№6 АНТАГОНИЗМ МИКРОБОВ И АНТИБИОТИКИ.. Формы, биологическое значение и методы выявления антагонизма у микробов
 Скачать 59.44 Kb.
|
Микробный антагонизм (от греч. antagonizomai — борюсь, соперничаю), при котором один вид микробов угнетает развитие других, довольно широко распространен в природе. Антагонистические отношения между микроорганизмами выработались на протяжении длительного периода эволюции в борьбе за существование. Такие взаимоотношения особенно выражены у микроорганизмов, которые конкурируют с другими видами в местах естественного обитания. Например, в почве находится множество различных видов микроорганизмов, многие из которых выделяют вещества, губительно действующие на другие виды микробов. Эти вещества назвали антибиотиками (от греч. anti — против, bios — жизнь). В настоящее время их широко используют для лечения инфекционных заболеваний человека, животных и растений. Открытие, изучение и использование антибиотиков является одним из выдающихся достижений нашего времени. Антибиотические вещества можно не только получить в результате жизнедеятельности микроорганизмов, но и выделить из тканей животных, растений. Поэтому в настоящее время антибиотиками называют продукты обмена любых организмов, способные избирательно убивать микроорганизмы или подавлять их рост. С открытием противоопухолевых антибиотиков сфера их применения расширилась: появились антибиотики, задерживающие рост новообразований. Антагонизм микробов может выявиться при совместном выращивании двух и более видов микробов на жидкой или твердой среде. В опытах на жидкой среде антагонистическая активность определяется по изменению числа жизнеспособных клеток и популяциях конкурирующих видов за определенное время инкубации. Число колоний тест-микроба, приходящееся по истечении определенного времени на 100 колоний штамма-антагониста, называют антибиотическим индексом. Более прост и нагляден метод посева на поверхность плотной питательной среды. Испытуемый микроб засевают в центр чашки Петри или в канавку по ее диаметру, а вокруг него засевают тест-микробы разных видов (рис. 1 и 2). Этот метод широко применяют при изыскании новых антибиотиков. Антибиотик диффундирует в среду, подавляя в более или менее обширной зоне рост чувствительного микроба. Такой метод позволяет одновременно выявить и направленность антагонизма, и количество продуцируемого препарата.
Бактериоцины – это вещества белковой природы или представленные белком в комплексе с липополисахаридами, но в любом случае за антибактериальную активность бактериоцина отвечает белок. Бактериоцины различаются не только по спектру действия, но и по физико-химическим, морфологическим и некоторым другим свойствам. 1) с низкой молекулярной массой, не осаждаются при ультрацентрифугировании, чувствительны к протеолитическому ферменту трипсину, термостабильны и неразличимы в электронном микроскопе; 2) с высокой молекулярной массой, которые легко осаждаются при ультрацентрифугировании, резистентны к ферменту трипсину, термолабильны, выявляются в электронном микроскопе как фагоподобные структуры или их компоненты; 3) бактериоцины, для которых четко показана ферментативная активность. По механизму действия на бактериальную клетку бактериоцины подразделяют на 4 основные группы:
Антагонизм как форма конкурентных взаимоотношений может возникать: • при совместном развитии микроорганизмов разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. Активно размножающиеся клетки первыми поглощают питательные вещества и занимают пространство. Например, флуоресцирующие псевдомонады за счет синтеза сидерофоров поглощают ионы железа, тем самым ограничивая рост других бактерий; • образовании микроорганизмами веществ, которые изменяют среду, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. Характерным примером являются взаимоотношения между молочнокислыми и гнилостными бактериями в молоке. Сущность «пассивного» антагонизма состоит в том, что угнетение роста одного вида микроорганизмов другим может происходить только при определенных, иногда крайне ограниченных условиях развития этих организмов. Такие условия обычно наблюдаются при лабораторном культивировании микроорганизмов. В обычных естественных условиях роста подобного проявления антагонизма, как правило, не бывает. При «активном» антагонизме угнетение роста или полное подавление жизнедеятельности одного вида микроба другим происходит в результате обогащения окружающей среды продуктами обмена, выделяемыми организмами при развитии. Однако при определенных концентрациях этих продуктов метаболизма организмы, их продуцирующие, могут развиваться свободно.
