методическая разработка по биологии 4 занятие самгму. МР 4. Д. С. Громова старший преподаватель Самара, 2022 Методические разработки предназначены для самостоятельной работы обучающихся на практических занятиях, а также для внеаудиторной работы для подготовки к занятиями э
 Скачать 1.09 Mb.
|
Д.С. Громова – старший преподаватель Самара, 2022 Методические разработки составлены в соответствие с рабочей программой дисциплины, а также согласно требованиям, Федерального государственного образовательного стандарта. Цель занятия изучить особенности строения нуклеиновых кислот, их свойства и функции познакомиться с основными современными методами и перспективами развития молекулярной генетики. Формируемые компетенции. В процессе изучения темы у обучающихся формируются следующие универсальные и общепрофессиональные компетенции - УК-1: способность осуществлять критический анализ проблемных ситуаций на основе системного подхода, вырабатывать стратегию действий - ОПК-2: способность проводить и осуществлять контроль эффективности мероприятий по профилактике, формированию здорового образа жизни и санитарно-гигиеническому просвещению населения. Студент должен знать - исторические этапы формирования представлений об организации генетического материала - современные методы исследования молекулярной генетики - строение и химический состав нуклеиновых кислот - виды и функции РНК - принцип и этапы редупликации ДНК - виды и механизмы репарации ДНК - механизмы сохранения нуклеотидной последовательности ДНК Студент должен уметь - работать со специальной литературой по биологии - решать задачи по молекулярной генетике Студент должен владеть - навыками научно-исследовательской работы - владеть техникой изготовления слайдов по концептуальным вопросам Молекулярная генетика, раздел генетики и молекулярной биологии, ставящий целью познание материальных основ наследственности и изменчивости живых существ путём исследования протекающих на субклеточном, молекулярном уровне процессов передачи, реализации и изменения генетической информации, а также способа её хранения. Молекулярная генетика выделилась в самостоятельное направление в х гг. 20 в. в связи с внедрением в биологию новых физических и химических методов (рентгеноструктурный анализ, хроматография, электрофорез, высокоскоростное центрифугирование, электронная микроскопия, использование радиоактивных изотопов и т. д, что позволило гораздо глубже и точнее, чем раньше, изучать строение и функции отдельных компонентов клетки и всю клетку как единую систему. Одно из главных достижений молекулярной генетики – выяснение химической природы гена. Классическая генетика установила, что все наследственные потенции организмов их генетическая информация) определяются дискретными единицами наследственности - генами, локализованными главным образом в хромосомах клеточного ядра, а также в некоторых органеллах цитоплазмы (пластидах, митохондриях и др. Однако методы классической генетики не позволяли вскрыть химическую природу генов, что было отмечено ещё в 1928 выдающимся советским биологом Н. К. Кольцовым, обосновавшим необходимость изучения механизма наследственности на молекулярном уровне. Первый успех в этом направлении был достигнут при изучении генетической трансформации у бактерий. В 1944 американский учёный ОТ. Эйвери с сотрудниками обнаружил, что наследственные признаки одного штамма пневмококков могут быть переданы другому, генетически отличному штамму путём введения в его клетки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК, выделенной из первого штамма. Впоследствии подобная генетическая трансформация с помощью ДНК была осуществлена у других бактерий, а в последнее время - и у некоторых многоклеточных организмов (цветковые растения, насекомые. То, было показано, что гены состоят из ДНК. Этот вывод был подтвержден опытами с ДНК-содержащими вирусами для размножения вируса достаточно введения молекул вирусной ДНК в клетку восприимчивого хозяина все др. компоненты вируса (белки, липиды) лишены инфекционных свойств и генетически инертны. Выяснение генетической роли ДНК и РНК послужило мощным стимулом для изучения нуклеиновых кислот биохимическими, физико-химическими и рентгеноструктурными методами. В 1953 американский учёный Дж. Уотсон и английский учёный Ф. Крик предложили модель структуры ДНК, предположив, что