Диссертация-Козырев-И.А.. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители доктор медицинских наук профессор Гордеев М. Л., кандидат биологических наук
 Скачать 3.84 Mb.
|
|
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Методы исследования 2.1.1 Клинические методы исследования Эхокардиографическое исследование проводилось всем пациентам до операции, сразу после операции, ежедневно после операции и в отдаленном периоде на протяжении 4 лет. При выполнении данного исследования измерялись размеры фиброзного кольца клапана легочной артерии, значения пикового и среднего градиента, степень регургитации клапана. Эхокардиографическое исследование проводилось по стандартизированной методике с использованием ультразвуковых систем «Vivid-i С 257» (США) и «Phillips iE-33» (США) с использованием фазово-электронного сканирующего датчика с частотой от 3,5 до 7,0 МГц с возможностью цветного доплеровского картирования и импульсной непрерывной спектральной доплерографии. Компьютерная томография выполнялась всем пациентам перед хирургической коррекцией для оценки степени развитости легочного русла и исключения значимых аорто-легочных коллатералей. Компьютерная томография с контрастированием в режиме ангиографии выполнялась по протоколу со сниженной лучевой нагрузкой на аппарате Siemens Somatom Definition 128. Показатель Z-score вычислялся на основе весо-ростовых характеристик при использовании системы данных детского госпиталя Бостона (zscore.chboston.org). Индекс Nakata вычислялся по формуле суммы площади поперечного сечения левой и правой легочных артерий разделенной на площадь поверхности тела Индекс Nakata = S ЛЛА +S ПЛА S ППТ , (1) 43 где S ЛЛА – площадь поперечного сечения левой легочной артерии; где S ПЛА – площадь поперечного сечения правой легочной артерии; где S ППТ – площадь поверхности тела. Для анализа операционных характеристик собирались следующие данные: сохранение собственного клапана легочной артерии (КЛА) во время оперативного вмешательства или выполнение трансаннулярной пластики (ТАП) с / без моностворки. Также заносились данные времени пережатия аорты, времени искусственного кровообращения, уровня гипотермии и общей длительности операции. Для оценки раннего послеоперационного периода оценивались длительность применения инотропных препаратов (дофамина и адреналина), инотропный индекс на 24 и 72 часа, длительность искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Для оценки общего статуса пациентов после операции оценивалась длительность госпитализации. Статистический анализ. Сравнение непараметрических вариационных рядов (2 независимые группы) производилось с помощью U- критерия Манна – Уитни, трех групп с помощью рангового анализа вариаций по Краскелу-Уоллису с последующим парным сравнением групп тестом Манна-Уитни с применением поправки Бонферрони при оценке значения р. Значение p<0,05 принималось как статистически значимое. Данные представлены в виде медианы вариационного ряда и интерквартильного размаха (25 и 75 процентили). На диаграммах размаха горизонтальными линиями внутри прямоугольников обозначены медианы; верхняя и нижняя границы прямоугольников отражают 25-75 процентили соответственно; вертикальные линии от прямоугольников показывают диапазоны минимальных и максимальных значений. Корреляционный анализ выполнялся с использованием непараметрического критерия 44 Спирмена. Корреляцию считали высокой при R=0,5-0,7, средней при R=0,3- 0,5. Данные представлены в виде M±SD (при нормальном распределении значений) или Me (Q1;Q3) при распределении значений, отличных от нормального. Надежность используемых статистических оценок принималась не менее 95%. Использовались программные пакеты Microsoft Office Excel 2010, STATISTICA 10.0 (Statsoft, USA), Graphpad Prism ver.5.0 (GraphPad Software, Inc). 2.1.2 Клиническая характеристика пациентов В настоящее исследование были включены 63 пациента с диагнозом тетрада Фалло, находившиеся на лечении в НМИЦ им. В.А. Алмазова с января 2014 по декабрь 2018 г, которым была выполнена плановая (элективная) радикальная коррекция порока. Изначально было сформировано 2 группы пациентов: первая - ранняя радикальная коррекция до 6 месяцев и вторая - в возрасте старше 6 месяцев. Распределение осуществлялось в зависимости от возраста поступления пациентов на отделение (пациенты более старшего возраста направлялись на хирургическое лечение из регионов). Пациенты, которые были проконсультированы после рождения в нашем центре, поступали в более раннем возрасте на плановую операцию. В процессе анализа клинического материала было принято решение разделить дополнительно первую группу на две подгруппы: до 3 месяцев и 3-6 месяцев. Выделение дополнительной подгруппы было обусловлено следующими факторами: уменьшение рисков оперативного вмешательства после 2-3 месяцев вследствие адаптации функций органов и тканей пациента, уменьшение явлений физиологической легочной гипертензии, а также существующей гипотезе о более вероятном сохранении целостности КЛА при хирургической коррекции. В результате все пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от возраста радикальной коррекции. Первую группу исследования составляли пациенты возрастом до 3 месяцев, вторую – 3-6 месяцев, третью 45 – старше 6 месяцев. Операция у пациентов в первых двух групп трактовалась как ранняя радикальная коррекция. Пациентам в 3 группе выполнялась первичная радикальная коррекция или радикальная коррекция с предшествующей паллиативной операцией. Клинические примеры ЭХОКГ приведены на рисунках 3 и 4. Рисунок 3 – Выраженный стеноз выносящего отдела правого желудочка (ВОПЖ) по данным 2-D эхокардиографии с цветным доплеровским картированием 46 Рисунок 4 – «Гипоплазированный левый желудочек» и его соотношение с правым желудочком. 