа), но оно является определяющим в перемещении воды между кровеносной и лимфатической системами и тканями. Изменение онкотического давления крови вследствие протеинурии или гипопротеинемии приводит к развитию онкотических отѐков. Кроме осмотических и оптических явлений для растворов белков характерен процесс коацервации, то есть расслоения на две фазы – жидкую и гелеобразную (концентрированный раствор биополимера). Это явление в ряде гипотез происхождения жизни объясняет абиогенный этап формирования протоклеточных структур. Мембранное равновесие Доннана (эффект Доннана) – равновесие, возникающее в системе растворов, разделѐнных полупроницаемой 21 мембраной, непроницаемой хотя бы для одного вида присутствующих в системе ионов. Так как растворимые белки имеют существенный суммарный заряд, а в силу размеров не способны проходить через плазматическую мембрану, внутри клеток создаѐтся некоторое избыточное осмотическое давление по отношению к межклеточной жидкости. Результатом эффекта является неравномерное распределение зарядов, что сказывается на формировании мембранного потенциала, а также явлении тургора (клетка ограничено набухает, ткани и органы по этой причине имеют эластичность и упругость). Аномальная вязкость растворов – связана с сильными межмолекулярными взаимодействиями между растворенными белками. Особое значение это явление приобретает при движении крови по сосудам, так как изменение реологических свойств крови и увеличение вязкости увеличивают нагрузку на сердце и сосуды, приводя к серьѐзным нарушениям кровоснабжения. Коагуляция – способность белков частично или полностью терять растворимость и переходить в гелеобразную фазу. Самопроизвольно этот процесс протекает при созревании структурных белков (например, при образовании фибрина из фибриногена) или при внешнем воздействии (что сближает процесс с денатурацией). ГЛАВА 4. НАРУШЕНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ НАТИВНЫХ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ – ДЕНАТУРАЦИЯ, РЕНАТУРАЦИЯ И ФОЛДИНГ Денатурация – процесс разрушения четвертичной, третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы, что приводит к потере нативных свойств. Денатурация отличается от гидролиза белка тем, что при гидролизе необратимо разрушается первичная структура путѐм разрыва пептидных связей. Процесс денатурации обусловлен разрушением большого числа слабых связей и взаимодействий и утратой высокоспецифичной структуры белковой молекулы. Компактная, плотная пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах и становится легко доступной для гидролиза пептидных связей протеолитическими ферментами. По этой причине скорость разрушения и переваривания пищевых белков после термической обработки возрастает. Следует отметить, что денатурированное состояние не обязательно отвечает полностью развѐрнутой конформации белковой молекулы, часто для потери нативности достаточно повреждения небольшой части молекулы. Факторы, вызывающие денатурацию белков бывают физическими и химическими. Физические факторы – ионизирующее излучение (рентгеновские и γ-лучи, ультрафиолетовой излучение), высокая или низкая 22 температура, замена растворителя (например, в водный раствор белка приливают этанол или ацетон), механическое воздействие, ультразвук. В основе механизма действия физических факторов лежит процесс разрушения гидрофобных взаимодействий и ионных связей в белковых молекулах. Следует отметить, что по воздействию высоких температур белки условно делятся на термостабильные (выдерживают нагревание до 90-100 °С) и термолабильные, небольшое нагревание которых приводит к изменению их конформации. Большинство термолабильных белков при нагревании необратимо денатурируют. Химические факторы – изменение рН, высокая концентрация ионов или молекул низкомолекулярных веществ, действие окислителей или восстановителей (озон, перманганат калия, гипохлорит натрия, гидразин и др.), ионов тяжѐлых металлов и металлоидов (свинца, ртути, кадмия, мышьяка и др.). То есть при химической денатурации вещества взаимодействуют с белковой молекулой, что приводит к их деградации. Например, ионы тяжѐлых металлов необратимо и очень прочно связываются с тиольными группами остатков цистеина, нарушая нативность и переводя белок в нерастворимую форму. Денатурация широко используется в медицинской практике, так как позволяет эффективно бороться с микроорганизмами и другими патогенами. Процесс кварцевания помещений, это физический способ обеззараживания воздуха и поверхностей ультрафиолетовым облучением, автоклавирование – обеспечивает стерильность хирургического инструментария, облучение рентгеновскими лучами пластиковых изделий (капельниц, шприцов и прочее) позволяет добиться стерильности без разрушения структуры изделия. Денатурация может быть необратимой и обратимой. Явление восстановления нативной структуры и биологической активности белков называют ренатурацией. Ренатурация характерна для термостабильных белков микроорганизмов термальных источников, которые используют в методах изучения структуры и состава ДНК и РНК (полимеразная цепная реакция). ДНК-полимераза термофилов (фермент, достраивающий цепи дочерних ДНК при репликации) может переносить нагревание до 94-96 °С, при этом осуществляя репликацию ДНК при 72 °С. Ферменты человека в этих условиях подвергаются необратимой денатурации. Белки можно выделить, сохранив их биологические свойства и другими методами – например, высаливанием. Это процесс осаждения белков растворами солей высокой концентрации (используют насыщенные растворы). Сильным высаливающим эффектом обладают сульфаты натрия (Na 2 SO 4 ) и аммония ((NH 4 ) 2 SO 4 ). Механизм высаливания связан с тем, что добавляемые катионы и анионы разрушают гидратную оболочку (возникает конкуренция за молекулы воды между биополимером и ионами), и одновременно, нейтрализуют заряд белка (состояние близкое к изоэлектрической точке). При таком осаждении сохраняются нативные свойства белков (биологическая активность) и сохраняются все уровни 23 структурной организации белковой молекулы. Если затем к осадку белка добавить воду или удалить диализом соль, то белок снова перейдѐт в раствор, и будет проявлять биологическую активность. Высаливание используют для разделения белков сыворотки крови, молока, яичного белка на две фракции: альбумины и глобулины. Фолдинг белков – процесс свѐртывания полипептидной цепи в трѐхмерную пространственную биологически активную структуру, т.