Чаще всего их классифицируют по спектру действия на различные микроорганизмы/Различают: 1) антибиотики, активные в отношении грамположительных микроорганизмов (группа пенициллинов и макролиды — эритромицин и олеандомицин); 2) антибиотики с широким спектром действия (ампициллин, левомицетин, тетрациклины, стрептомицин, аминогликозиды); 3) антибиотики с противогрибковым действием (нистатин, леворин, гризеофульвин); 4) противоопухолевые антибиотики. По способу получения их делят на:
полусинтетические (на начальном этапе получают естественным путем, затем синтез ведут искусственно). В зависимости от источника получения различают шесть групп антибиотиков:
С учетом механизма действия антибиотики разделяют на три основные группы:
1) Бактерицидный механизм - полное подавление роста бактерий посредством действия на жизненноважные клеточные структуры микроорганизмов, следовательно, вызывают их необратимую гибель. Их называют бактерицидными, они уничтожают микробов. Таким образом могут действовать, к примеру, пенициллин, цефалексин, гентамицин. Эффект от бактерицидного препарата наступит быстрее. 2) Бактериостатический механизм - препятствие размножения бактерий, тормозится рост колоний микробов, а губительное действие на них оказывает уже сам организм, точнее, клетки иммунной системы - лейкоциты. Так действует эритромицин, тетрациклин, левомицетин. Если не выдержать полный курс лечения и рано прекратить прием бактериостатического антибиотика, симптомы заболевания вернутся. Антибиотики подавляют рост чувствительных к ним микроорганизмов, ингибируя функции макромолекул необходимых для жизнедеятельности клетки, таких как ферменты или нуклеиновые кислоты. Молекула антибиотика связывается со специфическим участком макромолекулы-мишени, образуя нефункциональный молекулярный комплекс. Чтобы определить механизм действия антибиотика, нужно выявить макромолекулу-мишень и установить ее функции. Обычно легче выяснить, какая функция нарушена, чем определить, какая макромолекула является мишенью. Поэтому мы говорим, что антибиотики подавляют синтез клеточной стенки, белка или РНК, репликацию ДНК или функционирование мембран, в зависимости от того, что является первичным эффектом антибиотика. Некоторые антибиотики представляют собой антиметаболиты, действующие по типу конкурентных ингибиторов. По структуре они близки к норрмальным метаболитам, таким как аминокислоты или коферменты и, связываясь с ферментом, для которого нормальный метаболит является субстратом пли кофактором, инактивируют его. Избирательность действия антибиотиков и, следовательно, причина подавления роста только определенных типов клеток обычно связаны с механизмом их действия.
По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две группы: узкого и широкого спектра действия. К антибиоти кам узкого спектра относится бензилпенициллин, ока зывающий губительное действие только на гноеродные кокки, некоторые грамположительные бактерии и спирохеты. В эту же группу входят полиеновые антибиотики нистатин, леворин, амфотерицин В, обладающие антимикробным действием только в отношении некоторых грибов и простейших. Антибиотики с широким спектром действия обла дают антибактериальной активностью в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий. Некоторые из них эффективны в отношении риккетсий, хламидий, микоплазм и др. К антибиотикам широкого спектра действия относятся цефалоспорины 3-го поколения, тетрациклины, левомицетин, аминогликозиды, макролиды, рифампицин.
Чтобы быть хорошим лечебным средством, антибиотик должен иметь, по крайней мере, некоторые обязательные свойства. 1. При низкой концентрации (10-30 мкг /мл) он должен убивать возбудителя болезни или подавлять его рост и размножение. 2. Активность антибиотика не должна существенно снижаться под действием жидкостей организма. 3. Он должен быстро воздействовать на микроорганизм, чтобы за короткий срок прервать его жизненный цикл. 4. Антибиотик не должен вредить макроорганизму. Аллергенность и токсичность и после введения разовой дозы, и после многократного введения должны отсутствовать. 5. Антибиотик не должен препятствовать процессу выздоровления. 6. Антибиотик не должен снижать и тем более подавлять иммунологические реакции. Он не должен наносить никакого ущерба иммунной системе организма. 3. Группа пенициллинов. Классификация. Особенности фармакокинетики. Показания к применению, побочные эффекты и противопоказания. Меры профилактики и лечения осложнений.