2-D эхокардиография Выполняемая перед операцией компьютерная томография показывала степень развитости легочного русла и в некоторых случаях относительную гипоплазию ветвей легочной артерии (рис. 5-7). Рисунок 5 – Гипоплазия ствола легочной артерии (Z-score - 4,21) 47 Рисунок 6 – Гипоплазия левой легочной артерии (Z-score -1,58) Рисунок 7 – Гипоплазия правой легочной артерии (Z-score -3,24) Всем пациентами производилось измерение размеров ветвей ЛА тремя различными методами: по данным ЭХОКГ, КТ и интраоперационно с использованием сайзеров (дилататоров DeBakey) (Рис. 8) 48 Рисунок 8 – А. Интраоперационное изображение измерения размера левой ЛА дилататором DeBakey. Б. Схематическое изображение измерение левой ЛА Критериями для оценки эффективности коррекции являлись значение пикового градиента между ПЖ и стволом легочной артерии, измеренное в мм рт. ст., а также отношение давления в ПЖ к давлению в ЛЖ в процентном соотношении. Инотропный индекс (ИИ) показывал тяжесть инотропной поддержки после коррекции. Инотропный индекс вычислялся по следующей формуле: Допамин (мкг/кг/мин) + Добутамин (мкг/кг/мин) + 100хАдренали (мкг/кг/мин) (2) Значения ИИ оценивались через 24 и 72 часа после операции. Критерии включения в исследование: 49 - пациенты с тетрадой Фалло, которым выполнялась радикальная коррекция порока; - плановая (элективная) коррекция без экстренных показаний; - возраст старше одного месяца. Критерии исключения из исследования: - пациенты, которым на момент сбора данных была выполнена только паллиативная коррекция и не выполнена радикальная коррекция, до окончания исследуемого периода; - пациенты с ТФ в сочетании с атрезией клапана легочной артерии, с агенезией клапана легочной артерии и с полной формой атриовентрикулярного канала. 2.2 Экспериментальные методы исследования 2.2.1 Клеточные культуры Для проведения экспериментальной работы с клеточными культурами было получено разрешение локального этического комитета. Все эксперименты проводились в соответствии с принципами Хельсинской декларации. Для исследования использовались клеточные культуры клеток миокарда правого желудочка от 42 пациентов с ТФ и 16 пациентов с ДМЖП в качестве контрольной группы. Фрагменты миокарда ПЖ и ПП (правого предсердия) пациентов получали в ходе плановых операций по радикальной коррекции порока, осуществляемых в ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России. Забор операционного материала проводился после подписания законными представителями пациентов информированного согласия. Первичные культуры получали путем измельчения фрагмента 50 ткани миокарда и последующей ферментативной обработки коллагеназой II (0,7 мг/мл) в течение 120 минут при температуре 37°С [154]. Через 1 сутки среду заменяли на свежую, удаляли крупные остатки и затем культивировали до достижения конфлюэнтного состояния (приблизительно через 5-7 суток). По достижению конфлюэнтного состояния культура состояла из мелких однородных быстроделящихся клеток. Культивирование клеток. Суспензию клеток просеивали через 40 мкМ фильтр, центрифугировали при скорости 300 g в течение 5 минут, затем клетки ресуспензировались в питательной среде (22,5 % EGM-2 (Stem Cell, США), 67,5 % M199, 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Hyclone), 1x неспецифических аминокислот, 50 ед/мл пенициллина and 50 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific). После этого клетки высеивались на покрытые 0,1% желатином культуральные планшеты и доводили культуры до состояния конфлюентности. Клеточные культуры культивировали при 37°С, 5 % CO2 и 99%-ой влажности. Полученная культура популяции клеток была однородна. Клеточную среду меняли каждые 2 суток. В работе использовали клетки 4 - 8-го пассажей. Пролиферативная активность. Пролиферативная активность клеток оценивалась в реальном времени при использовании xCELLigence RTCA S16 (Agilent ). 5000 клеток в 100 мкл раствора вносили в каждую из лунок специальных культуральных планшетов. Затем было добавлено по 100 мкл раствора в каждую ячейку. Значения импеданса каждой ячейки автоматически мониторировались в течение 72 часов и были перенесены на график как CI (Cell Index – клеточный индекс), который вычислялся автоматически программным обеспечением по следующей формуле: , (3) 51 где CI (t) – клеточный индекс; ƒn - частота, на которой выполняется измерение импеданса; R(ƒn, t) - измеренное сопротивление на частоте ƒn в момент времени t; R(ƒn, t0) - измеренный импеданс на частоте ƒn в момент времени t0; t0 - время, когда измеряется фон; Zn - это соответствующий частотный коэффициент ƒn. Все образцы анализировались в дупликатах. Для анализа данных использовалось программное обеспечение RTCA Software (версия 1.0.0.1304). Праймеры. Для анализа экспрессии генов в работе использовали праймеры, синтезированные в компании Евроген (Россия) и Applied Biosystems (США). Последовательности использованных праймеров приведены в таблице 1. Таблица 1 – Праймеры, использованные в ПЦР в реальном времени Название