Белки. УП Белки (2). Биохимия белки и ферменты учебное пособие
 Скачать 5.92 Mb.
|
|
ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТЫ. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ Ферменты или энзимы (от лат. fermentum – брожение; от греч. enzyme – в дрожжах) – белки, рибосомы или комплексы РНК-белки, являющиеся биокатализаторами и ускоряющие химические реакции, за счѐт изменения механизма реакции и понижения энергии активации реагентов. Биокатализаторы образованные РНК называют рибозимы, однако их эффективность гораздо ниже, чем у белков-ферментов. Также существуют белки, имеющие несколько функций, одна из которых ферментативная. Примером таких веществ являются абзимы (англ. abzymes, antibodies as enzymes) – антитела, имеющие каталитическую функцию. Такая способность возникает в результате формирования промежуточного продукта при связывании антитела с антигеном (имитация переходного комплекса «энзим- субстрат» ферментативной реакции). В ферментативном катализе выделяют следующие понятия: субстрат, продукт, переходный комплекс, энергия активации. Субстрат – вещество, являющееся исходным реагентом в реакции или одним из промежуточных неустойчивых продуктов, использующихся в последующих ферментативных реакциях. Продукт – устойчивое вещество, образующееся в ходе реакции. Переходный комплекс – неустойчивый комплекс «фермент-субстрат», в котором частично разрушены старые связи и образованы новые. Энергия активации (Е а ) – экспериментально определяемый параметр химической реакции, характеризующий зависимость константы химического равновесия от температуры. Чем больше величина Е а , тем ниже скорость реакции, по этой причине ферментативные реакции изменяют механизм процесса таким образом, чтобы понизить энергию активации для лимитирующих стадий сложной реакции. Ферменты характеризуются следующими свойствами, имеющими сходство с химическими катализаторами: 1. не расходуются и не образуются в процессе реакции; 2. катализируют только энергетически возможные реакции; 3. не изменяют свободную энергию субстратов и продуктов реакции; 4. не смещают равновесия реакции, и ускоряют его наступление. Между ферментами и химическими катализаторами имеются следующие различия: 1. Ферменты являются белками и поэтому катализируют реакции в «мягких» условиях (давление 1 атм., температура 37 °С и около нейтральное значение рН) 16 2. Ферменты обладают физико-химическими свойствами, характерными для белков. 16 Организмы, обитающие в экстремальных условиях, например на больших глубинах в водоѐмах, или в термальных источниках, синтезируют ферменты, устойчивые к высоким температурам (до +100 °С), сверхвысокому давлению, сильнощелочной или сильнокислой среде. 55 3. Для ферментов характерна более высокая эффективность, чем для неорганических катализаторов. Например, энергия активации разложения пероксида водорода 2Н 2 О 2 → 2Н 2 О + О 2 равна 75,2 кДж/моль. При добавлении неорганического катализатора (Pt) энергия активации снижается до 50,2 кДж/моль. Фермент каталаза снижает энергию активации до 8,3 кДж/моль. 4. Активность фермента регулируется и контролируется на генетическом уровне (на этапе синтеза белка-фермента и его фолдинга) и посредством низкомолекулярных соединений (эффекторов). 5. Ферменты обладают специфичностью, то есть способны катализировать реакции только с определѐнными субстратами или химическими связями. 6. В организме человека, высших животных и растений основная часть метаболических процессов осуществляется полиферментными (мультиэнзимными) комплексами. В результате происходит многоэтапный процесс превращения исходных субстратов с минимальным ростом энтропии и потерей энергии, что увеличивает эффективность их работы. ГЛАВА 9. КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ На современном этапе развития биохимии известно более 3500 различных ферментов, название которых может быть тривиальным, то есть построено по принципу: суффикс в названии субстрата заменяется на –аза (например, лактаза – гидролизует дисахарид лактозу; фумараза – присоединяет молекулу воды к фумарату; амилаза – гидролизует α-1,4- гликозидные связи в амилазе крахмала). Однако такой подход не показывает механизм