Способы получения антибиотиков: • биосинтетические (природные) антибиотики, их продуцентами выступают специальные штаммы микроорганизмов; • полусинтетические антибиотики, получаемые химическим соединением природного антибиотика, точнее его «ядра», с различными химическими радикалами (при этом возможно направленное создание препаратов с заданными свойствами); • синтетические антибиотики, источник их получения — химический синтез, возможный после определения структуры природных препаратов (например, синтетическим путём получают левомицетин). 1-ая группа — здесь для получения антибиотика используются грибы группы пенициллин. 2-ая группа бактерий актиномицетов, отличающихся тем, что продуцируют на своей поверхности структуры подобные грибному мицелию. В основном для этого используют Стрептомицес. Из них производят большую часть всех антибиотиков. Это такие распространенные антибиотики как:
3-ья группа антибиотиков производящихся из бактерий, таких как Бацилус. Из них получают такие антибактериальные вещества, которые способны разрушать оболочку патогенной бактериальной клетки — это бацитрацин, полимиксины и другие подобные. 4-ая группа — это антибиотики, производимые различными животными, например, лизоцим, продуцируемый многими железами живых организмов, способствующий естественному заживлению поверхностных ран на коже. 5-ая группа антибиотических веществ, производимых растениями. Например, часто применяемый фитонцид, известный как растительный антибиотик, содержащийся в луке и чесноке. Получить и выделить это вещество в чистом виде, практически, невозможно из-за крайне нестойкой структуры. Поэтому применяют медикаментозные средства, изготовленные непосредственно перед употреблением, это например настои, отвары из чабреца, шалфея, ромашки, календулы и других. 6-ая группа химически синтезированных антибактериальных препаратов.
Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микроорганизмов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций стандартного образца фармакопейного качества(*) и испытуемого препарата. Метод основан на логарифмической зависимости размеров зон угнетения роста тест-микроорганизмов от концентрации антибиотика, зависимость должны быть линейной
Антибиотики используются для предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. По влиянию на бактериальные организмы различают бактерицидные (убивающие бактерий, например, за счёт разрушения их внешней мембраны) и бактериостатические (угнетающие размножение микроорганизма) антибиотики. §Другие области применения Некоторые антибиотики обладают также дополнительными ценными свойствами, не связанными с их антибактериальной активностью, а имеющими отношение к их влиянию на макроорганизм.
Химиотерапия – уничтожение возбудителей заболеваний в организме животных с помощью химических веществ. Химиотерапевтические вещества - это вещества, использующиеся для уничтожения возбудителей заболеваний, находящихся в организме животных.