праймера Последовательность (5’→3’) Праймеры для эндогенного контроля GAPDH F: AATGAAGGGGTCATTGATGG R: AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA Праймеры для генов Notch сигналинга HEY1 F: TGGATCACCTGAAAATGCTG R: CGAAATCCCAAACTCCGATA HES1 F: AGCACAGAAAGTCATCAAAG 52 R: AGGTGCTTCACTGTCATTTC NOTCH1 F: GTCAACGCCGTAGATGACC R: TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG NOTCH2 F: ATGGTGGCAGAACTGATCAAC R: TTGGCAAAATGGTCTAACAGG NOTCH3 F: GGAGCCAATAAGGACATGCAGGAT R: GGCAAAGTGGTCCAACAGCAGC NOTCH4 F: GTTGTGACAGGGTTGGGACT R: CAGCCCAGTGGGTATCTCTG DLL4 F: AGGCCTGTTTTGTGACCAAG R: CTCCAGCTCACAGTCCACAC JAGGED1 F: TGCCAAGTGCCAGGAAGT R: GCCCCATCTGGTATCACACT 2.2.2 Выделение РНК из клеточных культур Выделение РНК из клеток проводили при помощи реагента для экстракции тотальной РНК (Евроген, Россия). Из чашек отбирали среду для культивирования, клетки промывали PBS, добавляли реагент для выделения РНК и, при помощи скребка, снимали клетки с чашки. Центрифугировали и добавляли к супернатанту хлороформ для разделения фаз (0,1 мл на 0,5 мл реагента), центрифугировали, отбирали водную фазу. Для осаждения РНК к водной фазе добавляли изопропиловый спирт (0,25 мл на 0,5 мл реагента). Инкубировали при -20-40°С в течение 12-24 часов, затем промывали осадок РНК в 75% растворе этанола (0,5 мл на 0,5 мл реагента). Спирт удаляли и 53 осадок сушили в течение 30 минут. Затем осадок растворяли в 20 мкл стерильной воды, очищенной от нуклеаз. Количество выделенной РНК оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop (Thermo scientific, США) в концентрации нг/мкл, также оценивали чистоту образцов – соотношение пиков поглощения 260 нм/280 нм – соответствие примесям белков и аминокислот; 260 нм/230 нм – примесям солей и фенола. Оценку качества выделенной РНК проводили при помощи метода электрофореза в агарозном геле при силе тока 70 – 90 мА с использованием электрофоретических приборов (BioRad, США). 2.2.3 Обратная транскрипция Реакция обратной транскрипции необходима для получения из РНК кДНК. Для этого использовали набор для обратной транскрипции (Евроген, Россия). Для осуществления реакции брали следующие компоненты: 1 или 2 мкг РНК (в зависимости от концентрации) разбавляли стерильной водой до 8 мкл, добавляли 1 мкл рандомных праймеров, 4 мкл 5х буфера (First Strand buffer ), 2 мкл воды из набора, 2 мкл 10 мМ нуклеотидтрифосфатов, 2 мкл дитиотреитола (DTT) и 1 мкл M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase ) обратной транскриптазы. 2.2.4 ПЦР в реальном времени Для количественного анализа изменения уровня экспрессии исследуемых генов использовали коммерческие системы ПЦР в реальном времени SYBR Green (Евроген, Россия). Из расчета на 1 реакцию использовали 13 мкл воды SQ, по 1 мкл прямого и обратного праймеров, 5 мкл буфера с флуоресцентным красителем (qPCRmix-HS SYBR+ROX) и 5 мкл (разбавленной до 100 мкл водой) кДНК матрицы, полученной в результате реакции обратной транскрипции. В случае проведения ПЦР в реальном времени с использованием системы TaqMan, из расчета на 1 реакцию использовали: 14 мкл воды SQ, 1 мкл специфического зонда, 5 мкл 54 буфера (qPCRmix-HS ROX) и 5 мкл (разбавленной до 100 мкл водой) кДНК матрицы, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Реакцию проводили в 96-луночных оптических платах (Applied Biosystems, США). Режим работы амплификатора: 5 минут 95º, затем 45 циклов, включающих денатурацию по 15 секунд при 95ºC и отжиг праймеров с амплификацией 60 секунд при 60ºC. Температура отжига всех праймеров составляла около 60ºС. Праймеры для ПЦР в реальном времени подбирали с использованием программы “Oligo 6” (Molecular Biology Insights, США). Для анализа данных, полученных в ходе количественной ПЦР в режиме реального времени, в качестве метода представления относительной экспрессии гена использован сравнительный Ct метод (2-ΔΔCt метод), в модификации «относительное околичествление», при котором оценка экспрессии гена интереса производилась относительно экспрессии внутреннего контрольного гена. В ходе анализа для каждой реакции рассчитывали следующие показатели: значение Ct (ΔCt), значение ΔCt (ΔΔCt) для репликатов, показатель 2ΔΔCt, кратность отношения уровней экспрессии в образцах (в сравнении индивидуальных экспериментальных групп со средним значением для внутреннего контрольного образца). Уровень экспрессии исследуемого гена нормализовали по уровню экспрессии гена домашнего хозяйства GAPDH. Серии экспериментов повторяли трижды (биологические репликаты), для каждого эксперимента проверку уровня экспрессии соответствующего гена повторяли дважды (технические репликаты). 