Идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса
 Скачать 0.91 Mb.
|
|
Рисунок 6. Бороздчатый стебель Cannabis sativa © Federal Criminal Police, Brazil © Federal Criminal Police, Brazil Рисунок 7. Абаксиальная (слева) и адаксиальная (справа) поверхность листьев Cannabis sativa Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 31 Каждый тычиночный (мужской) цветок состоит из пяти светло-зеленых, покры- тых небольшими волосками чашелистников длиной около 2,5-4 мм с пятью тычин- ками, свисающими вниз на тонких тычиночных нитях. Рисунок 8. Морфологические признаки мужских цветков Sepal Filament Anther Stamen Пестичные (женские) цветки являются в большей или меньшей степени сидя- чими и образуют парные соцветия. Каждый цветок имеет небольшой зеленый прицветник, закрывающий завязь, с двумя длинными тонкими рыльцами, высоко выступающими из кроющего листа. Рисунок 9. Морфологические признаки женского цветка и плода Плод, семянка, содержит только одно семя в твердой оболочке, плотно облега- емое тонкостенной завязью. Семя имеет эллипсоидную форму, слегка сдавлен- ное, гладкое, около 2–5 мм длиной, обычно пятнистое, светло-коричневого цвета. Семя, как правило, считается плодом. Stigma Beaked bract Seed (Achene) © Federal Criminal Police, Brazil Чашелистник Тычиночная нить Пыльник Тычинка Рыльце Прицветник клювообразной формы Тычинка 32 Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 5.3.2 Микроскопические характеристики Растение Cannabis sativa можно идентифицировать по микроскопическим структурам на его поверхности, а именно по трихомам (т. е. похожим на волоски выростам клеток эпидермы растения). Встречаются два вида трихом, которые можно наблюдать при помощи бинокулярного микроскопа с 40-крат- ным увеличением (см. рисунки 10 и 11): а) Нежелезистые трихомы – многочисленные, одноклеточные, жесткие, изо- гнутые волоски с тонким заостренным концом: ț цистолитные трихомы, расположенные на верхней поверхности листьев каннабиса, имеют характерную форму медвежьего когтя и иногда содер- жат кристаллы карбоната кальция (цистолиты), которые можно увидеть у их основания. Трихома, как правило, ломается, высвобождая цистолит; ț нецистолитные трихомы, встречающиеся главным образом на нижней поверхности листьев, прицветников и прицветничков и не имеющие расширяющегося основания; ț характерным признаком каннабиса является одновременное наличие таких когтеобразных трихом на верхней поверхности и острых, тонких нецистолитных трихом на нижней поверхности листьев. Цистолитные трихомы Нецистолитные трихомы Рисунок 10. Изображение нежелезистых трихом под микроскопом [41] b) Железистые трихомы. Встречаются в виде: ț сидячих желез, т. е. трихом без ножки, которые обычно расположены на нижнем эпидермисе; ț небольших луковицеобразных железистых трихом на одноклеточных ножках; ț желез на длинных многоклеточных ножках, расположенных на прицвет- ничках вокруг женских цветков (многоклеточные железистые трихомы на ножках). Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 33 Рисунок 11. Вид железистых трихом под микроскопом [41] Сидячие железы Железистые трихомы на ножках a: цистолитная трихома; b: крупная железистая трихома с головкой и ножкой, состоящими из нескольких клеток; c: головка одной из крупных железистых трихом; d: небольшая железистая трихома с двуклеточной головкой на одноклеточной ножке; e: конусообразные трихомы с толстой оболочкой; f: развивающаяся крупная железистая трихома; g: ножка крупной железистой трихомы; h: клетка палисадной ткани; i: кластерный кристалл; j: клетка паренхимной ткани; k: устьице Рисунок 12. Прицветник плодоносящего растения в поперечном сечении [42] 34 Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса Железистые трихомы представляют собой структуры, в которых вырабатывается и накапливается смола каннабиса. Как правило, они расположены в области со- цветий (причем на женских растениях их образуется особенно много), но могут также встречаться и на нижней поверхности листьев и иногда – на стеблях моло- дых растений. Некоторые растения имеют трихомы, которые ошибочно можно принять за три- хомы Cannabis sativa, поэтому следует внимательно подходить к составлению заключения об идентификации растения. Вместе с тем сочетание цистолитных волосков на верхней поверхности листа с более длинными трихомами и сидя- чими железами на нижней поверхности, встречающееся только у Cannabis sativa, позволяет успешно идентифицировать даже фрагментированный материал. При этом следует отметить, что очень молодые безлистные саженцы и стебли невозможно с точностью идентифицировать как Cannabis sativa путем ботани- ческого исследования. С подробной информацией об идентификации каннабиса и более сложных мето- дах микроскопического исследования можно ознакомиться в других публикациях [43, 44, 45, 46]. 