Профилактика развития осложнений состоит, прежде всего, в соблюдении принципов рациональной антибиотикотерапии (антимик робной химиотерапии): • Микробиологический принцип. До назна чения препарата следует установить возбу дителя инфекции и определить его индиви дуальную чувствительность к антимикроб ным химиотерапевтическим препаратам. По результатам антибиотикограммы больному назначают препарат узкого спектра дейс твия, обладающий наиболее выраженной активностью в отношении конкретного воз будителя, в дозе, в 2—3 раза превышающей минимальную ингибирующую концентра цию. Если возбудитель пока неизвестен, то обычно назначают препараты более широ кого спектра, активные в отношении всех возможных микробов, наиболее часто вы зывающих данную патологию. Коррекцию лечения проводят с учетом результатов бактериологического исследования и опреде ления индивидуальной чувствительности конкретного возбудителя (обычно через 2-3 дня). Начинать лечение инфекции нужно как можно раньше (во-первых, в начале за болевания микробов в организме меньше, во-вторых, препараты активнее действуют на растущих и размножающихся микробов). • Фармакологический принцип. Учитывают особенности препарата — его фармакокинетику и фармакодинамику, распределение в организме, кратность введения, возможность сочетания препаратов и т. п. Дозы препаратов должны быть достаточными для того, чтобы обеспечить в биологических жидкостях и тка нях микробостатические или микробоцидные концентрации. Необходимо представлять оп тимальную продолжительность лечения, так как клиническое улучшение не является основанием для отмены препарата, потому что в организме могут сохраняться возбудители и может быть рецидив болезни. Учитывают также оптимальные пути введения препарата, так как многие антибиотики плохо всасываются из ЖКТ или не проникают через гематоэнцефалический барьер. • Клинический принцип. При назначении пре парата учитывают, насколько безопасным он бу дет для данного пациента, что зависит от ин дивидуальных особенностей состояния больного (тяжесть инфекции, иммунный статус, пол, на личие беременности, возраст, состояние функции печени и почек, сопутствующие заболевания и т.п.) При тяжелых, угрожающих жизни инфекциях особое значение имеет своевременная антибиотикотерапия. Таким пациентам назначают комбинации из двух-трех препаратов, чтобы обес печить максимально широкий спектр действия. При назначении комбинации из нескольких пре паратов следует знать, насколько эффективным против возбудителя и безопасным для пациента будет сочетание данных препаратов, т. е. чтобы не было антагонизма лекарственных средств в отно шении антибактериальной активности и не было суммирования их токсических эффектов. • Эпидемиологический принцип. Выбор пре парата, особенно для стационарного больно го, должен учитывать состояние резистент ности микробных штаммов, циркулирующих в данном отделении, стационаре и даже ре гионе. Следует помнить, что антибиотикорезистентность может не только приобретаться, но и теряться, при этом восстанавливается природная чувствительность микроорганизма к препарату. Не изменяется только природная устойчивость. • Фармацевтический принцип. Необходимо учитывать срок годности и соблюдать правила хранения препарата, так как при нарушении этих правил антибиотик может не только по терять свою активность, но и стать токсич ным за счет деградации. Немаловажна также и стоимость препарата. Для того чтобы избежать негативных последствий антибиотикотерапии, необходимо строгого соблюдать правила назначения препаратов. 1. Проводить лечение антибиотиками по строгим показаниям. 2. Выбор антибиотика осуществлять, основываться на результатах исследования чувствительности микрофлоры. 3. Воизбежании аллергической реакции, необходимо выявить аллергическую предрасположенность к нему организма (либо из анамнеза лечения больного антибиотиками, либо проведя пробу на переносимость - внутрикожное введение раствора антибиотика в малой дозе) 4. Назначать антибиотики в оптимальных дозах, строго соблюдая разовую и суточную дозировку препарата; 5. Соблюдать кратность введения в течение суток для поддержания необходимой постоянной концентрации препарата в плазме крови. 6. При одновременном применении нескольких антибиотиков следует учитывать возможность их взаимодействия (синергизм, антагонизм, индифферентность, образование токсических комплексов). Не назначать лечение сочетанием антибиотиков одной группы. 7. Использовать оптимальный путь введения антибиотиков. 8. Не проводить коротких или длительных курсов антибиотикотерапии, при отсутствии эффекта производить своевременную замену одного вида антибиотика (или их сочетаний) на другой; 9. Помнить о возможности развития побочных действий и своевременно прекращать лечение при появлении их симптомов. 10. При проведении длительного лечения, профилактически назначать противогрибковые препараты.