55 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ЧАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1.1 Интраоперационные данные Всего в исследование было включено 63 пациента: в 1 группу – 10 пациентов, во 2-ю группу – 30 пациентов, в 3-ю – 23 пациента. При проверке данных на нормальность распределения по W критерию Шапиро-Уилка было установлено, что симметричное распределение, близкое к нормальному, имеют только показатели времени искусственного кровообращения и времени пережатия аорты. Поэтому в дальнейшем при анализе индивидуальных показателей использовались только непараметрические методы статистического анализа: две независимые группы сравнивались с помощью U-критерия Манна – Уитни. Медиана возрастов составила 88 (44;94) дней для 1-й группы, 132 (98;172) дней для 2- й группы и 256 (182;1859) дней для 3-й группы. Вес пациентов статистически отличался между группами (p<0,05). Медианы размеров фиброзных колец клапана легочной артерии составили: для 1-й группы - 5,0 (4,0; 8,0) мм, для 2-й группы – 7,0 (3,0; 11,0) мм, для 3-й группы – 7,8 (4,5; 12,0) мм. Статистическое различие было получено только между 1 и 3 группами (р<0,05) (Рис. 9). Рисунок 9 – Размер клапана легочной артерии у пациентов 56 различных групп После индексации размеров клапана ЛА к весо-ростовым характеристикам, было получено, что показатели индекса Z-score КЛА не отличаются статистически между группами (Рис. 10). Рисунок 10 - Z-score клапана легочной артерии у пациентов различных групп Оперативные данные представлены в таблице 2. В данной таблице приведены медианы и интерквартильные интервалы пикового градиента между ПЖ и ЛА после коррекции, соотношение систолического давления в ПЖ к ЛЖ после коррекции, времени искусственного кровообращения, пережатия аорты, температуры охлаждения и времени операции. Таблица 2 – Оперативные данные Группы 1 2 3 Сохранение КЛА, n (%) 4 (40%) 18 (60%) 10 (43%) Трансаннулярная пластика, n (%) 6 (60%) 12 (40%) 13 (57%) 57 Имплантация моностворки 1 11 8 Баллонирование КЛА 4 8 0 Механическая дилатация КЛА, n 0 5 0 Градиент ПЖ/ЛА, мм рт. ст. 24 (20; 35) 18 (10; 25) 14 (11; 27) Давление ПЖ/ЛЖ, % 51 (45-72) 48 (35-69) 34 (30-57) Искусственное кровообращение, мин 132 (89;235) 128 (56;239) 154 (81;191) Пережатие аорты, мин 68 (43;102) 67 (31;122) 79 (38;144) Температура охлаждения, °C 27 (24;32) 28 (24;32) 28 (24;32) Время операции, мин 220 (185;390) 223 (135;365) 283 (170;360) Примечание. КЛА - клапан легочной артерии, ЛА – легочная артерия, ПЖ – правый желудочек, ЛЖ – левый желудочек Важно, что при ТАП в большинстве случаев выполнялась одновременная имплантация моностворки. Во всех группах значения пикового градиента между ПЖ и стволом ЛА, а также отношение давления ПЖ/ЛЖ были приемлемы в конце операции. В таблице 3 представлена совокупность до- и интраоперационных измерений диаметров ЛА у всех пациентов индексированных в Z-score. Таблица 3 – Предоперационные и операционные результаты измерения ЛА (Z-score) ЭхоКГ КТ Операция Левая легочная артерия -1,63 (-2,24; - 0,66) -0,06 (-1,17; 1,07) -0,48 (-0,74; - 1,29) 58 Правая легочная артерия -1,57 (-2,2; -0,72) -0,69 (-1,45; - 0,81) -0,34 (-0,33; - 0,89) При анализе результатов были выявлены различия в размерах легочных артерий между показателями, полученными по данным дооперационных визуализирующих методов обследования, и данными из операционных протоколов (Рис. 11). При проведении статистического анализа полученных данных при помощи критерия Манна-Уитни выявлено, что Z-score правой и левой ветви легочной артерии по данным ЭхоКГ были существенно меньше при сравнении с данными МСКТ (p<0,01). В свою очередь, сравнительная оценка дооперационных и интраоперационных размеров ЛА выявила различие между размерами ЛА на основании данных КТ по сравнению с интраоперационными измерениями, однако статистически незначимую (p=0,05). У 10 пациентов с индексом Nakata по данным КТ менее 150 мм2\м2 и показателями Z-score ветвей ЛА от -3,41 до -0,43 после измерения размеров ЛА в операционной была выполнена радикальная коррекция. Таким образом, чувствительность предоперационных методов составила 63%, а специфичность 86% Рисунок 11 - Z-score правой и левой легочных артерий в зависимости от метода оценки, диаграммы размаха. (ЛЛА – левая легочная артерия, ПЛА 59 – правая легочная артерия, ЭхоКГ – эхокардиография, КТ – компьютерная томография, ОП – операционные данные) Расчет индекса Nakata дополнительно иллюстрирует выявленную закономерность, отражая статистическую значимость полученных данных между группами ЭхоКГ и КТ (р<0,01). После применения поправки Бонферрони для преодоления проблем множественных сравнений статистическая значимость между показателями, полученными методам КТ и операционными данными, не была установлена (p>0,05). Использование данных трёх методов оценки размеров ЛА привело к получению трёх различных результатов при расчёте индекса Nakata. При использовании эхокардиографических данных индекс Nakata составил 106,8 (74,36; 154,7) мм2/м2, данных КТ - 187,6 (118,2; 245,9) мм2/м2, интраоперационных данных - 223,0 (161,3; 277,2) мм2/м2. Для большей наглядности результаты полученных расчетов представлены графически (Рис. 12). Полученные нами гемодинамические данные подчеркивают ценность проведения интраоперационной оценки ЛА, позволяя сделать вывод о влиянии данного метода на выбор радикальной коррекции порока в качестве первичного оперативного вмешательства. Рисунок 12 – Индекс Nakata (ЭхоКГ-эхокардиография, КТ- 60 компьютерная томография, ОП-операционный протокол) 3.1.2 Послеоперационный период Ранний послеоперационный период характеризовался следующими показателями: инотропный индекс через 24 и 72 часа после коррекции, общая длительность потребности применения инотропных препаратов (адреналина и дофамина) (в сутках). Параметр длительности инотропных препаратов в нашей работе характеризует период, при котором отмечались явления гемодинамической и клинически значимой сердечной недостаточности. Также анализировалась длительность искусственной вентиляции легких (ИВЛ) в часах и итоговое время госпитализации в сутках. Инотропный индекс через 24 часа и 72 часа представлен в таблице 4. Таблица 4 - Инотропный индекс Инотропный индекс Группа 1 Группа 2 Группа 3 р Различия ( группы) 24 часа 17,5 (10; 25) 13,5 (10; 19) 10 (5; 15) 0,03 1 и 3 72 часа 0,5 (0; 4,5) 0,3 (0; 3,5) 0,1 (0; 2,5) 0,11 - Как видно из таблицы, было установлено что между 1 и 3 группами отмечается статистически значимые различия по значению инотропного индекса через 24 часа после операции (р=0,003). Однако различия между группами к 72 часам нивелируются. 