действия ферментов и не всегда рационален (особенно в научных исследованиях). По этой причине в 1961 г в Москве V Международный биохимический союз принял современную классификацию ферментов. В соответствии с этой классификацией все ферменты делятся на классы по типу катализируемой реакции. Каждый класс подразделяется на подклассы – по природе атакуемой химической группы, а подклассы делятся на подподклассы – по характеру атакуемой связи или по природе акцептора. Для ферментов имеющих тривиальное название также разработано и систематическое. Выделяют 7 классов ферментов, отличающихся особенностями осуществляемых реакций, сродством к различным типам связей и прочими особенностями. Класс 1 – Оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов (окислителя – акцептора и восстановителя – донора восстановительных эквивалентов (протонов и электронов)). Их систематическое название составляют по форме: «донор: акцептор-оксидоредуктаза». Например, 56 лактатдегидрогеназа имеет следующее систематическое название – лактат: НАД + -оксидоредуктаза. Класс оксидоредуктаз включает 22 подкласса, в качестве важнейших можно выделить следующие подклассы: - дегидрогеназы и редуктазы – учувствуют в отщеплении или присоединении молекулы водорода. В качестве акцептора восстановительных эквивалентов от органического субстрата выступают коферменты – НАД + , НАДФ + , ФАД или ФМН: - оксидазы – переносят электроны и протоны на молекулярный кислород или катализируют окисление субстратов молекулярным кислородом в качестве акцептора электронов без его включения в молекулу субстрата; - пероксидазы – синтезируют пероксид водорода для частичного или полного окисления органических субстратов или разрушают молекулы пероксидов (органических и неорганических); 57 - оксигеназы: монооксигеназы (гидроксилазы) внедряют в субстрат один атом кислорода (из О 2 ) в форме гидроксигруппы, и диоксигеназы – включают двухатомную молекулу кислорода в окисляемый субстрат. Класс 2 – Трансферазы – осуществляют межмолекулярный перенос функциональных групп или групп атомов от молекулы донора на молекулу акцептора. Они подразделяются в зависимости от переносимой группы. Название этих ферментов составляют по формуле «донор: акцептор- транспортируемая группа-трансфераза». Коферментами чаще всего являются активные формы витаминов: (В 6 ) пиридоксальфосфат, коэнзим А (В 5 ), тетрагидрофолиевая кислота (В с ), метилкобаламин (В 12 ). Класс подразделяется на 9 подклассов в зависимости от строения переносимых групп; к важнейшим подклассам трансфераз относят: - аминотрансферазы – осуществляют перенос аминогруппы с α- аминокислоты на α-кетокарбоновую кислоту, в результате образуются новые амино- и кетокислоты: - ацилтрансферазы – ферменты, переносящие ацильный остаток (остаток карбоновой кислоты) на субстрат; - метил-трансферазы – осуществляют перенос одноуглеродного фрагмента; 58 - гликозилтрансферазы – переносят остатки активированных моносахаридов; - киназы (фосфотрансферазы) – переносят фосфатные группы от макроэргов (чаще от АТФ) на субстраты; Класс 3 – Гидролазы – катализируют реакции гидролиза (расщепления ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Подразделяют в зависимости от расщепляемой связи на 13 подклассов. Ввиду сложности многих субстратов у ряда ферментов сохранены тривиальные названия, например, пепсин, трипсин. Коферменты отсутствуют. Гидролазы широко представлены ферментами желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин, липаза, амилаза и другие) и лизосомальными ферментами. Осуществляют распад макромолекул, образуя легко адсорбируемые мономеры. Подклассы: Эстеразы – гидролизуют сложноэфирные связи (к ним принадлежат, например, липазы); - Фосфатазы – гидролизуют фосфоэфирную связь с отщеплением фосфорной кислоты от субстрата; 59 - Гликозидазы – гидролизуют О- и N-гликозидные связи; - Протеазы и пептидазы – осуществляют гидролиз пептидных связей у белков и пептидов; - Нуклеазы – катализируют гидролиз связей в нуклеиновых кислотах. Класс 4 – Лиазы (синтазы) – класс ферментов, который отщепляет группы от субстратов по негидролитическому (без участия воды) и неокислительному механизмам, часто с образованием двойных