Диссертация-Козырев-И.А.. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители доктор медицинских наук профессор Гордеев М. Л., кандидат биологических наук
 Скачать 3.84 Mb.
|
|
Федеральное государственное бюджетное учреждение « Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Козырев Иван Александрович РЕЗУЛЬТАТЫ РАННЕЙ РАДИКАЛЬНОЙ КОРРЕКЦИИ ТЕТРАДЫ ФАЛЛО 14.01.26 - Сердечно-сосудистая хирургия 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук профессор Гордеев М.Л., кандидат биологических наук Малашичева А.Б. Санкт-Петербург – 2019 2 СОДЕРЖАНИЕ Введение ............................................................................................................. 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................ 12 1.1 Тетрада Фалло (общие сведения).................................................... 12 1.2 Клиническая картина, особенности гемодинамики, диагностика ...................................................................................................... 14 1.3 Хирургическая коррекция тетрады Фалло ..................................... 17 1.3.1 Ранняя радикальная коррекция тетрады Фалло ............................. 19 1.3.2 Предотвращение вентрикулотомии ................................................ 22 1.3.3 Клапан-сохраняющие процедуры ................................................... 24 1.4 Тактика лечения симптоматических пациентов ............................ 26 1.5 Расширение показаний для ранней радикальной коррекции ....... 29 1.6 Этиологические факторы развития тетрады Фалло и роль Notch сигнального пути ............................................................................................. 31 1.7 Мезенхимные клетки сердца и клеточная терапия ВПС .............. 35 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ...................... 42 2.1 Методы исследования ...................................................................... 42 2.1.1 Клинические методы исследования ................................................ 42 2.1.2 Клиническая характеристика пациентов ........................................ 44 2.2 Экспериментальные методы исследования ................................... 49 2.2.1 Клеточные культуры ........................................................................ 49 2.2.2 Выделение РНК из клеточных культур .......................................... 52 2.2.3 Обратная транскрипция .................................................................... 53 2.2.4 ПЦР в реальном времени ................................................................. 53 3 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................ 55 3.1 РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ЧАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ...... 55 3.1.1 Интраоперационные данные ........................................................... 55 3.1.2 Послеоперационный период............................................................ 60 3.1.3 Отдаленный период .......................................................................... 67 3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................................................................................... 78 3.2.1 Сравнение экспрессии рецепторов и лигандов Notch-сигнального пути в мезенхимных клетках сердца от пациентов с ТФ и ДМЖП ........... 78 3.2.2 Пролиферативная активность мезенхимных клеток сердца ........ 80 3.2.2.1 Связь уровня пролиферативной активности мезенхимных клеток сердца с возрастом .......................................................................................... 80 3.2.2.2 Связь уровня пролиферативной активности мезенхимных клеток сердца с уровнем активности NOTCH сигнального пути ........................... 82 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ............. 87 ВЫВОДЫ ......................................................................................................... 97 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ......................................................... 98 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................. 99 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ..................................... 100 4 Введение Актуальность и степень разработанности темы исследования Тетрада Фалло является одним из самых часто встречаемых цианотических врожденных пороков сердца. Несмотря на имеющийся обширный опыт лечения данной патологии, на сегодняшний день отсутствует общепринятая тактика введения пациентов с выраженным цианозом, не определен оптимальный возраст проведения радикальной хирургической коррекции тетрады Фалло (ТФ) у бессимптомных пациентов [1, 2]. В последних российских рекомендациях не указан возраст, в котором нужно проводить радикальную коррекцию [3]. В настоящий момент в детской кардиохирургии прослеживается общемировая тенденция более раннего выполнения хирургической коррекции врожденных пороков сердца (ВПС) [4]. Это обусловлено развитием анестезиологического пособия, методов проведения заместительного