её гигантские молекулы представляют собой двойную спираль, состоящую из пары нитей, образованных нуклеотидами, расположенными апериодически, нов определённой последовательности. Также используются различные варианты блоттинга (Саузерн-блоттинг, назерн-блоттинг и др. Метод блоттинга был разработан британским молекулярным биологом Эдвином Саузерном и позволяет разделить, перенести и определить нужные нуклеиновые кислоты в образцах. Метод показал себя как высокоэффективный и точный во многих медицинских областях, это диагностика инфекций, аутоиммунных, аллергических заболеваний и многое другое. (стекинг-взаимодействиями). Стэкинг-взаимодействия - особого рода (Ван-дер-Ваальсовы) взаимодействия между выложенными в стопку (как монеты) друг над другом азотистых оснований. Комплементарное спаривание нуклеотидов возможно, только если взаимодействующие цепи располагаются антипараллельно (конец первой цепи нуклеотидов напротив конца второй цепи. Из принципа комплементарности следует, что последовательность нуклеотидов одной цепи определяет последовательность нуклеотидов другой. Этого можно добиться двумя способами. Могут взаимодействовать две комплементарные цепи нуклеиновых кислот или же одна цепь нуклеиновых кислот может содержать комплементарные участки внутри себя самой. Первый вариант использует ДНК, второй - РНК. Третичная структура ДНК образуется в результате дополнительного скручивания в пространстве двуспиральной молекулы - ее суперспирализации. Виды РНК. Роль различных структур РНК в синтезе белка. Пространственные структуры молекул РНК это трехмерные конструкции, в состав которых входят спиральные и не спиральные элементы. Комплементарные участки в РНК перемежаются с некоплементарными. Проект Геном человека позволил установить достаточно точную классификацию всех РНК (рис. 1). РНК подразделяются на некодирующие РНК (нкРНК), которые не транслируются в белки, и кодирующие, или матричные РНК (мРНК), служащие матрицей для синтеза белков. У некодирующих РНК более сложная классификация. Они бывают инфраструктурными и регуляторными. Инфраструктурные РНК известны нам из школьных учебников — это рибосомные РНК (рРНК) и транспортные РНК (тРНК). Молекулы рРНК составляют основу рибосомы — молекулярной машины, которая и строит белок на матричной РНК (проводит трансляцию. Последовательность из трех нуклеотидов в мРНК указывает, какую аминокислоту следуют включить в белок. Молекулы тРНК приносят указанные аминокислоты на рибосомы входе трансляции. Регуляторные нкРНК очень широко представлены в организме, классифицируются в зависимости от размера и выполняют важные функции рис. 2) - проматричная РНК. Образуется в результате транскрипции, имеет кодирующие (экзоны) и некодирующие (интроны) участки - информационная (матричная) РНК - иРНК (мРНК) – образуется в результате сплайсинга (процесс вырезания интронов и сшивания экзонов) проматричной РНК. Функции иРНК: перенос генетической информации от ДНК к рибосомам, матрица для синтеза молекулы белка, определение аминокислотной последовательности первичной структуры белковой молекулы - транспортная РНК – тРНК. Функции тРНК: транспорт аминокислот к месту синтеза белка, к рибосомам трансляционный посредник. Имеет акцептирующий Антикодоновая петля - содержит 3 нуклеотида, комплементарных кодону данной аминокислоты в мРНК, например, кодону 5'-ГЦЦ-3' в мРНК соответствует антикодон 3'- ЦГГ-5' в тРНК, чем обеспечивается специфичность взаимодействия с матричной РНК. - рибосомная РНК - рРНК. Функции рРНК: необходимый структурный компонент рибосом и, таким образом, обеспечение функционирования рибосом обеспечение взаимодействия рибосомы и тРНК; первоначальное связывание рибосомы и кодона-инициатора иРНК и определение рамки считывания, формирование активного центра рибосомы. - микроРНК – малые некодирующие молекулы РНК, они участвуют в подавлении активности генов, ингибируя трансляцию мРНК. Мишенями микроРНК являются от 30 до 60 % генов человека. Информация о строении всех видов РНК хранится в ДНК. Процесс синтеза РНК на матрице ДНК называется транскрипцией. Репликация ДНК. Входе репликации ДНК в клетке каждая из двух исходных цепей ДНК служит матрицей для формирования полноразмерной новой цепи. Поскольку каждая из двух дочерей делящейся клетки наследует новую двойную спираль ДНК, содержащую одну исходную и одну новую цепи, говорят, что двойная спираль ДНК реплицируется ДНК-полимеразой «полуконсервативно». В процессе репликации ДНК выделяют фазы инициации (начало, старт, элонгации удлинение, приращение) и терминации (завершение, окончание. Точками инициации (начала) репликации являются участки, богатые парами АТ, т.