5.4 Химическое исследование 5.4.1 Общие аспекты В свежем растительном материале уровень содержания ТГК обычно невысок, и считается, что он искусственно извлекается из ТГКК при неэнзиматическом декарбоксилировании в процессе хранения и употребления (например, курения) [47]. В методологическом плане необходимо решить, измерять ли ТГКК и ТГК раз- дельно или оценивать “общий уровень ТГК” (т. е. общее количество ТГК и ТГКК). Иногда это определяется в национальном законодательстве. Если же в законодательном порядке не установлено требование применять тот или иной подход, то, как правило, измеряют общий уровень ТГК, поскольку он наилуч- шим образом отражает фармакологическую активность материала. Общий уровень ТГК можно определить путем декарбоксилирования ТГКК в ТГК в ходе анализа или до него. По практическим соображениям рекомендуется второй вариант. Экстракт пробы помещают в открытой стеклянной пробирке в камеру нагрева- ния при температуре 150 о С. После испарения растворителя процесс декарбок- силирования завершается в течение пяти минут. Однако всем лабораториям судебной экспертизы рекомендуется принять меры по утверждению этой процедуры. В некоторых системах ввода проб для газовой хроматографии при вводе проб может происходить полное декарбоксилирование ТГКК, тогда как другие сис- темы ввода проб при той же температуре обеспечивают лишь незначительное Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 35 декарбоксилирование. Предположительно это обусловлено геометрическими характеристиками инжектора. Более высокая температура на вводе также может вызвать распад ТГК в лайнере. Поэтому если декарбоксилирование не осущест- вляется до анализа, то необходимо утвердить данную систему газовой хромато- графии и условия проведения анализа, чтобы убедиться в том, что они обеспе- чивают полное декарбоксилирование ТГКК и не вызывают распада ТГК [48]. 5.4.2 Подготовка проб к химическому исследованию 5.4.2.1 Подготовка растительной массы каннабиса Свежее (невысушенное) растительное сырье сушат либо естественным образом при комнатной температуре в течение нескольких дней, либо при температуре 70 о С до тех пор, пока листья не станут ломкими. На этом этапе содержание влаги в растительном материале обычно составляет 8–13 процентов. Затем отбирают часть высушенного сырья (используют только цветки и листья), измельчают в порошок (желательно высокоскоростным измельчителем, напри- мер, на скорости 100 об./сек.) и просеивают (через сито с отверстиями разме- ром 1 мм)*. 5.4.2.2 Подготовка смолы каннабиса Смолу каннабиса измельчают при помощи терки. Если исследуется липкий мате- риал, то пробу охлаждают жидким азотом и сразу же измельчают в порошок вышеописанным способом. 5.4.2.3 Подготовка масла каннабиса Масло каннабиса можно анализировать без предварительной обработки. 5.4.3 Предварительные методы исследования 5.4.3.1 Тесты на основе цветных реакций Цветные реакции для исследования каннабиса относятся к числу наиболее спец- ифичных цветных реакций (ложноположительные результаты дают лишь некото- рые растения, например лавсония, мускатный орех, мускатник и репешок) [49]. Однако положительный результат такого исследования указывает лишь на воз- можное присутствие содержащего каннабис материала и не достаточен для окон- чательной идентификации каннабиса. Поэтому специалист по анализу обязан подтверждать такие результаты дополнительными, как правило, более селектив- ными методами. Например, для точной идентификации растительного сырья каннабиса лаборатория может применять цветные реакции в сочетании с тонко- * Обратите внимание, что высушивание и просеивание являются частью утвержденных методов, описанных в настоящем руководстве. Просеивание обеспечивает однородность проб. Если этап про- сеивания исключают, лаборатория должна убедиться в том, что однородность проб находится в пре- делах допустимой нормы. 36 Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса слойной хроматографией и микроскопией, при условии что ТСХ выявила нали- чие, по меньшей мере, трех каннабиноидов [50]. Проводящему анализ лицу также настоятельно рекомендуется одновременно про- анализировать контрольную пробу каннабиса (например, эталонный материал, включающий смесь контрольных эталонов, содержащих каннабиноиды) и слепую пробу для проверки результатов анализа, а также функциональности и надеж- ности всех используемых в ходе анализа реактивов. 