Конспект лекций) !!!Опрелеоение понятия вирус, разнообразие, классификация. (см конспект лекций)
 Скачать 2.82 Mb.
|
 
    
    
   
  
    
  
 
  
 
 
 
 
 
 !!!Вопросы 21-24 (см конспект лекций) 25. формы взаимодействия вируса с клеткой    26. по балтимору... см распечатки 27. отдельные стадии взаим вируса с клетками     Вопросы 28-32 см конспект плюс распечатки 33. фаговая трансдукция, конверсия.. Трансдукция и характеристика трансдуцирующих фагов Трансдукция — вид рекомбинации, при которой перенос гене тического материала от одних клеток (доноров) к другим (реци пиентам) осуществляют умеренные фаги или их мутанты. Трансдукцию бактерий открыли лауреаты Нобелевской премии Д. Ледерберг и Н. Циндер. Совместно культивируя два не одинаковых по факторам роста ауксотрофа сальмонелл мышиного тифа в разных коленах U-образного сосуда, разделенного у ос нования мелкопористым фильтром, они отметили появление в одной культуре прототрофов. Далее выяснилось, что ауксотроф, на основе которого формировались прототрофы, был лизогенным и его умеренный фаг перенес к нему недостающие гены от другого, нелизогенного ауксотрофа. Установлено, что за трансдукцию ответственны умеренные фаги, потерявшие способность лизогенизировать бактериальные клетки вследствие того, что часть их генома при неправильном отщеплении замещается фрагментом ДНК бактерии-донора. Та кие мутанты фагов называют дефектными фаговыми корпуску лами или дефектными фагами. Они всегда присутствуют в попу ляции фагов, освобождаемых клетками в среду после индукции или суперинфекции. С помощью трансдуцирующего фага могут передаваться многие признаки и свойства: способность сбражи вать различные углеводы, ситезировать аминокислоты и вита мины, резистентность к антибиотикам, вирулентность, токси-генность, жгутики. При этом трансдуцирующие свойства фага не зависят от способности лизировать или лизогенизировать реципиентную клетку. Трансдуктанты. Образующиеся рекомбинанты называются трансдуктантами. Приобретенные в процессе трансдукции при знаки стабильны и передаются по наследству. Некоторые клоны-трансдуктанты могут оказаться неустойчивыми и, становясь, на пример, гетерогенотами (клетками с неполным диплоидным на бором хромосом), в последующих пересевах теряют трансдуци-рованные им свойства. Виды трансдукции. По характеру передачи признаков раз личают три вида трансдукции - генерализованную, ограничен ную (специализированную) и абортивную. Генерализованную, или общую, трансдукцию осуществляют фаги с множественной локализацией на хромосоме бактерий. К ним, в частности, относится умеренный фаг Ми-1, содержащий линейную двухцепочечную ДНК. Геном этого фага с одинако вой легкостью включается в самые разные участки ДНК клетки, что может приводить к нарушению структуры бактериальных генов и, следовательно, мутациям. Характерной особенностью фага Ми-1, отличающей его от фагов, вызывающих ограничен ную трансдукцию, является то, что после включения в хромосому бактерий порядок его собственных генов в профаге сохраня ется таким же, как и у внеклеточного вириона. При отщеплении от различных участков хромосомы фаги, взывающие генерализованную трансдукцию, могут включать в состав практически любые гены донора и передавать клеткам-реципиентам. Размер поглощаемого сегмента хромосомы-донора определяется размером генома фага, который в сто раз меньше хромосомы бактерии. Вследствие этого при генерализо ванной трансдукции передаются сравнительно небольшие уча стки ДНК донора. Обычно трансдуцируются единичные призна ки но возможна и множественная трансдукция, например не сколько маркеров, контролирующих ростовые факторы и утили зацию углеводов. Следует также подчеркнуть, что трансдукция любого гена не зависит от трансдукции других генов, если между ними нет тесного сцепления. Генерализованная трансдукция возни кает с низкой частотой - 10-4 — 10-7 на одну фаговую частицу. Ограниченную трансдукцию связывают с фагами, обладаю щими избирательной локализацией на хромосоме бактерий и способными переносить ограниченное число генов, прилегаю щих к специфическим участкам интеграции. Этот вид трансдук ции осуществляют умеренные фаги X, Р2, Р22 и многие другие. Передаются они из клетки в клетку в процессе инфекции или из поколения в поколение, находясь в составе геномов размно жающихся лизогенных бактерий. Следует подчеркнуть, что ли-зогения очень распространена в природе и практически все виды бактерий могут быть лизогенными по одному или нескольким фагам. Так, лизогения у эшерихий К-12 по фагам Xи Р2 и эта лонного штамма сальмонелл мышиного тифа по фагу Р22 стала известной только через десятки лет их использования в различ ных экспериментах. Один, другой и третий фаги - ДНК-вирионы. По строению подобны вирулентным колифагам. В ча стности, фаг лямбда имеет сперматозоидную форму с одной ни тью на конце отростка. Проникнув в клетку, все они обычно встраиваются в строго определенном локусе хромосомы естественного хозяина. В ча стности, фаг лямбда интегрирует с геномом эшерихий в районе галактозного локуса, контролирующего утилизацию галактозы. Естественно, что именно его чаще всего захватывает трансдуци-РУЮщий фаг. Абортивная трансдущия отличается от первых двух тем что перенесенный фагом фрагмент ДНК донора остается в ци топлазме реципиентной клетки в автономном состоянии. Не включаясь в хромосому клетки-реципиента, этот фрагмент ДНК в течение нескольких делений бактерий передается лишь одной клетке, а далее полностью исчезает. В течение указанного вре мени автономные гены непосредственно или через свои продук ты, остающиеся в клетках, детерминируют определенные при знаки (способность синтезировать вещества, подвижность и пр.). Однако выраженность перенесенных признаков крайне неотчет лива. За абортивную трансдукцию ответственны фаги, участ вующие в генерализованной трансдукции. Абортивная трансдукция встречается в 10 раз чаще генерализованной. 