к. в них две, а не три водородных связи, где начинается денатурация ДНК с расхождением молекул двойной спирали. Образующиеся при этом одноцепочечные участки ДНК связываются дестабилизирующими белками. В точках начала репликации образуются репликативные вилки. Разделение закрученных в биспираль полинуклеотидных цепей ДНК осуществляется ферментов геликазой. Ферментом, катализирующим образование дочерних полинуклеотидных цепей, является ДНК-полимераза. Построение одной из дочерних полипептидных цепей (лидирующая) на материнской матрице опережает построение второй (запаздывающая. Элонгацию обеих полинуклеотидных цепей ДНК катализирует ДНК- полимераза, однако существуют также белки, которые блокируют наращивание РНК-праймера на конце сверх требуемой длины. Участки лидирующей цепи синтезируются как непрерывные достаточно длинные фрагменты, тогда как ДНК запаздывающей цепи образуется короткими участками – фрагменты Оказаки. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки, необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой (праймаза), ДНК-полимераза достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. - Дорепликативную (тип репарации ДНК, несвязанный с процессом репликации и происходящий согласно механизмам разъединения пиримидиновых димеров (фотореактивация) или вырезания повреждённых участков ДНК (эксцизионная репарация) - Пострепликативную (тип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения после репликации с образованием ДНК, содержащей повреждённые участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе рекомбинационной или репарационной репликации. С позиций молекулярного механизма первичные повреждения в молекулах ДНК могут быть устранены тремя путями 1. Прямым возвращением к исходному состоянию 2. Вырезанием поврежденного участка и заменой его нормальным 3. Рекомбинационным восстановлением в обход поврежденного участка. Каждая из систем репарации включает следующие компоненты - ДНК-геликаза — фермент, узнающий химически изменённые участки вцепи и осуществляющий разрыв Н-связей вблизи от повреждения фермент, удаляющий повреждённый участок - ДНК-полимераза — фермент, синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого; - ДНК-лигаза — фермент, замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность. Наиболее распространёнными способами репарации является вырезание повреждённых участков ДНК, первоначальная последовательность ДНК восстанавливается ДНК-полимеразой, которая использует неповрежденную нить в качестве матрицы, и остающийся разрыв в двойной спирали заделывается ДНК-лигазой. Репарация вырезанием оснований, вовлекает батарею ферментов, называемых ДНКгликозилазами, каждый из которых может распознавать в ДНК определенный тип видоизмененного основания и катализировать его гидролитическое удаление. У бактерий имеются по крайней мере 3 ферментные системы, ведущие репарацию прямая (наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов, эксцизионная (включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы, пострепликативная (осуществляется в тех случаях, когда повреждение доживает до фазы репликации или имеет такую природу, которая делает невозможным его исправление с помощью эксцизионной репарации. Эта система играет особенно важную роль у эукариот, обеспечивая некомплементарные пары. Неправильное спаривание затрагивает только дочернюю цепь. Система репарации мисмэтч должна найти дочернюю цепь и произвести замену некомплементарных нуклеотидов) и репарация включается тогда, когда повреждений в ДНК настолько много, что они угрожают жизни клетки. Индуцируется синтез белков, которые присоединяются к ДНК-П комплексу и строят дочернюю цепь ДНК напротив дефектной матричной. В результате ДНК удваивается с ошибкой и может произойти клеточное деление. Но если были задеты жизненно важные функции клетка погибнет. Рис. 4. Некоторые наследственные заболевания, связанные с дефектами в системе репарации ДНК. Митохондриальная ДНК. Согласно эндосимбиотической теории, митохондриальная