61 Длительность общего периода применения дофамина составила 2,0 (2,0; 2,5) суток, 2,3 (1,6; 4) суток и 1,0 (0,7; 1,5) суток для первой, второй и третьей группы, соответственно. Однако нужно отметить, что нами было найдено статистически значимое различие в длительности применения дофамина между пациентами из первой и третьей группами (р=0,004) и пациентами между второй и третьей группами (р=0,041). Статистического различия в длительности применения дофамина между первой и второй группами получено не было. Длительности общего периода применения адреналина составила 3,0 (1; 25) суток, 1,3 (0,5; 4,0) суток и 1,0 (0,8; 2,0) суток для первой, второй и третьей группы соответственно. Статистически значимого различия между группами получено не было. Медиана времени ИВЛ составила 23 (8; 45) часов для первой группы, 16 (6; 45) часов для второй группы и 6,3 (6; 32) часа для третьей группы. Статистически значимого различия между группами получено не было. Сравнение длительности госпитализации пациентов в различных группах приведены на рисунке 13. Рисунок 13 – Сравнение длительности госпитализации пациентов в 62 различных группах В таблице 5 приведены все сводные сведения интраоперационных и послеоперационных параметров, участвующих в анализе. Приведены медианы, квартили, значения р по критерию Краскела-Уоллиса и пары групп, различия между которыми оказались статистически значимыми. Таблица 5 – Интра- и послеоперационные параметры Показатель Группа 1 Группа 2 Группа 3 р Различия Сатурация, % 85; (80; 96) 96; (92; 98) 91; (87; 96) 0,04 — Клапан ЛА, мм 4; (5; 7) 7; (6; 8) 6; (8; 10) 0,03 1 и 3 группы Z-score –3,52; (–3,84; – 2,34) –2,39; (–2,86; – 1,58) –2,46; (–3,99; – 1,74) 0,25 — Длительность ИВЛ, час 23; (8; 45) 16; (6; 45) 6; (6; 32) 0,46 — Длительность дофамина, сут 2,0; (2,0; 2,5) 2,3; (1,6; 4,0) 1,0; (0,7; 1,5) 0,004 1 и 3 гр, 2 и 3 гр Длительность адреналина, сут 3,9; (1,0; 25,0) 1,3; (0,5; 4,0) 1,0; (0,8; 2,0) 0,36 — Время ИК, мин 132; (104; 158) 128; (111; 160) 154; (118; 167) 0,67 — 63 Время пережатия аорты, мин 68; (43; 74) 68; (58; 83) 79; (63; 84) 0,22 — Температура, ° 27; (26; 30) 28; (27; 30) 28; (25; 28) 0,68 — Длительность операции, мин 220; (190; 240) 223; (200; 298) 283; (215; 310) 0,19 — Длительность госпитализации, сут 23; (15; 24) 16; (13; 21) 16; (14; 19) 0.11 — Для применения многомерного анализа шесть показателей с сильной положительной асимметрией (возраст, вес, длительность вентиляции, длительность применения допамина, адреналина и длительность госпитализации) были симметризованы с помощью логарифмирования. К их кодам прибавлен символ р (pВозраст, pВес, pИВЛ, pДопамин, p Адреналин и pГоспитализация). Для выявления связей между показателями была использована процедура иерархической кластеризации методом Варда с выбором меры связи показателей, равной (1–r), где r - коэффициент корреляции Пирсона. На рисунке 14 хорошо видно распределение показателей на две слабо связанные группы - кластера. 64 Рисунок 14 – Иерархическая кластеризация методом Варда с выбором меры связи показателей, равной (1–r), где r - коэффициент корреляции Пирсона На рисунке 15 представлена диаграмма главных компонентов, на которой: два пучка образуют так называемую «корреляционную плеяду». Рисунок 15 – Диаграмма корреляционных плеяд главных компонентов на основании иерархической кластеризации методом Варда 65 Для выяснения, какие именно из семи показателей этой плеяды определяют различие между кластерами, был проведен дискриминантный анализ. Пошаговая процедура оставила только три сильно значимых показателя: Z-score, Temper и Optime. Их влияние на различие между кластерами оказалось примерно равным (коэффициенты корреляции Пирсона между ними и оптимальной дискриминантной функцией равны, соответственно, -0,41, -0,52 и 0,57). Вероятность правильной классификации оказалась равной 93,2%. В таблице 6 приведены медианы, квартили и р-значения. Таблица 6 – Сравнение кластеров Показатель Кластер 1 Кластер 2 р Возраст 146; (117; 202) 164; (112; 268) 0,51 Вес 6,4; (5,6; 7,3) 6,5; (5,8; 7,8) 0,36 SpO2 96; (92; 98) 91; (85; 96) 0,03 КЛА 8,0; (7,0; 8,8) 6,5; (5,0; 7,5) 0,002 Z-score –1,93; (–2,59; – 1,10) –2,76; (–3,99; – 2,20) 0,0008 ИВЛ 7; (5; 17) 22; (6; 72) 0,01 Дофамин 1,3; (1,0; 2,0) 2,0; (1,3; 4,0) 0,02 Адреналин 1,8; (0,5; 3,0) 1,0; (0,8; 4,0) 0,77 ИК 110; (100; 121) 159; (137; 177) <0,0001 Ишемия 57; (48; 64) 83; (72; 96) <0,0001 Температура 29; (28; 31) 27; (25; 28) <0,0001 66 Время ОП 200; (190; 215) 288; (235; 330) <0,0001 Госпитализация 15; (13; 19) 16; (15; 23) 0,10 По результатам многомерного анализа вышеперечисленных критериев установлено, что не возникает распределение на группы по возрасту, а возникает по клинической тяжести проявления порока, а именно по уровню сатурации артериальной крови и размеру ФК клапана легочной артерии. Можно утверждать, что у пациентов более раннего возраста интраоперационные, ранние и поздние послеоперационные данные