е. процесс, в ходе которого белок приобретает вторичную, третичную и, в некоторых случаях, четвертичную структуру. Механизм фолдинга до конца не известен, однако, отдельные элементы этого процесса изучены. Вначале формируются локальные вторичные структуры, затем происходит взаимодействие между удалѐнными участками цепи. Этот процесс протекает до момента формирования доменов, и гидрофобного ядра (участка внутри глобулы, в который направлены гидрофобные радикалы аминокислотных остатков). В конце белок принимает структуру, которая обеспечивает биологическую активность. Фолдинг высокомолекулярных белков, имеющих несколько доменов в своей структуре, протекает при участии белков-шаперонов (от англ. chaperones – наставник). Это класс белков, защищающих белки от денатурации в условиях клетки и облегчающих формирование их нативной конформации. Выделяют конститутивные шапероны (синтез которых постоянен и не зависит от внешних факторов) и индуцибельные (например, белки теплового шока, синтез которых в интактной клетке идѐт слабо, но при любых стрессовых воздействиях резко возрастает). На этапе биосинтеза белка на рибосоме образующиеся полипептидные цепи стабилизируются белками-шаперонами, которые определяют правильность укладывания доменов и в целом глобулы. Примером их действия являются стрессовые воздействия в виде кратковременной ишемии сердечной мышцы в период бега, что повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии, вызванной стенокардией или закупоркой сосудов. Нарушение фолдинга приводит к образованию нерастворимых в цитозоле клеток белков, не имеющих биологической активности и формирующих фибриллярные отложения – амилоид (от лат. amylum – крахмал 5 ). Результатом таких изменений будет развитие патологии – амилоидозов (известно более 15 таких нарушений). Из амилоидозов наиболее известны болезни Альцгеймера и Паркинсона, весьма распространенные среди пожилого населения развитых стран. Болезнь Альцгеймера – нейродегенеративное заболевание (наиболее распространѐнная форма деменции 6 ), ключевыми особенностями которого являются накопление амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в тканях мозга. Вероятно, что образующийся β-амилоид это нарушенная 5 Амилоидные отложения, так же как и крахмал, выявляют при окраске ткани йодом. 6 Приобретѐнное слабоумие, стойкое снижение познавательной деятельности с утратой в той или иной степени ранее усвоенных знаний и практических навыков и затруднением или невозможностью приобретения новых. 24 структура одного из биохимически активных белков нейронов, связанная с недостаточностью определѐнных шаперонов. Ряд амилоидозов имеет инфекционную природу, развитие которых связано с проникновением в организм человека и животных инфекционных белков – прионов (от англ. prion от protein «белок» + infection «инфекция»). Прионы – особый класс инфекционных агентов, представленных белками с аномальной третичной структурой (рис. 8), не содержащими нуклеиновые кислоты. Рис. 8. Схема превращения молекулы нормального (клеточного) прионного белка (А) в молекулу инфекционного прионного белка (Б). Все млекопитающие, включая и человека, продуцируют прионовый белок (PrP – prion protein), роль которого до конца не ясна. Многие исследователи считают, что PrP участвует в передаче нервного импульса. При изменении пространственной структуры в результате мутации или внешнем воздействии (до конца не выяснено) образуется патологическая форма приона (PrPsc). Они способны трансформировать собственные белки организма в патологические формы и поражать нервную ткань. Прионные белки имеют высокую устойчивость к денатурирующим факторам и к действию протеолитических ферментов, повреждая нервную ткань с образованием губчатой структуры вследствие развития амилоидных бляшек и без классической воспалительной реакции. Они являются причиной особых «медленных инфекций», характеризующихся очень длительным инкубационным периодом (десятки лет), прогрессирующим течением, необычностью поражения тканей и неизбежным смертельным исходом. У людей описано четыре прионовых заболевания: - болезнь куру – отмечалась у аборигенов острова Новая Гвинея, и связывалась с каннибализмом, при котором и происходило заражение; - болезнь Крейтцфельдта-Якоба – патология, связанная с проникновением в организм человека прионов из мяса коров, зараженных 25 «коровьем бешенством» или введением препаратов гипофиза животных детям, отстающих в росте; - синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера – очень редкое, обычно семейное, смертельное нейродегенеративное заболевание, поражающее пациентов в возрасте от 20 до 60 лет, причиной которого является мутация гена прионового белка; - фатальная семейная бессонница (англ. Fatal familia linsomnia, FFI) – редкое неизлечимое наследственное, нейродегенеративное (доминантно- наследуемое) прионное заболевание, при котором больной неизбежно умирает от бессонницы. Известно всего 40 семей, поражѐнных этой болезнью. |