ДНК произошла от кольцевых молекул ДНК бактерий и поэтому имеет иное происхождение, чем ядерный геном. Сейчас преобладает точка зрения, согласно которой митохондрии имеют монофилетическое происхождение, то есть были приобретены предками эукариот лишь однажды. МтДНК млекопитающих – кольцевая двуцепочечная молекула, которая всегда находится в митохондриях в форме комплексов с белками, эти комплексы ,2 для рРНК (для большой субъединицы рибосом 16S рРНК и для малой 12S рРНК). Геномы митохондрий разных видов отличаются не только по набору генов, порядку их расположения и экспрессии, но по размеру и форме ДНК. Подавляющее большинство описанных сегодня митохондриальных геномов представляет собой кольцевые суперспирализованные двуцепочечные молекулы ДНК. Как правило, в каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома. Так, в клетках печени человека около 2 тыс. митохондрий, ив каждой из них по 10 одинаковых геномов. Две нуклеотидные цепи молекулы мтДНК имеют различный суммарный нуклеотидный состав и обозначаются как цепь (light, легкая) и Н-цепь (heavy, тяжелая. Различия обусловлены неодинаковым содержанием "тяжелых" пуриновых и "легких" пиримидиновых нуклеотидов. Большая часть генов расположена на Н-нити мтДНК: это 14 генов тРНК, оба гена рРНК и 11 генов, кодирующих белки. 8 РНК генов и 2 белковых гена (ND3 и АТ) на L нити. Большая часть молекулы мтДНК содержит консервативные кодирующие последовательности. У человека и других млекопитающих в митогеноме отсутствуют интроны и совсем мало некодирующих участков. Наиболее протяженный некодирующий фрагмент (NCR, non-coding region) имеет длину 700 п.н. Нужно отметить, что генетический код в митохондриях имеет некоторые отличия от универсального триплеты AGA и AGG служат стоп-кодонами (в универсальном коде они кодируют Arg); AUA кодирует Met (Ile в универсальном коде UGA кодирует Trp (стоп-кодон в универальном коде. У большинства многоклеточных организмов митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. Яйцеклетка содержит на несколько порядков больше копий митохондриальной ДНК, чем сперматозоид. В сперматозоиде обычно не больше десятка митохондрий (у человека — одна спирально закрученная митохондрия, в небольших яйцеклетках морского ежа — несколько сотен тысяча в крупных ооцитах лягушки — десятки миллионов. Кроме того, обычно происходит деградация митохондрий сперматозоида после оплодотворения. Мутации в мтДНК происходят, по разным причинам, намного чаще, чем в ядерной ДНК. Клетки и ткани могут содержать как мтДНК одного вида (гомоплазмия), таки комбинацию нормальной и мутантной мтДНК в различных соотношениях (гетероплазмия). В мтДНК обнаружены точечные мутации, делеции или дупликации молекулы мтДНК. МтДНК мутации могут вызывать передаваемые по материнской линии наследственные заболевания. Исследования показали, что мутации мтДНК также ускоряют процесс старения и развитие возрастных патологий, например, нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, они могут вызывать снижение мужской фертильности, повышать риск невынашивания беременности и эмбриональных нарушений. Снижение числа копий молекул мтДНК также приводит к развитию заболеваний, таких как миопатии, нефропатии, печеночная недостаточность и др. Одним из важных мутационных событий, возникающих в митохондриальном геноме, является Кирнса-Сейра, офтальмоплегическая миопатия, синдром Пирсона, митохондриальная нейрогастроинтестинальная энцефаломиопатия, Синдром Лея, кардиомиопатии, панцитопении, нейросенсорная тугоухость. Изучение мтДНК делеций в генетических лабораториях проводится методом ПЦР анализа и ПЦР в реальном времени. ЗАДАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕРКИ 1. Укажите правильные варианты ответа. 