5.4.3.1.1 Тест с прочным коринфским V На фильтровальной бумаге Реактив А: петролейный эфир Реактив В: прочный коринфский V* 1% в безводном сульфате натрия Реактив С: бикарбонат натрия 1% водный раствор Метод Сложить вчетверо два сложенных вместе листа фильтровальной бумаги и немного отогнуть края так, чтобы образовалась воронка, поместить неболь- шое количество измельченной в порошок пробы в центр верхнего слоя бумаги. Добавить две капли реактива А и дать жидкости проникнуть в нижний слой фильтровальной бумаги. Выбросить верхний лист бумаги, дать высохнуть нижнему листу. Нанести небольшое количество реактива В в центр фильтро- вальной бумаги и добавить две капли реактива С. Результаты Пурпурно-красное пятно в центре фильтровальной бумаги указывает на про- дукт каннабиса. ТГК, КБН и КБД дают такой же оттенок. Имеет практическую ценность при проведении внелабораторных исследова- ний проб материалов разного возраста или происхождения. * Прочный коринфский V = дихлорцинк; 2-метокси-5-метил-4-(4-метил-2- нитрофенил)диазенил-бензолдиазоний; двухлористый = азоидный диазокомпонент 39 = C 15 H 14 N 5 O 3 · 0,5 ZnCl 4 5.4.3.1.2 Тест с прочным синим Б На фильтровальной бумаге Реактив А: петролейный эфир Реактив В: прочный синий Б** 1% разведенный безводным сульфатом натрия Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 37 Реактив С: бикарбонат натрия 10% водный раствор Метод Такая же процедура, как в тесте с прочным коринфским V. Результаты Пурпурно-красное пятно в центре фильтровальной бумаги указывает на продукт каннабиса. Этот цвет образуется в результате смешения цветов, характерных для кан- набиноидов, являющихся основными компонентами каннабиса: ТГК = красный, КБН = пурпурный, КБД = оранжевый. Примечание Прочный синий Б хорошо сохраняется в холодильнике; при комнатной тем- пературе со временем начинает портиться, и порошок отвердевает (особенно в регионах с теплым климатом). **Прочный синий Б = Ди-o-анизидинтетразолия хлорид 5.4.3.1.3 Экспресс-тест Дюкенуа (тест Дюкенуа–Левина) В пробирке Реактив А: уксусный альдегид (А1) ванилин (А2) 0,5 мл (А1) и 0,4 г (А2) в 20 мл этанола Раствор хранить в темном прохладном месте; стано- вится непригоден, когда приобретает темно-желтый цвет Реактив В: концентрированная соляная кислота Реактив С: хлороформ Метод Поместить в пробирку небольшое количество исследуемого материала с 2 мл реактива А и встряхивать в течение одной минуты. Добавить 2 мл реактива В и встряхнуть смесь. Дать отстояться в течение 10 мин. Если появится какой-либо цвет, добавить 2 мл реактива С, осторожно помешивая. Результаты Если нижний слой (хлороформ) приобретает фиолетовый цвет, то это указы- вает на продукт каннабиса. Примечания По степени чувствительности этот тест уступает двум вышеописанным тес- там на фильтровальной бумаге. 38 Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 5.4.3.2 Иммунологический анализ Объектом иммунологического анализа могут быть не только биологические пробы, но и мельчайшие следовые количества наркотических веществ. Тем не менее эти анализы редко используют для целей предварительной идентифика- ции, поскольку они дорогостоящи и обладают не самой высокой степенью точности. 5.4.4 Спектрометрия ионной подвижности (СИП) Наличие ТГК можно установить при помощи спектрометра ионной подвиж- ности. Однако при этом отмечаются проблемы с выделением сигналов героина и влиянием влажности [51]. Поэтому данный метод не является предпочти- тельным. 5.4.5 Тонкослойная хроматография (ТСХ) Существует целый ряд методов ТСХ для качественного и полуколичественного анализа каннабиса, в рамках которых используется разнообразные неподвижные фазы (пластины для ТСХ) и системы растворителей, а также несколько отлича- ющиеся методы подготовки проб и визуального анализа пятен. Многие из этих методов также позволяют получить приемлемые результаты, однако любой новый метод, который планируется применять в той или иной лаборатории, должен быть утвержден и/или опробован до его внедрения в повседневную практику. Описан- ный ниже метод прошел полевые испытания и признан пригодным для целей анализа. Пластина: ВЭТСХ 10 10 см силикагель Система A: петролейный эфир 60/90 диэтиловый эфир в объемном отношении: 80% в объемном отношении: 20% Система B: циклогексан диизопропиловый эфир диэтиламин в объемном отношении: 52% в объемном отношении: 40% в объемном отношении: 8% Система C: (для каннабино- идных кислот) н-гексан диоксан метанол в объемном отношении: 70% в объемном отношении: 20% в объемном отношении: 10% Кондиционирование в камере: 30 мин. с фильтровальной бумагой, закреплен- ной