сопоставимы со старшими пациентами. Таким образом, более ранние сроки выполнения операции не утяжеляет общее течение интра- и послеоперационного периодов: не увеличивается длительность операции, реанимационного и госпитального периодов. Летальность была зафиксирована в 3 случаях. Один летальный случай был отмечен в 2014 году и два летальных случая в 2015 году. Первый пациент 5 месяцев имел сопутствующие периферические стенозы легочной артерии. После выполнения первичной радикальной коррекции и бужирования периферических стенозов легочной артерии отмечались эпизоды десатурации, потребовавшие подключение аппарата экстракорпоральной оксигенации. В дальнейшем происходило нарастание признаков полиорганной недостаточности и через 7 дней после операции наступил летальный исход. Второму пациенту 2 месяцев с синистрокардией была выполнена ранняя радикальная коррекция с трансаннулярной пластикой, вентрикулотомией и имплантацией моностворки. В связи с явлениями остаточного стеноза в ВОПЖ потребовалось повторное проведение дополнительной объемной резекции мышечного компонента стеноза ВОПЖ, что отрицательно сказалось на насосной функции ПЖ. В дальнейшем присоединились явления полиорганной недостаточности, 67 приведшие к летальному исходу на 15 сутки после операции. У третьего пациента возрастом 1 год 8 мес. с гипоплазией центрального легочного русла, на первом этапе выполнялась паллиативное вмешательство – реконструкция пути оттока из ПЖ. На момент радикальной коррекции отмечалось сохранение умеренной гипоплазии правой ЛА. Была выполнена радикальная коррекция с расширенной трансаннулярной резекцией и пластикой ВОПЖ и имплантация моностворки. В связи с развитием миокардиальной слабости правого желудочка, на фоне высокого сопротивления в малом круге кровообращения в раннем послеоперационном наступил летальный исход. За последние три года летальных исходов у пациентов, входящих в исследование, не было. 3.1.3 Отдаленный период После выписки из стационара было обследовано 28 пациентов с периодом отдаленного наблюдения до 4 лет. В первую группу было включено 6 пациентов, во вторую - 8 пациентов, в третью - 14 пациентов. На рисунке 16 представлены медианы показателей градиента в ВОПЖ в разных группах. 68 Рисунок 16 – Значения градиентов в выносящем отделе правого желудочка в отдаленном периоде Было установлено, что среди всех обследованных пациентов максимальный градиент в ВОПЖ среди пациентов с сохраненным клапаном ЛА в отдаленном периоде составил 40 мм рт ст, что является приемлемым значением. Во всех группах наблюдалось увеличение градиента к 6 месяцам после операции. В дальнейшем было зафиксировано незначительное увеличение градиента в первых двух группах, где было выполнено больше клапан-сохраняющих операций. На рисунке 17 показаны медианы значений степени регургитаций в проекции клапана легочной артерии. 69 Рисунок 17 – Значения степеней регургитации КЛА в отдаленном периоде Обращает на себя внимание, что в третьей группе происходило постепенное нарастание степени регургитации, начиная с трехмесячного возраста. Это может быть объяснено наличием имплантированной синтетической моностворки при трансаннулярной пластике и потерей ее функции в большинстве случаев через год после операции. Подводя итог нужно отметить, что в первых двух группах ранней РК в госпитальном периоде наблюдения значения пикового градиента в выносящем тракте правого желудочка были приемлемыми, а степень регургитации была меньше, чем в группе более поздней коррекции. 70 Клинический случай 1 Пациент М., 3 месяца с тетрадой Фалло. Пациент М. поступил в возрасте 3 мес. с весом 4,8 кг, ростом 60 см для плановой хирургической коррекции ТФ. ВПС был поставлен внутриутробно. После рождения диагноз подтвержден. Было рекомендовано выполнение радикальной коррекции порока в возрасте до 3 месяцев. Во время динамического наблюдения отмечались эпизоды цианоза во время плача. При поступлении в отделение детской кардиохирургии по данным ЭХОКГ размер дефекта межжелудочковой перегородки составляет 9 мм, Выходной отдел правого желудочка в самом узком месте сужен до 5 мм, пропускное отверстие клапана ЛА 4,5 мм, диаметр кольца клапана ЛА 7 мм. Показатель Z-score клапана ЛА -1,92, расчётный размер клапана ЛА 10,5 мм. После срединной стернотомии и подключения аппарата искусственного кровообращения по стандартной бикавальной методике, было начато искусственное кровообращение (ИК) с постепенным охлаждением до температуры 30°С. В условиях параллельного ИК наложен зажим на ствол ЛА на 7 мм выше клапана ЛА. Ствол ЛА продольно вскрыт. В правую и левую легочные артерии проведен дилататор DeBakey расчётного размера 6 мм (Рис. 18. А, Б). 71 Рисунок 18 – А. Измерение размера левой легочной артерии. Б. Измерение размера правой легочной артерии. (Ао –Аорта, ВПВ – верхняя полая вена, НПВ – нижняя полая вена) После проведения кардиоплегии, выполнена ревизия ДМЖП и клапана ЛА. Субаортальный ДМЖП находился в типичном месте, диаметр дефекта составил 9 мм. Клапан ЛА двухстворчатый, передне-заднее расположение створок, створки с небольшими фиброзными изменениями, сращения по обеим комиссурам, пропускное отверстие клапана 5 мм, фиброзное кольца клапана 7 мм (Рис.19). Выполнена комиссуротомия с обеих сторон с небольшим заходом на фиброзное кольцо клапана, пропускное отверстие увеличено до 7 мм. 72 Рисунок 19 – Оценка клапана легочной артерии. Пунктирной стрелкой обозначено эффективное пропускное отверстие клапана. Сплошной стрелкой обозначено фиброзное кольца клапана Трнасатриально и транспульмонально выполнено рассечение, частичное иссечение аномальных септо-париетальных трабекул в ВОПЖ. После этого через правое предсердие и правый желудочек проведен баллонный катетер в ствол ЛА (Рис. 20). 