1.1. Молекула ДНК ядер эукариот А) линейная двухцепочечная Б) линейная одноцепочечная В) кольцевидная двухцепочечная Г) кольцевидная одноцепочечная Д) только кольцевидная 1.2. ДНК у эукариот находится А) только в ядре Б) в ядре, лизосоме, митохондриях В) в ядре, хлоропластах, митохондриях Г) в ядре и ЭПС Д) в ядре, рибосомах, хлоропластах 1.3. Избирательное соединение нуклеотидов двух цепей ДНК через азотистые основания А) антипаралельность Б) колинеарность В) комплементарность Г) непрерывность Д) избыточность 1.4. При репликации дочерние цепи ДНК синтезирует фермент А) геликаза Б) праймаза В) ДНК-полимераза Г) лигаза Д) топоизомераза 1.5. При репликации ДНК сшивает фрагменты Оказаки фермент А) геликаза 1.6. Репликация ДНК на лидирующей цепи происходит А) непрерывно Б) в направлении 3` 5` (новой цепи) В) фрагментами Оказаки Г) консервативным способом Д) в период дифференцировки 1.7. При репликации разрывает водородные связи между цепями ДНК фермент А) геликаза Б) праймаза В) ДНК-полимераза Г) лигаза Д) топоизомераза 1.8. Если одна из цепей ДНК имеет нуклеотидную последовательность 3'ААГТТЦЦТТА5', вторая цепь будет иметь строение А) 5'УУЦААГГААУЗ' Б) 5'ТТГТТЦЦААТЗ' В) 5'ТТЦААГГААТЗ' Г) 5'ААГТТЦЦТТАЗ' Д) 5'УУГТТЦЦТТУЗ' 1.9. Основной способ репликации ДНК А) консервативный Б) неконсервативный В) фрагментарный Г) полуконсервативный 1.10. Основной носитель генетической информации бактерий А) плазмида Б) нуклеоид В) нуклеокапсид Г) ядро 2. Решите ситуационные задачи. 2.1. Исследования показали, что 34% общего числа нуклеотидов изучаемой иРНК приходится на гуанин, 18% на аденин. Какой процентный состав приходится на другие азотистые основания ив каком соотношении 2.2. Под действием УФ-облучения в молекуле ДНК образовались пиримидиновые димеры (димеры тимина. Какие свойства и особенности ДНК лежат в основе репарации Какие существуют виды репарации ДНК ив чем их различие В чем сущность пострепликативной репарации Укажите ее связь с эксцизионной репарацией 2.3. Выберите варианты ответа, максимально соответствующие по смыслу. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) необходимо, в первую очередь, выбрать участок (антигена / гена / генетического кода / молекулы / рибосомы) и Праймеры обычно выбирают длиной около (2 / 12 / 20 / 200 / 2000) (азотистых оснований / нуклеотидов / олигонуклеотидов / пар нуклеотидов / пар олигонуклеотидов). Положение праймеров задаёт (длину / массу / пространство / температуру плавления / ширину) конечного продукта. Затем нужно подготовить матрицу ДНК. Далее в пробирке смешивают все необходимые компоненты ДНК-матрицу, праймеры, реакционный буфер, содержащий (ионы калия / ионы кальция / ионы магния / ионы натрия, (дезоксинуклеозидтрифосфаты / дезокситрифосфаты / нуклеозидтрифосфаты / трифосфаты), фермент ДНК-зависимую ДНК-полимеразу. На приборе, который называется (амплификатор / термостат / хроматограф / центрифуга) задают протокол ПЦР, который обычно состоит из (10-15 / 15-25 / 30-40 / 40-60 / 60-80) циклов, каждый из которых содержит последовательно стадии (денатурации / отжига 135 праймеров / плавления / поглощения / ренатурации / репликации / терминации / элонгации, (денатурации / достройки / плавления / отжига праймеров / удлинения / элонгации) и (денатурации / комплементации / поглощения / ориентации / отжига праймеров / элонгации. Дополнительная задача повышенной сложности Полимеразная цепная реакция является исключительно важным современным методом молекулярной биологии. В честь дня рождения Томаса Ханта Моргана лаборант решил получить ПЦР-продукт гена white длиной 152 пары нуклеотидов. Ген white кодирует транспортер прекурсоров пигментов глаза дрозофилы, мутация в нем приводит к формирования белых глаз. Последовательность данного гена в базе данных Gene Bank имеет идентификатор X02974.2. Для амплификации участка ДНК методом ПЦР требуется заказать прямой и обратный праймер. Последовательность праймеров принято записывать от 5’- конца к концу. Определите последовательность обратного праймера длиной 16 нуклеотидов, если в качестве прямого праймера был использован следующий олигонуклеотид 5’- CTCGCAACGGAAAACC-3’. Введите последовательность обратного праймера латинскими буквами, без знаков 5’-, 3’-, и пробелов. ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ 1. Биология учебник в 2 т. Т. под ред. В. Н. Ярыгина. - Москва ГЭОТАР- Медиа, 2018. – 725 сил. 2. Биология учебник для студентов вузов / МЗ РФ, ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. ИМ. Сеченова; под ред. Н. В. Чебышева. - Москва МИА, 2016. - 635 сил. 3. Biology: Coursebook/ M. Jones, R. Fosbery, J. Gregory и др. - 4-th edition. - Cambridge: University Press, 2019. - 536 p. с il. 4. Биология учеб. пособие для студентов фак. высш. сестрин. образования и фарм. фак. / Н. В. Чебышев, Г. Г. Гринева, МВ. Козарь и др под ред. Н. В. Чебышева. - е изд, испр. и доп. - Москва ГОУ ВУНМЦ, 2005. - 592 с. |