связей или циклических структур. Также могут осуществлять присоединение низкомолекулярных веществ по двойной связи. Коферментами в ферментах класса являются пиридоксальфосфат, тиаминдифосфат, а в качестве кофакторов выступают ионы магния и кобальта. Ферменты делятся на подклассы в зависимости от природы атакуемой связи: - углерод-углерод лиазы – образуют или атакуют связи между атомами углерода - углерод-кислород лиазы; 60 - углерод-азот лиазы; - углерод-сера лиазы; - углерод-галоген лиазы; - фосфор-кислород лиазы; - углерод-фосфор лиазы. Класс 5 – Изомеразы – катализируют образование структурных, оптических и стереоизомеров за счѐт внутримолекулярного превращения веществ. К их коферментам относятся пиридоксальфосфат, дезоксиаденозилкобаламин, глутатион, фосфаты моносахаридов (глюкозо- 1,6-дифосфат) и др. Выделяют подклассы изомераз в зависимости от типа реакции. Например: - рацемазы – осуществляют обратимое превращение L- и D- стереоизомеров; - эпимеразы – изменяют конфигурацию при одном из хиральных атомов углерода, например, взаимопревращение α- и β-изомеров; - внутримолекулярные оксидоредуктазы, например ферменты, катализирующие взаимопревращение альдоз в кетозы; - внутримолекулярные трансферазы или мутазы – переносят функциональные группы внутри молекулы; 61 Класс 6 – Лигазы (синтетазы) – катализируют соединение двух молекул, сопряжѐнное с использованием энергии высокоэнергетических связей (например, АТФ). Коферментами этого класса являются нуклеотидные (УТФ) и биотиновые (витамин Н) производные и активные формы фолиевой кислоты. Выделяют 6 подклассов по виду образуемой связи: углерод-кислород (C–O), углерод-сера (C–S), углерод-азот (C–N), углерод-углерод (C–C), фосфор-кислород (Р–О) и азот-металл (N–Me). Класс 7 17 – Транслоказы – отдельный класс ферментов, катализирующих перенос ионов или молекул через мембраны или их разделение в мембранах. Этот класс энзимов сформировался из ранее принадлежащих другим классам ферментов. Выделяют 6 подклассов транслоказ, разделение основано на типе переносимой через мембрану частицы. - ферменты, катализирующие транслокацию катионов водорода или протонов (H + ); - ферменты, катализирующие транслокацию неорганических катионов и их хелатов; 17 Класс ферментов выделен только в октябре 2018 года. Наиболее важный пример транслоказ – АТФ- синтаза. Ранее этот фермент относился к третьему классу и был назван по номенклатуре – АТФ- фосфогидролаза, но название не соответствует характеру работы фермента, т.к. гидролиз АТФ практически не происходит. За ферментами нового класса, перемещѐнными к транслоказам, сохранились прежние систематические названия. 62 - ферменты, катализирующие транслокацию неорганических анионов; - ферменты, катализирующие транслокацию аминокислот и пептидов; - ферменты, катализирующие транслокацию углеводов и их производных; - ферменты, катализирующие транслокацию иных соединений. К ферментам этого класса не относятся каналы (поры), изменяющие конформацию между открытым и закрытым состоянием, в ответ на какое либо воздействие, а так же транспортеры, которые не зависят от фермент- катализируемых реакций. ГЛАВА 10. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Под специфичностью ферментов понимают их избирательное взаимодействие с определѐнными субстратами, что отличает их от небиологических катализаторов. Специфичность основана на комплементарности структуры субстрата и активного центра фермента. Выделяют четыре вида специфичности: Абсолютная специфичность – фермент катализирует превращения только одного субстрата. Например, уреаза расщепляет только мочевину, глюкокиназа фосфорилирует только D-глюкозу. Относительная специфичность – фермент расщепляет определѐнный тип связи. Например, липаза гидролизует сложноэфирные связи нейтральных жиров, при этом жирнокислотный состав не влияет на этот процесс (если нейтральный жир в просвете кишечника остаѐтся в жидком эмульгированном состоянии). 