Осложнения антибиотикотерапии При проведении антибиотикотерапии можно столкнуться со следующими осложнениями. 1. аллергические реакции, 2. токсическое действие на организм больного. 3. дисбактериоз. 4. формирование устойчивых штаммов микроорганизмов. Аллергические реакции.Большое количество аллергических осложнений обусловлено тем, что антибиотики являются препаратами биологического происхождения, поэтому могут вызывать сенсибилизацию. В клинической практике наиболее часто встречаются следующие аллергические осложнения - аллергическая сыпь (крапивница), отек Квинке, анафилактический шок. Применяя антибиотики, всегда следует помнить о возможности развития аллергической реакции, которая в крайних случаях может привести к смерти больного. Основные осложнения антибиотикотерапии следующие: Токсическое действие на организм больного.Многие антибиотики обладают токсическим действием. Выделяют ото- , нефро- , гемато- , нейротоксичные и т. д. Чаще токсическое действие проявляется при использовании антибиотиков длительное время, в больших дозах, без учета сопутствующей патологии у больного. Дисбактериоз.Наблюдается при длительном применении больших доз антибиотиков широкого спектра действия. Чаще развивается у детей. Формирование устойчивых штаммов микроорганизмов.Устойчивые штаммы чаще формируются в случаях, когда нарушается дозировка и кратность введения препаратов. Недостаточная концентрация антибиотика в крови дает возможность микроорганизмам выработать механизм резистентности. В таких случаях последующее лечение антибиотиками может быть неэффективным.
Антибиотикорезистентность — это устойчи вость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистент ными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной. Природная устойчивость.Некоторые виды микробов природно ус тойчивы к определенным семействам антиби отиков или в результате отсутствия соответс твующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувстви тельны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (на пример, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соеди нений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры). Приобретенная устойчивость.Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех анти биотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микро бы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистен тности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множес твенная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность). Генетические основы приобретенной резис тентности.Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в попу ляции бактерий в результате: • мутаций в хромосоме бактериальной клеткиспоследующей селекцией(т. е. отбором)му тантов.Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, ко торые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения анти биотика, т. е. сам препарат не влияет на час тоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя ре зистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (се рия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного пневмококка); • переноса трансмиссивных плазмид резис тентности (R-плазмид).Плазмиды резистен тности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описа на японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться меж ду бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространенауграмотрицательных бактерий и встречаетсяукишечной палочки и других кишечных бак терий, а также у гонококка, резистентногокпенициллину, и гемофильной палочки, резис тентной к ампициллину; • переноса транспозонов, несущихr-гены(или мигрирующих генетических последова тельностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться да лее дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам. Реализация приобретенной устойчивости.Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и прой ти сквозь ее оболочку, затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего пре парат взаимодействует с внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной ле карственной устойчивости возможна на каж дом из следующих этапов: • модификация мишени.Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко сни жается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен дейс твию данного препарата. • «недоступность» мишениза счет сниже нияпроницаемостиклеточной стенки и кле точных мембран или«эффлюко-механизма,когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик. • инактивация препарата бактериальными ферментами.Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые де лают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы — это ферменты, разруша ющие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосо мы, так и в составе плазмиды. Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества — ин гибиторы (например, клавулановую кисло ту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушитель ное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином. Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически не возможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и рас пространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показа ниям, избегать их использования с профи лактической целью, через 10—15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по воз можности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использо вать их как фактор роста).