на одной стороне. Подготовка пробы В том случае, если исследование методом ТСХ проводится лишь как качествен- ное исследование (т. е. в подтверждение микро- или макроскопических призна- ков содержания каннабиса в исследуемом материале), гомогенизация раститель- ного сырья не требуется (см. подробную информацию о подготовке проб к химиче- Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса 39 скому исследованию в разделе 5.4.2). Для экстрагирования следует отбирать те части каннабиса, в которых предположительно содержится максимальное коли- чество каннабиноидов (т. е. цветущие верхушки и верхние листья). Достаточным для экстрагирования количеством считается 500 мг растительной массы каннабиса, или 100 мг смолы каннабиса, или 50 мг жидкого каннабиса (масла каннабиса). Схема экстракции должна быть разработана таким образом, чтобы в итоге можно было получить раствор с концентрацией ТГК около 0,5 мг/мл. Данные о средних уровнях содержания ТГК в различных продуктах каннабиса приведены в разделе 3.11. Экстрагирование осуществляется при комнатной температуре в течение 15 минут в 10 мл растворителя путем непрерывного встряхивания или в ультразвуковой ванне. Полученный экстракт фильтруют, после чего его можно использовать в хроматографическом исследовании*. Поскольку каннабиноиды легко растворяются в большинстве органических рас- творителей, для их экстракции в равной степени подходят метанол, петролейный эфир, н-гексан, толуол, хлороформ и смеси растворителей, в частности метанола и хлороформа (в пропорции 9:1). При этом следует иметь в виду, что неполярные растворители, в частности н-гексан и петролейный эфир, позволяют получить относительно чистый экстракт, но при этом количественно будут экстрагированы только нейтральные/свободные каннабиноиды, тогда как другие растворители и их смеси обеспечивают также количественную экстракцию каннабиноидных кислот. Для идентификации достаточно использовать самое простое чистое экстрагиро- вание с помощью петролейного эфира, тогда как для целей количественного определения и оценки общего содержания ТГК следует использовать другие растворители. Стандартные растворы Стандартные растворы приготавливают в концентрации около 0,5 мг каннабино- ида на 1 мл метанола и хранят в темном прохладном месте. Визуализация Перед визуализацией пластинки должны быть высушены. Высушить их можно при комнатной температуре или в сушильном шкафу, термостате или в потоке горячего воздуха. При этом необходимо проявлять осторожность, чтобы ни один из исследуемых компонентов не подвергся распаду под действием высокой температуры. * Следует отметить, что описанная процедура является частью метода, который прошел полевые испытания и признан пригодным для целей анализа. Экстрагирование можно также осуществлять без встряхивания смеси пробы и растворителя. Фильтрацию проводить не обязательно; использование всплывшего слоя жидкости также позволяет получить надежные результаты. Для идентификации может быть достаточно меньшего объема растворителей и проб. В случае внесения каких-либо изме- нений в описанный метод он должен пройти соответствующую оценку в той лаборатории, где про- водится анализ. 40 Рекомендуемые методы идентификации и анализа каннабиса и продуктов каннабиса Реактив для опрыскивания: (должен готовиться непосредственно перед использованием, желательно ежедневно)* Метод 1: прочный синий Б 50 мг в 20 мл NaOH (0,1 N) Метод 2: прочный синий Б 50 мг в 1 мл воды, затем добавить 20 мл метанола. Примечание Чтобы добиться надлежащего окрашивания, необходимо обеспечить щелоч- ную среду на ТСХ пластине. Для этого можно воспользоваться методом визу- ализации № 1 либо опрыскать пластину диэтиламином перед нанесением на нее раствора прочного синего Б. В любом случае пластинки не должны быть слишком влажными, поскольку это может привести к размыванию пятен. Фиксация Для сохранения результатов анализа в течение длительного времени их необхо- димо соответствующим образом обработать. Оптимальным способом является опрыскивание в следующей последовательности: диэтиламин – раствор прочного синего Б – диэтиламин Затем пластинки высушивают в потоке горячего воздуха или при комнатной температуре в течение ночи. Пластины запечатывают в прозрачные пластиковые пакеты, в которых они могут храниться в течение длительного времени, не темнея. Долгосрочную сохранность результатов анализа можно также обеспечить путем сканирова- ния или фотографирования пластин. Примечание Прочный синий Б считается потенциально канцерогенным веществом, по- этому при работе с ним следует принимать надлежащие меры предосто- рожности. |