73 Рисунок 20 – Проведение проводника баллонного катетера через правый отделы сердца в выходной отдел правого желудочка После позиционирования баллонного катетера таким образом, чтобы его середина располагалась в проекции клапана ЛА, баллон раздут три раза до достижения расчётных размеров (10,5 мм) для фиброзного кольца КЛА (Рис. 21). Также на рисунке 4 можно оценить, что раздутый баллон сопоставим по диаметру с аортой. 74 Рисунок 21 – Раздувание баллона до достижения расчётных размеров для КЛА После удаления баллонного катетера выявлен разрыв передней створки КЛА по средней линии (Рис. 22) Рисунок 22 – Ревизия разрыва передней створки клапана 75 Через увеличенное ФК клапана выполнено дополнительное иссечение мышечных трабекул в выносящем отделе ПЖ. В связи с тем, что парусность передней створки была достаточной, пластику створки принято решение выполнить прямым швом без использования заплаты. Целостность передней створки восстановлена отдельными швами (Рис 23. А, Б). Рисунок 23 – А. Начальный этап восстановления передней створки клапана. Б. Конечный этап восстановления целостности передней створки клапана Дефект межжелудочковой перегородки закрыт заплатой из ксеноперикарда непрерывным швом. После герметизации правого предсердия, выполнена пластика ствола ЛА заплатой из нативного аутоперикарда. После окончания ИК пациент с синусовым ритмом был переведен в отделение реанимации. По результатам послеоперационного УЗИ контроля пиковый градиент в ВОПЖ составил 23 мм рт ст, I степень регургитации на клапане ЛА, резидуальные токи на перегородках сердца не выявлены. Пациент находился в отделении реанимации 2 суток, был выписан из стационара на 13 сутки после операции. На УЗИ контроле через 76 1 год функция клапана ЛА состоятельна, пиковый градиент составил 19 мм рт ст в сочетании с I степенью недостаточности клапана ЛА. Клинический случай 2 Пациент А., 3,5 месяца с тетрадой Фалло. Пациент А. поступила в возрасте 3,5 мес. с весом 4,5 кг, ростом 55 см для плановой хирургической коррекции ТФ. ВПС был установлен после рождения. Во время динамического наблюдения отмечались эпизоды цианоза во время плача и кормления с уменьшением сатурации до 85%, в спокойном состоянии сатурации около 92%. При поступлении в отделение детской кардиохирургии по данным ЭХОКГ размер дефекта межжелудочковой перегородки составляет 10 мм, Выходной отдел правого желудочка в самом узком месте сужен до 5 мм, пропускное отверстие клапана ЛА 6 мм, диаметр кольца клапана ЛА 6 мм. Показатель Z-score клапана ЛА -2,82, расчётный размер клапана ЛА 9,5 мм. После срединной стернотомии выполнена радикальная коррекция по методике, описанной в предыдущем случае. Мышечный стеноз ВОПЖ устранялся через трансатриальный и транспульмональный доступы, клапан ЛА был сохранен. Через КЛА и ВОПЖ свободно прошел дилататор №10. После окончания ИК и выполнения модифицированной ультрафильтрации, остаточный градиент между полостью ПЖ и стволовом ЛА составил 40 мм. рт. ст. В связи с тем, что с одной стороны отсутствовал разрез ПЖ, с другой стороны была уже выполнена объемная резекция в ВОПЖ, было принято решение об окончании операции. В палате реанимации был назначен дополнительно анаприлин. Через 7 суток в связи с подозрением остаточного значимого градиента между полостью ПЖ и стволом ЛА (пиковый градиент по данным ЭХОКГ 70 мм. рт. ст.) выполнена манометрия и ангиография (Рис. 24). 77 Рисунок 24 – Вентрикулография правого желудочка и ангиография легочного русла. Фигурной стрелкой обозначено самое узкое место в выносящем отделе правого желудочка При манометрии установлено: ствол ЛА 38/19/27, ПЖ 63/3/7, АД 92/47/6 мм. рт. ст. В связи с удовлетворительными параметрами гемодинамики пациент был выписан за 14 сутки после операции. При контрольном обследовании через 12 месяцев, остаточный градиент между ПЖ и стволом ЛА по данным ЭХОКГ составил 15 мм. рт. ст. 78 3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.2.1 Сравнение экспрессии рецепторов и лигандов Notch-сигнального пути в мезенхимных клетках сердца от пациентов с ТФ и ДМЖП В нашей работе мы использовали мезенхимные клетки сердца от пациентов с тетрадой Фалло, как модель для изучения пролиферативной способности этих клеток и исследования вовлеченности Notch-сигнального пути в ТФ. Мы предположили, что Notch-сигнальный путь может быть дисбалансирован в тканях сердца пациентов с ТФ, и эта дисрегуляция может быть ответственна за ремоделирование тканей сердца у пациентов с ТФ. Хотя репаративный потенциал клеток предшественников кардиомиоцитов остается неизвестным, эти клетки представляют собой удобный и относительно доступный источник клеток сердца человека и могут быть использованы для выявления механизмов и процессов, связанных с развитием сердца. Таким образом, в дополнении к основным задачам, мы анализировали активность Notch-сигнального пути в мезенхимных клетках сердца, полученных из образцов ПЖ у пациентов с ТФ. В качестве группы сравнения мы использовали МКС из тканей пациентов с изолированным дефектом межжелудочковой перегородки (ДМЖП), поскольку этот изолированный дефект не ассоциирован с вовлеченностью Notch-сигнального пути. В качестве экспериментальной части работы нами проводилась оценка уровня мРНК ключевых генов пути Notch NOTCH1-4 и Notch-лигандов JAG1, DLL4, Notch- генов-мишеней HES1, HEY1 (рис. 25). 