Существуют две модификации метода серийных разведений – определения чувствительности на жидком и густом питательных средах. Метод дает возможность определить МПК препарата для выделенного штамма возбудителя. Для определения антибиотикочутливости по методу серийных разведений в жидкой питательной среде готовят ряд (8-10 и больше) пробирок с двукратными последовательными разведениями препарата. Среду предварительно разливают в пробирки по 2 мл. В первую добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают и переносят к следующей пробирке, продолжая разведение к предпоследней, из которой удаляют 2 мл смеси. Последняя пробирка служит контролем роста культуры. В том же бульйони, который используют для разведения антибиотиков, готовят суспензию суточной агаровой или бульйоннои культуры бактерий из расчета 105-106 микробных тел в 1 мл в зависимости от вида возбудителя. Потом к каждой пробирке с разведениями, а также к контрольной добавляют по 0,2 мл изготовленной суспензии. При определении чувствительности к пеницилинив пеницилиназоутворюючих стафилококков рекомендуют использовать одновременно большую и малую микробную нагрузку (100, 100000 и выше микробных тел в 1 мл). В зависимости от величины посевной дозы значения МПК препарата может колебаться: при увеличении дозы чувствительность снижается за счет роста количества пеницилинази, что образуется в среде. Пробирки инкубируют в термостате при 37 °С в течение 18-24 год. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутствие роста в среде с разными разведениями препарата. Последняя пробирка, в которой наблюдают задержку роста культуры (прозрачный бульйон), отвечает МПК (минимальной подавляющей концентрации) или МБсК (минимальной бактериостатическойконцентрации) препарата относительно данного микроба и указывает на степень его чувствительности. Если признаки роста появляются во всех пробирках, исследуемый штамм резистентный к максимальной концентрации препарата, которая была взята в опыт. Отсутствие роста бактерий во всех пробирках, кроме контрольной, свидетельствует, что МПК препарата ниже, чем и, что используется в опыте. Для определения бактерицидного эффекта антибиотика из нескольких последних пробирок, в которых нет признаков роста, делают висел на секторы агара в чашках Петри. Через 24-48 год инкубации при оптимальной температуре отмечают ту наименьшую концентрацию препарата в пробирке, занял из которой Принцип метода серийных разведений в плотной питательной среде аналогичен предыдущему. Для этого готовят серию разведений антибиотика в агаре, добавляя один объем, который содержит определенное количество препарата до 9 объемов агара. Для этого удобно разлить агар во флаконы или широкие пробирки по 13,5 мл. Перед постановкой агар расплавляют на водяной бане и после охлаждения до 60-65 °С в каждую пробирку добавляют 1,5 мл соответствующего разведения антибиотика (в бульйоне), тщательным образом перемешивают и выливают в чашку Петри. В контрольную пробирку с агаром вместо раствора антибиотика вносят 1,5 мл дистиллированной воды. Чашку разделяют на секторы, на каждый из которых засевают исследуемый штамм. Посевы делают бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Для посева удобно использовать специальный штамп-репликатор, который позволяет нанести одновременно на поверхность агара 25-50 исследуемых культур. Результаты учитывают после 18-24 год инкубации в термостате при оптимальной температуре. За МПК (минимальную подавляющую концентрацию) антибиотика для данного штамма принимают ту, при которой отсутствуют признаки роста колоний на поверхности агара (или вместо бляшки есть рост одиночных колоний). Из двух способов определения антибиотикочутливости микробов до антибиотиков (разведений в густой и жидкой средах) точнее является метод серийных разведений в жидкой среде. Результаты, которые получают с помощью разведений в агаре, менее постоянны. Метод не следует применять при оценке чувствительности тех микробов, которые дают тонкий, разрежен рост на поверхности чашки (стрептококки, пневмококки) или, напротив, имеют тенденцию к ползучему росту (протей). Недостатком методов серийных разведений является их высокая трудоємнисть, что ограничивает использование в обычных бактериологических лабораториях. С целью упрощение было предложено модификацию метода с заменой ряда из 10 пробирок, которые содержат разные количества препарата, тремя концентрациями антибиотика. Первая из них отвечает максимальной, что находится в крови при введении терапевтических доз, вторая – уровню, который наблюдается через Т1/2 (время снижения концентрации антибиотика на 50 %). Третья является минимальной, то есть