кровообращения, усовершенствованием кардиоплегических и кардиопротекторных методик. Восстановление нормальной физиологии внутрисердечного, легочного и системного кровообращения, устранение гипоксического влияния на организм в целом в раннем возрасте приводит к адекватному созреванию и развитию всех тканей в организме ребенка. Наличие системного давления на протяжении времени в полости правого желудочка (ПЖ) при тетраде Фалло приводит к формированию патологической гипертрофии правого желудочка, в том числе к развитию фиброзных изменений в стенке желудочка [5]. Это снижает комплайнс правого желудочка, что крайне важно для пациентов с коррегированной тетрадой Фалло в долгосрочном периоде. В течение первых недель жизни степень цианоза у пациентов с тетрадой Фалло может нарастать. Это обусловлено увеличением степени обструкции в выносящем отделе правого желудочка (ВОПЖ) за счет мышечной гипертрофии правого желудочка. У большинства пациентов с тетрадой Фалло отмечается умеренная 5 гипоплазия фиброзного кольца (ФК) клапана легочной артерии [5]. Именно на этом уровне формируется основной градиент в ВОПЖ. Спустя несколько недель или месяцев, вследствие развития компенсаторной гипертрофии нарастает стеноз в ВОПЖ ниже клапана легочной артерии. Тем самым, устранение обструкции в раннем периоде жизни предотвращает ремоделирование правого желудочка [6]. Для пациентов с тетрадой Фалло одним из главных факторов, влияющем на общее состояние и функцию сердца в долгосрочном периоде является сохранение клапана легочной артерии во время выполнения радикальной коррекции. Выявление условий и хирургических методов для увеличения доли клапан-сохраняющей коррекции тетрады Фалло является важной и не решенной задачей в кардиохирургии. Одним из таких условий может стать выполнение радикальной коррекции в раннем возрасте с использованием специальных клапан-сохраняющих методов. Однако на данный момент не доказано, что радикальная коррекция в раннем возрасте не будет приводить к более длительному и тяжелому послеоперационному периоду. Количество кардиомиоцитов удваивается к 21-му дню жизни, в дальнейшем их численность значительно не изменяется [7]. Известно, что в организме существует различные виды стволовых клеток. Одними из них являются локальные стволовые клетки сердца или, так называемые, клетки- предшественники кардиомиоцитов (КПК). Одним из подвидов этих клеток являются мезенхимные клетки сердца (МКС). У популяции КПК имеются признаки кардиомиоцитарной дифференцировки, однако, в них не эксперссируются саркомерные белки, характерные для кардиомиоцитов. В настоящее время идет активное изучение этого вида клеток [8, 9]. Исследуются механизмы, приводящие к врожденным порокам сердца на моделях этих клеток, изучается способность таких клеток участвовать в регенерации и репарации сердца, особенно у пациентов с врожденными пороками сердца. Было установлено, что клетки от новорожденных 6 пациентов с различными врожденными формами пороков сердца имеют более выраженный регенеративный и пролиферативный потенциалы по сравнению с аналогичными клетками от взрослых пациентов [10]. В другой работе демонстрировалось, что клетки от пациентов раннего возраста имеют более высокий регенеративный потенциал по сравнению с клетками пациентов более старших возрастных групп, в связи, с чем лечение пациентов с врожденными пороками сердца в более раннем возрасте, с точки зрения тканевой регенерации, представляется предпочтительным [11]. Таким образом, данный вид клеток является с одной стороны перспективным новым методом для клеточной терапии различных состояний при врожденных пороках сердца, с другой стороны объектом для активных исследований гомеостаза в миокарде при наличии различных патологий сердца. Notch- сигнальный путь является высококонсервативной сигнальной системой, которая контролирует спецификацию клеток и тканевую организацию, как у эмбриона, так и у взрослого. Многочисленные исследования выявили участие Notch-сигнального пути в развитии сердца [12], формировании различных врожденных пороков [13] и регенерации сердца [14]. Однако следует отметить, что Notch-сигнальный путь принимает участие не только в кардиогенезе. Он также может быть вовлечен в пролиферативную активность клеток различных тканей и может участвовать в процессах дифференцировки [15, 16]. Активация Notch необходима для поддержания пролиферации кардиомиоцитов при рождении [17]. Таким образом, Notch-сигнальный путь является медиатором покоя, пролиферации и дифференцировки различных типов стволовых клеток, включая кардиогенные. В настоящее время существует довольно ограниченное количество работ, посвященных исследованию сигнального пути Notch в клеточных культурах из ткани миокарда пациентов с врожденными пороками сердца, и полностью отсутствуют работы, исследующие вовлеченность этого сигнального пути в уровень 7 пролиферации мезенхимных клеток сердца. Поэтому актуальность проведения данного исследования с применением клинических и молекулярно-генетических методов представляется несомненной. Все вышесказанное и предопределило постановку следующей цели исследования. Цель исследования Оценить результаты радикальной коррекции тетрады Фалло, выполненной в различном возрасте, и охарактеризовать функциональное состояние мезенхимных клеток сердца в данной группе пациентов. Задачи исследования 1. Провести сравнительную оценку различных хирургических методик и их применение в различных возрастных группах при коррекции тетрады Фалло для выявления оптимальных условий для клапанно- сохраняющих операций. 