63 Относительная групповая специфичность – фермент расщепляет определѐнный тип связи, но в еѐ образовании участвуют определѐнные функциональные группы. Такие ферменты обычно работают в процессе пищеварения. Например, пищеварительные ферменты, гидролизующие пептидную связь в белках, относятся к протеиназам (относительная специфичность), но среди них пепсин расщепляет пептидную связь, образованную аминогруппой ароматических аминокислот; трипсин – пептидную связь, образованную карбоксильной группой основных аминокислот, а химотрипсин – карбоксильной группой ароматических аминокислот. Стереохимическая специфичность – фермент катализирует превращение только определѐнного стереоизомера. Пример стереохимической специфичности – гидратация фумарата (фумаровой кислоты) ферментом фумаразой: Примером стереохимической специфичности также является работа аспартазы, которая осуществляет отщепление (или присоединение) молекулы аммиака от аспарагиновой до фумаровой кислоты: 64 ГЛАВА 11. СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ Несмотря на то, что молекулярная масса различных ферментов колеблется в очень широком диапазоне, размеры белковых молекул ферментов намного превышают размеры их субстратов. Именно поэтому ферменты взаимодействуют с субстратами сравнительно небольшим участком, получившим название «активный центр». Активный центр – участок молекулы фермента, образованный боковыми радикалами аминокислот, осуществляющий связывание субстрата и его каталитическое превращение. Поскольку он формируется на уровне третичной структуры белка, аминокислотные остатки, входящие в его состав, могут быть расположены в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга. Активный центр представляет собой полость или канал внутри белковой молекулы энзима, структура которого обеспечивает отсутствие или ограничение поступления молекул воды, за счѐт чего и становится возможным осуществление ферментативной реакции. В составе активного центра выделяют участки субстрат-связывающий (якорный) и каталитический, обеспечивающие ферментативное превращение субстрата (рис. 18). Рис. 18. Функционирование активного центра фермента. Связывание субстрата с активным центром фермента осуществляется путѐм образования нековалентных связей (водородных, электростатических, гидрофобных) с аминокислотными остатками субстрат-связывающего участка. Это вызывает дестабилизацию связей в молекуле субстрата, которые атакуются каталитическими аминокислотными остатками с образованием продукта реакции (рис. 18). При этом активный центр не является жѐсткой структурой. Его структура изменяется при связывании субстрата. 65 По строению ферменты делятся на простые (однокомпонентные) и сложные (двух- и многокомпонентные) белки. Простые ферменты состоят из аминокислот. Сложные белки-энзимы состоят из белковой части – апофермента и небелковой части – кофактора или кофермента. Большинство ферментов для проявления ферментативной активности нуждается в низкомолекулярных органических соединениях небелковой природы (коферментах) и/или в ионах металлов (кофакторах). Термин «кофермент» был введѐн в начале XX века и обозначал часть некоторых ферментов, которая легко отделялась от белковой молекулы и удалялась через полупроницаемую мембрану при диализе. Несколько позже было выяснено, что большинство ферментов состоит из термолабильной белковой части и термостабильного небелкового фактора – кофермента (кофактора). Кофермент или кофактор с белковой молекулой (апоферментом) формируют молекулу холофермента, обладающую каталитической активностью. В зависимости от прочности связи апофермента и небелкового фактора в холоферменте различают коферменты и простетические группы. Коферменты связаны с апоферментом нековалентными связями и потому легко от него диссоциируют. Простетические группы связаны с апоферментом ковалентно. Кофакторы играют очень важную роль в ферментативном катализе. - Они способствуют либо изменению трѐхмерной структуры белка- фермента, что улучшает взаимодействие фермента с субстратом, либо изменению структуры субстрата. - Коферменты (простетические группы), как правило, выступают в качестве дополнительных субстратов ферментативной реакции. Они могут быть донорами или акцепторами определѐнных химических группировок (например, метильной группы, аминогруппы) и электронов. Очень важную группу коферментов составляют вещества, осуществляющие перенос восстановительных эквивалентов в