той, которая равняется МПК для высокочувствительных штаммов. В соответствии с использованными концентрациями антибиотиков исследуемые штаммы можно отнести за уровнем чувствительности до трех основных групп: резистентные (МПК для которых превышает значение максимальной концентрации антибиотика в крови), умеренно чувствительные (значения МПК приближаются к максимальной или средней концентрации) и высокочувствительные (чувствительность которых к антибиотику находится на уровне минимальной концентрации, которая используется в опыте). Такими концентрациями при определении чувствительности к бензилпеницилину является соответственно 0,05-0,2, 0,5 и 2,0 ОД/МЛ, к макролидам – 0,1, 0,5-1,0 и 4,0 мкг/мл, к аминогликозидив – 0,5-1,0, 6,0-8,0 и 15,0-20,0 мкг/мл. Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Используя обычные методы, ответ может быть получен через 18-20 год от начала исследования, не учитывая этапов выделения чистой культуры. Это приводит к тому, что в большинстве случаев особенно при затяжном и тяжелом течении болезни, лечение антибиотиками начинают задолго до получения данных лабораторного обследования. В зависимости от принципов, на которых они базируются, ускоренные методы предусматривают: • определение изменений ферментативнои активности микроорганизмов под воздействием антибиотиков; • определение цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно восстановительного потенциала во время роста бактерий в питательной среде; • цитологичну оценку изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков. К первой группе принадлежит метод Роджерса, ориентированный на способность антибиотиков подавлять ферментативну активность чувствительных микроорганизмов, которая сопровождается изменением цвета соответствующего индикатора. Суть его заключается в дифференцированном изменении красного цвета фенолового красного на желтый или фиолетовый в зависимости от чувствительности исследуемого штамма. В случае чувствительности к действию антибиотика не происходит разложение глюкозы при культивировании в среде, которое содержит ее и определены концентрации препарата. При этом среда окрашивается в фиолетовый цвет в результате сдвига рН в щелочную сторону. Изменение красного цвета на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, резистентного к действию антибиотика. Если к среде прибавить 0,25 % дрожжевого экстракта, результаты могут быть учтенными уже через 2-2,5 год от начала исследования. Следующая группа методов регистрирует изменения окислительно восстановительного потенциала среды в процессе роста микроорганизмов, о чем свидетельствует изменение цвета резазурина,1,3,5-трифенилтетразолия хлорида, 2,6-дихлорфенолиндофенола и других, которые добавляются к среде. Этот метод технически простой, а результаты получают через 2-6 год. Принцип его сводится к тому, который растоплен и охлажден до 50 °С агар засевают исследуемой культурой бактерий из расчета 200 млн. микробных тел, а на поверхность налагают диски с антибиотиками. Чашки инкубируют при оптимальной температуре в течение 3-5 год, потом обрабатывают индикатором и повторно инкубируют при 37 °С в течение 20-30 хв. Результаты учитывают за изменением цвета вокруг дисков с антибиотиками. Если используют 1 % раствор 1,3,5-трифенилтетразолия хлорида, участка агара с бактериальным ростом в результате образования формазану приобретают красный цвет, а зоны притеснения роста вокруг дисков остаются бесцветными. Судить о степени чувствительности микробов к антибиотикам можно с такой же точностью, как и с помощью стандартного метода дисков, однако время исследования уменьшается до 3-5 год. Образование инволюционных форм бактерий под воздействием антибиотиков исследуют под фазово-контрастным или антоптральним микроскопом в специальных микрокапсулах. Они образуются в результате действия бактериостатичних концентраций препарата. Под воздействием суббактериостатичних концентраций, а также при резистентности исследуемого штамма на поверхности агара вырастают нормальные микроколонии. Метод может быть применен для определения чувствительности штаммов кишечной палочки, стафилококков, холерных вибрионов. Полученные даны в большинстве случаев совпадают с теми, которые дают классические методы. За последние годы разработаны многочисленные модификации метода серийных разведений в питательных бульйонах. В частности, экспресс-методы с титрованием антибиотика в объеме 0,25 мл. Выпускаются коммерческие наборы длительного хранения, которые состоят из планшетов из лиофильно высушенными разведениями антибиотика, куда вносится по 0,1 мл суспензии чистой культуры микроорганизмов. Результаты определения антибиотикочутливости можно оценивать визуально (при наличии в среде индикатора) или с помощью спектрофотометров, когда регистрируется изменение оптической плотности среды. Определять чувствительность бактерий к антибиотикам можно и с помощью автоматизированных микробиологических систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2, Sceptor и др.). При их использовании результаты получают