79 Рисунок 25 – Уровень экспрессии основных рецепторов Notch и мишеней в мезенхимных клетках сердца, от пациентов с дефектом межжелудочковой перегородки (ДМЖП) и с тетрадой Фалло (ТФ). Вертикальная ось представляет относительное содержание мРНК. Группы сравниваются с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни; горизонтальные линии представляют медиану Экспрессия NOTCH4 и DLL4 была снижена в клетках ТФ по сравнению с клетками ДМЖП, тогда как экспрессия NOTCH2, NOTCH3, JAG1 была увеличена, также как экспрессия транскрипционных генов- мишеней Notch HES1, HEY1. Таким образом, наши данные показывают нарушения в Notch сигналинге в МКС у пациентов с ТФ. Для оценки общего уровня активации передачи сигналов Notch в МКС у пациентов с ТФ мы оценили корреляции между генами-мишенями Notch и NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 (рис.26). Мы нашли корреляции между уровнями NOTCH1 и их целевыми генами HES1, HEY1; уровень NOTCH3 коррелирует с HES1. Это говорит о том, что NOTCH1 и NOTCH3, скорее всего, связаны с повышенным уровнем передачи сигналов Notch, который реализуется повышением уровня экспрессии HES1, HEY1 в МКС ТФ. Мы не 80 обнаружили каких-либо ассоциаций высокого/низкого Notch ни с какими клиническими показателями, в т.ч. с возрастом пациентов. Рисунок 26 – Анализ корреляции между экспрессией генов Notch и генов, являющихся транскрипционнами мишенями Notch (HES1, HEY1) в мезенхимных клетках сердца, полученных у пациентов с ТФ 3.2.2 Пролиферативная активность мезенхимных клеток сердца 3.2.2.1 Связь уровня пролиферативной активности мезенхимных клеток сердца с возрастом Следующим шагом выполнялось определение связи возраста пациентов с ТФ с пролиферативной активностью (ПА) МКС, полученных 81 от 16 пациентов из разных возрастных групп. На рисунке 27 представлен график распределения пациентов по возрасту. Рисунке 27 – Распределение пациентов по возрасту. Номерами обозначены образцы, которые участвовали в эксперименте по определению уровня пролиферативной активности. Цвет обозначений соответствует возрасту На рисунке 28 представлен график пролиферативной активности МКС. Кривые роста обозначены цветами, соответствующими группам распределения по возрасту на рисунке 27. 82 Рисунок 28 – Кривые роста, отражающие пролиферативную активность МКС Нами не было выявлено ассоциации между возрастом и уровнем пролиферативной активности МКС пациентов (рис. 28). Также в нашей работе определялась связь клинических данных с пролиферативной активностью МКС. Нами не было установлено связи пролиферативной активности этих клеток ни с одним из клинических параметров (уровень сатурации, выраженность гипертрофии ПЖ). 3.2.2.2 Связь уровня пролиферативной активности мезенхимных клеток сердца с уровнем активности NOTCH сигнального пути После того, как не было получено связи ПА с возрастом, была сформирована гипотеза, что уровень ПА клеток может быть связан с уровнем активности Notch сигнального пути. Для определения уровня 83 активности Notch сигналинга у пациентов с ТФ были оценены уровни экспрессии двух генов - HEY1 и HES1. Белки, кодирующие эти гены, являются генами-мишенями и важными составляющими Notch сигналинга. На рисунке 29 представлены уровни экспрессии этих генов. Рисунок 29 – Экспрессия генов HEY1 и HES1. Горизонтальной линией обозначена медиана При анализе корреляционной взаимосвязи HEY1 и HES1, нами было обнаружено наличие значимой взаимосвязи между этими параметрами (рис. 30). Рисунок 30 – Корреляционная взаимосвязь уровней экспрессии HES1 и HEY1 (r – коэффициент корреляции Спирмена) 84 В дальнейшем, после того, как было установлено, что уровни экспрессии генов этих двух компонентов коррелируют между собой, были взяты образцы с высокими и низкими уровнями экспрессии обоих генов (рис. 31). Рисунок 31 – Уровни экспрессии генов HEY1 и HES1. На графиках обозначены номера образцов с высоким и с низким уровнями экспрессии, красным и синим цветом соответственно На рисунке 32 представлен график пролиферативной активности МКС. Кривые роста обозначены цветами, соответствующие группам распределения по уровню экспрессии HEY1 и HES1 на рисунке 31. 85 Рисунок 32 – Кривые роста, отражающие пролиферативную активность МКС. р демонстрирует статистическое различие при сравнении клеточных индексов между группами с «низким уровнем» (синий цвет) и «высоким уровнем» (красный цвет) экспрессии HEY1 и HES1 В результате была установлена прямая связь между активностью Notch сигнального пути и активностью пролиферации (p<0,01). Также проверялось наличие корреляции между уровнем экспрессии HEY1 и пролиферативной активностью МКС через 24, 48 и 72 часа. Корреляция была выявлена только через 72 часа эксперимента (рис. 33). 86 Рисунок 33 – Корреляционная взаимосвязь уровней экспрессии HEY1 и пролиферативной активности, выраженной в виде клеточного индекса (r – коэффициент корреляции Спирмена) Таким образом, не установлена взаимосвязь возраста пациентов с уровнем пролиферацией мезенхимных клеток сердца, однако обнаружена ассоциация уровня активности Notch сигнального пути с уровнем пролиферацией этих клеток. |