2. Провести сравнительный анализ различных методов оценки состояния легочных артерий у пациентов с тетрадой Фалло раннего возраста по данным дооперационных методов обследования и операционным показателям. 3. Проанализировать особенности интраоперационного и раннего послеоперационного периодов при коррекции тетрады Фалло у пациентов раннего возраста в зависимости от сроков проведения операции. 4. Охарактеризовать пролиферативную активность мезенхимных клеток сердца в зависимости от возраста пациентов с тетрадой Фалло. 5. Охарактеризовать уровень экспрессии генов сигнального каскада Notch в мезенхимных клетках сердца у пациентов с различными септальными пороками. 8 Научная новизна исследования Получены новые данные, подтверждающие необходимость радикальной коррекции тетрады Фалло у пациентов младше 6 месяцев. Показана эффективность методов дилатации фиброзного кольца клапана легочной артерии при ранней радикальной коррекции тетрады Фалло для увеличения доли клапан-сохраняющих операций. Продемонстрировано различие в размерах центрального легочного русла по данным методам неинвазинвой диагностики и измерений в операционной. Показана важность интраоперационной оценки истинных размеров ветвей легочной артерии, способствующая расширению показаний для выполнения первичной радикальной коррекции. Теоретическая и практическая значимость Получены новые данные, подтверждающие необходимость радикальной коррекции тетрады Фалло у пациентов младше 6 месяцев. Показана эффективность методов дилатации фиброзного кольца клапана легочной артерии при ранней радикальной коррекции тетрады Фалло для увеличения доли клапан-сохраняющих операций. Продемонстрировано различие в размерах центрального легочного русла по данным методам неинвазинвой диагностики и измерений в операционной. Показана важность интраоперационной оценки истинных размеров ветвей легочной артерии, способствующая расширению показаний для выполнения первичной радикальной коррекции. Показана взаимосвязь активности Notch сигнального пути с пролиферативной активностью мезенхимных клеток сердца у пациентов с тетрадой Фалло. Методология и методы исследования Набор использованных методов исследования соответствует современному методическому уровню обследования кардиохирургических 9 больных. Примененные методы статистической обработки данных отвечают поставленной цели и задачам исследования. Положения, выносимые на защиту 1. Радикальная коррекция тетрады Фалло в возрасте до 6 месяцев ассоциирована с низким риском осложнений и летальности. 2. Ранняя радикальная коррекция тетрады Фалло с применением современных клапан-сохраняющих методик позволяет в большинстве случаев сохранить собственный клапан легочной артерии. 3. Показана зависимость функциональных свойств мезенхимных клеток сердца от уровня активации в них Notch-сигнального пути. Степень достоверности и апробация работы Основные материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены: на Всероссийской молодежной медицинской конференции с международным участием «Алмазовские чтения – 2018», Санкт-Петербург; на научной конференции «Границы клеточных технологий: исследования и практика», Москва; на X Всероссийском Конгрессе «Детская кардиология 2018», Москва; на 51-м ежегодном съезде Европейского общества детских кардиологов (51 st Annual Meeting of the Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC)), г. Лион, Франция; на 52-м ежегодном съезде Европейского общества детских кардиологов (52 nd Annual Meeting of the Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC)) , г. Афины, Греция; на 26-м ежегодном азиатском съезде кардиоваскулярной и торакальной хирургии (26th Annual Meeting of the Asian Society for Cardiovascular and Thoracic Surgery (ASCVTS )), Москва; на Всероссийской конференции с международным участием «Каспийские Встречи: диалоги специалистов о наджелудочковых нарушениях ритма сердца», Форум молодых кардиологов РКО, Астрахань; на международной конференции на 10 53- м ежегодном съезде Европейского общества детских кардиологов (53 d Annual Meeting of the Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC)) , г. Севилья, Испания. По теме исследования опубликовано 5 печатных работ в том числе 5 работ в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных Высшей Аттестационной Комиссией Минобразования России. Работа «Notch signaling is abnormally activated in cardiac progenitor cells of tetralogy of Fallot patients» на английском языке является победителем международного конкурса молодых ученых на 51-м ежегодном съезде Европейского общества детских кардиологов (г. Лион, Франция). Личный вклад Автором лично определены цели, задачи исследования, положения, выносимые на защиту. Проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Автором лично были проведены эксперименты по культивированию клеточных линий, проведению ПЦР в реальном времени. Проведен анализ и оформление результатов исследования. Лично осуществлены все этапы клинического исследования. Получение данных исследований, их статистическая обработка, апробация результатов исследований, подготовка публикаций и докладов по проделанной работе выполнены автором лично. Анализ, изложение полученных данных, формулировка выводов и практических рекомендаций выполнены автором лично. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами, 33 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических 11 рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 180 источников, из которых 25 отечественных и 155 иностранных. Реализация работы Результаты исследования внедрены в клиническую работу отделения сердечно-сосудистой хирургии для детей ФГБУ «НИМЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России и могут быть рекомендованы к широкому применению в клинической деятельности кардиохирургических отделений. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Тетрада Фалло (общие сведения) Врожденные пороки сердца (ВПС) представляют собой группу патологий, которая включает в себя широкий спектр аномалий, от простых септальных дефектов, до сложных комбинированных пороков. Традиционно, все ВПС делятся на цианотические (синие) и не цианотические (белые). Самым распространённым цианотическим пороком сердца является тетрада Фалло (ТФ) [18, 19]. ТФ составляет примерно одну десятую от всех ВПС и встречается в среднем у 3-6 детей на 10000 рождений [20]. Впервые данная врожденная аномалия сердца была описана в 1673 году N. Steno, при этом привычное название пороку было дано лишь в 1888 году [21]. ТФ является многокомпонентным пороком сердца, включающим дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП), стеноз выносящего отдела правого желудочка (ВОПЖ), декстрапозицию аорты и гипертрофию правого желудочка (ПЖ). Стеноз ВОПЖ чаще всего является сочетанным, представляет собой клапанный стеноз легочной артерии и мышечный инфундибулярный стеноз ПЖ. Декстрапозиция аорты при ТФ составляет 50%, таким образом, аорта расположена между правым и левым желудочками. Тем самым корень аорты находится в проекции межжелудочковой перегородки или непосредственно над дефектом межжелудочковой перегородки. При большем смещении аорты в сторону ПЖ, говорят уже о пороке, который принято называть двойное отхождение магистральных сосудов (ДОС) от ПЖ. К терминологическим аспектам относятся такие понятия как триада и пентада Фалло. В триаду Фалло входят компоненты классической ТФ, за исключением декстрапозиции аорты, а к термину пентада Фалло, кроме 13 компонентов «классической» тетрады относится еще и дефект межпредсердной перегородки (ДМПП). В современной литературе данные термины являются историческими и не используются. В настоящее время может быть использована следующая классификация ТФ (Рис.1). Рисунок 1 – Классификация тетрады Фалло Ранее в понятие ТФ включалась и атрезия клапана легочной артерии с наличием ДМЖП. В связи с тем, что этот порок включает в себя чрезвычайно широкий спектр патологии, начиная от простой клапанной атрезии и заканчивая отсутствием истинного легочного русла, с одной стороны, и что лечение и результаты лечения этой когорты пациентов значительно различаются, в настоящее время во многих центрах эту патологию рассматривают отдельно от ТФ [22]. ТФ в сочетании с синдромом агенезии клапана ЛА является симптомокомплексом, при котором полностью отсутствует клапан ЛА. В результате тяжелой недостаточности в проекции фиброзного кольца (ФК) клапана ЛА, происходит выраженная дилатация центрального легочного русла, что приводит к сдавлению легочными сосудами рядом Тетрада Фалло ТФ со стенозом выносящего отдела ПЖ Симптоматическая ТФ у новорожденных ТФ у детей старше 1 месяца Безсимптомная или бледная ТФ ТФ с атрезией клапана легочной артерии (исключена с 1999г [6]) ТФ с агенезией клапана легочной артерии ТФ с полной формой АВК 14 расположенных структур, таких как трахея, главный и долевые бронхи [23]. Для данной патологии характерно, что легочные синдромы преобладают над кардиальными. Для синдрома отсутствия клапана ЛА характерно тяжелое клиническое течение. В настоящее время существуют несколько хирургических подходов для коррекции этого порока. Главной целью этих методик является коррекция внутрисердечных изменений и устранение компрессии со стороны легочных артерий на органы средостения. Одним из наиболее перспективных методов является классическая внутрисердечная коррекция с пластической редукцией размеров ЛА в сочетании с маневром Leсompte [24]. Сочетание ТФ с полной формой атривентрикулярного канала (АВК) является отдельной группой с комплексной внутрисердечной анатомией, которая встречается лишь у 2% пациентов с ТФ. Как правило, выполняется одномоментная коррекция, правда риск операции выше, чем при коррекции изолированной ТФ или АВК. |