окислительно- восстановительных реакциях. Важнейшие коферменты являются производными водорастворимых витаминов, они представлены в таблице 3. Таблица 3. Коферменты Название Формула Основные функции 66 Никотинамид адениндинук леотид – НАД + и никотинамид адениндину- клеотидфосф ат – НАДФ + где R – Н или РО 3 2– Производные витамина РР (ниацина), который представляет собой амид никотиновой кислоты (никотинамид). Коферменты нековалентно связаны с активным центром ферментов оксидоредуктаз (подкласс дегидрогеназы и редуктазы) и осуществляют отщепление от субстрата (α-гидрокси-, α-кето- или α- аминокислот) молекулы Н 2 или еѐ присоединение (реакции гидрирования и дегидрирования) Флавинадени ндинуклеотид – ФАД Производное витамина В 2 (рибофлавина). Кофермент ковалентно связан с активным центром ферментов оксидоредуктаз (подкласса дегидрогеназы) и осуществляют отщепление от субстрата (в положении между α и β углеродами насыщенных карбоновых кислот) молекулы Н 2 или еѐ присоединение Флавинмонон уклеотид – ФМН Производное витамина В 2 (рибофлавина). Кофермент ковалентно связан с активным центром ферментов оксидоредуктаз (подкласса оксидаз) и отщепляет катионы водорода и электроны от окисляемого вещества (например, от НАДН+Н + ) Тиаминпироф осфат (тиаминдифо сфат) – ТПФ или ТДФ Производное витамина В 1 , ковалентно связан с АЦ фермента. Кофермент лиаз и трансфераз, осуществляющих перенос углеродных остатков (транскетолазы) и декарбоксилирование (пируватдегидрогеназа декарбоксилирующая) Тетрагидрофо лиевая кислота (тетрагидроф олаты) – ТГФК Производное витамина В с – фолиевой кислоты, ковалентно связанный с АЦ фермента. Функция кофермента – перенос одноуглеродных фрагментов при работе С 1 - трансфераз 67 Пиридоксаль фосфат – ПФ Производное витамина В 6 – пиридоксина, ковалентно связанный с АЦ фермента. Перенос аминогрупп при работе аминотрансфераз. ПФ кофермент декарбоксилаз участвующих в синтезе биогенных аминов из аминокислот – серотонина, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), гистамина. Является коферментом фосфорилазы гликогена, участвует в синтезе гема, сфинголипидов Биотин Производное витамина Н, ковалентно связанный с АЦ фермента. Участник реакций карбоксилирования, осуществляемый лигазами (карбоксилазами) Коферментами могут быть вещества невитаминной природы, которые синтезируются в клетках, например, аминокислоты, пептиды (глутатион, селеноглутатион), нуклеотиды, гем, порфирины, S-аденозилметионин (SAM), липоевая кислота, коэнзим А (HSK o A), коэнзим Q (убихинол) и другие. Кофакторами являются ионы металлов, прочно связанные с активным центром энзима или с другими частями молекулы, и обеспечивающие его правильную трѐхмерную структуру для проявления биологических свойств. К кофакторам принадлежат «металлы жизни» – Fe, Cu, Mo, Cr, Zn, Mn, Ca, Mg, V, Co (например, Fe 2+ в цитохромоксидазе и каталазе, Mn 2+ или Mg 2+ в алкогольдегидрогеназе, Zn 2+ в карбоксипептидазе А и ДНК-полимеразе). Иногда кофакторами могут выступать Na + и К + , а в состав органических коферментов могут входить B, Se, Br, I. Ферменты могут содержать как кофермент (простетическую группу), так и ионы металлов. Для проявления активности ряда ферментов (например, алкогольдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы) требуются как кофермент, так и один или несколько кофакторов-ионов металлов. Ионы металлов могут либо непосредственно участвовать в катализе, либо играть роль своеобразных мостиков, связывающих кофермент с апоферментом. В отсутствие металла эти ферменты активностью не обладают. Такие ферменты получили название «металлоэнзимы». Схематично данный процесс взаимодействия фермента, субстрата и металла можно представить следующим образом: E–Me–S (S – субстрат). Кроме активного центра у ряда ферментов имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента, как правило, пространственно отделен от активного центра. К аллостерическому центру присоединяются вещества эффекторы, которые изменяют пространственную структуру энзима, за счѐт чего меняется сродство активного центра к субстрату и скорость ферментативной реакции. Ферменты, имеющие аллостерический центр, называются аллостерическими. |