уже через 3-10 год. Одно из их преимуществ заключается в том, что они позволяют получать результаты одновременно до 18-20 антибиотиков. Эти методы широко используют в микробиологических лабораториях, они хорошо коррелируют с другими методиками и за их помощью можно не только выбирать рациональную схему антибиотикотерапии, но и проводить эпидемиологический контроль резистентности. Однако при пользовании такими автоматизированными системами частота выявления резистентных штаммов может быть снижена в результате медленного роста устойчивых вариантов. В большинстве подобных систем результаты учитывают путем сравнения роста (или гибели) бактериальных клеток в присутствии антибиотиков с контролем, где есть только микробы. При этих условиях достаточно трудно дифференцировать клетки, которые погибают, от тех, что медленно размножаются. К другим факторам, которые влияют на результаты, принадлежит действие субингибиторних концентраций препаратов на ультраструктуру бактериальных клеток. Они приводят к изменению формы, набухания клеток, которое может сопровождаться изменением оптической плотности суспензии и искажением результатов. В свою очередь, это дает неправильную информацию о чувствительности возбудителей. Таким образом, применение любого метода позволяет определить антибиотикограму возбудителя – спектр его чувствительности и антибиотикостийкости. Все методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам имеют свои преимущества и свои недостатки. Потому постоянный контроль за объективностью результатов и соблюдением правил проведения исследований способствуют получению достоверных данных. В большинстве случаев результаты определения антибиотикоустойчивости in vitro совпадают с клиническими последствиями антибиотикотерапии. Случаи разногласия объясняются рядом причин, среди которых чаще всего встречается ошибочная трактовка полученных лабораторных данных. Причиной таких ситуаций может быть использование при посеве не чистой культуры бактерий, а патологического материала. Потому определяется не чувствительность инфекционного агента, а микробной ассоциации, в том числе и сапрофитной флоры. Ошибки встречаются при исследовании содержания двенадцатиперстной кишки, фекалиий, харкотиння, выделений из ран, мочи и тому подобное. Плазмиды делают бактерии нечувствительными к подавляющему большинству антибиотиков, которые используются в клиниках, поскольку кодируют синтез ферментов, которые разрушают препараты. Одним из наиболее исследованных ферментов является бета-лактамаза, которая разрушает антибиотики, которые принадлежат к группе бета-лактамив. Разработано несколько методических приемов, которые позволяют быстро определить ее активность. Один из них заключается в том, что на фильтровальную бумагу размером 2х2 см, который находится в чашке Петри, капают одну каплю 2 % водного раствора крахмала. Потом на эту бумагу наносят петлей агаровую культуру микробов и растирают ее, формируя бляшку диаметром до 5 мм. На ее поверхность наносят рабочий йодный раствор пенициллина. Учет результатов проводят через 10 минут инкубации системы при комнатной температуре. При наличии бета-лактамазы на темно-синем фоне наблюдается ярко выраженная четкая зона просветления вокруг бляшки, которая содержит агаровую культуру микробов. При негативном результате зона просветления отсутствует, а края бляшки нечетки.
Минимальная ингибирующая (биостатическая, подавляющая) концентрация (МИК, МПК) - минимальная концентрация химиотерапевтического или антисептического вещества, вызывающая полноеподавление заметного невооруженным глазом роста данного микроорганизма на средах в стандартныхусловиях опыта. Измеряют в мкг/мл или в ед. действия (ME, ЕД). Устанавливают посевом иссл. к-ры наплотные или жидкие среды, содержащие различные концентрации препарата. Применяют в химиотерапии иантисептике для выбора эффективных у данного б-ного препаратов и их доз.
Эти методы используют для определения биологической активности антибиотиков и их концентрации в тканях макроорганизма. На практике используют два метода. Метод серийных разведений. Готовят ряд разведений эталонного антибиотика на жидкой питательной среде и параллельно исследуемый материал. Во все пробирки вносят тестовый микроорганизм в определенной концентрации. Учитывают результаты по помутнению среды. Определяют концентрацию антибиотика умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост. Метод диффузии в агар. Этот метод точнее, чем метод серийных разведений и чаще используется на практике. Готовят чашку Петри с двумя слоями агара. Первый слой - голодный агар, второй слой состоит из агара в смеси с тест-культурой. После застывания второго слоя агара на его поверхности делают 6 лунок. В половину из них вносят разведения испытуемого раствора, а в остальные – стандартный раствор. Пробы для повышения точности дублируют. Размеры зон задержки роста тест-культуры после инкубации измеряют и производят расчет активности (концентрации) антибиотиков с использованием расчетных таблиц или стандартных кривых. |