34, 35 фаги- транспозоны….. векторы…. Генная инженерия - это раздел молекулярной генетики, но, главное, − ветвь биотехнологии по созданию рекомбинативных ДНК (рекДНК) из различных видов организмов и вирусов, спо собных размножаться в реципиентной клетке или организме и детерминировать образование биологически активных веществ, обеспечивающих потребности народного хозяйства, биологии и медицины в частности. Генную инженерию иногда образно называют индустрией ДНК. Существует твердая убежденность, что уже в ближайшие годы могут быть созданы новые мощности по производству ферментов, незаменимых аминокислот, витаминов, гормонов, антибиотиков, вакцин и других веществ. Индустрия рекомбинантных ДНК открывает практическую возможность эффектив ного лечения наследственных болезней обмена веществ путем реконструкции дефектных генов. С нею также связывают пер спективы получения новых высокопродуктивных мясных и молочных пород животных, высокоурожайных сортов расте ний, устойчивых к вредителям и способных усваивать атмо сферный азот, что позволит сократить использование пестици дов, химических удобрений и тем самым улучшить экологиче скую обстановку на Земле. Конструирование генов Конструирование комбинативных генетических структур, де терминирующих образование биологически активных веществ или других продуктов, основано на использовании двух мето дов - выделении (вырезании) генов и их синтезе. Выделение генов. Гены выделяют из геномов про- и эукариот, вирионных геномов и плазмид, содержащих от 3-4 (F-плазмиды, фактор бактериоциногенности) до 15-20 генов (R-плазмиды), способных интегрироваться с клеточным гено мом и передаваться реципиентным клеткам благодаря наличию пилей (половых ворсинок) и tra-оперонов (англ. transfer - пере нос). При этом используются особые ферменты рестриктазы (лат. restrictio - разрыв), или эндодезоксирибонуклеазы, рассе кающие молекулу ДНК на отдельные сегменты с липкими кон цами, к которым легко присоединяются другие рестриктазные фрагменты. Первые рестриктазы получил Г. Смит, а применил их как «молекулярные ножницы» для получения генов и составления генных карт Д. Натане, за что они совместно с В. Арбером, от крывшим механизм рестрикции, были удостоены в 1978 г. Но белевской премии. В настоящее время генные инженеры располагают сотнями рестриктаз. Каждая из них расщепляет ДНК независимо от ее происхождения по строго определенным сайтам (участкам) узна вания нуклеотидных последовательностей. Величина получае мых при этом фрагментов ДНК зависит от частоты встречаемо сти сайтов узнавания в молекуле ДНК и ее длины. Так, если сайт узнавания составляет 4 пары нуклеотидов (пн), то он обычно по вторяется через 256 пн, при длине 5 пн - через 1024, 6 пн - че рез 4 096 пн, 7 пн - через 16 384 пн, 8 пн - через 65 536 пн. С учетом этого для получения фрагментов ДНК, по величине со измеримых с генами, естественно, выбирают рестриктазы с ред ко встречаемыми сайтами узнавания нуклеотидных последова тельностей. Такой рестриктазой, в частности, является EcoRl, образование которой детерминируется в кишечной палочке плазмидой R1. Специфически распознаваемые ею нуклеотидные последовательности встречаются в молекулах ДНК не чаще, чем через 4000-16 000 пн. Следовательно, фрагмент ДНК, образую щийся под действием EcoRl, может включать два и более генов (1 ген в среднем содержит 1000-1500 пн). Полученные гены, однако, не всегда соответствуют функ ционирующим ввиду того, что сайты расщепления рестриктаз в исходных молекулах ДНК оказываются в их пределах. Это при водит к дроблению структурных генов или утрате ими регуля-торных последовательностей. В подобных случаях выделенные гены подключают к промоторам или же прибегают к процедуре наращивания недостающих нуклеотидов. Плохо функциони рующий ген активируют дополнительными вставками аналогич ных ему генов, что называют тандемной амплификацией (англ. tandem - один за другим, лат. amplificatio - увеличение), а к ге нам со сдвигом рамки считывания информации добавляют лин керы (англ. link - связующее звено), чтобы подстроить их под рамку считывания предшествующего гена или его фрагмента. Успешное использование выделенного гена определяет пре жде всего реципиентная клетка. Так, гены эукариот, в составе которых, как известно, имеются не содержащие информации интроны, не экспрессируются в клетках прокариот, так как в них не происходят процессинг и сплайсинг и к тому же недеятельными оказываются промоторы. Напротив, экспрессия генов прокариот в бактериях достигается без особых трудностей. Синтез генов. Таким образом, выделить функционирующие гены рестриктазным дроблением генного материала микробов, клеток животного и растительного происхождения очень труд но, а получить их из геномов РНК-содержащих вирусов вообще невозможно. Поэтому для получения генов эукариот и РНК-вирусов был разработан метод синтеза ДНК-копий (транскриптов) на матри цах клеточной иРНК и вирионной РНК с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы. При этом обратную транскриптазу получают из ретровирусов, в частности вирионов птичьего миелобластоза, саркомы Рауса, мышиной лейкемии, и с ее помощью поэтапно катализируют на РНК синтез одной, а затем и другой нити ДНК. Полученные та ким искусственным путем ДНК-транскрипты на иРНК клеток часто тоже не имеют регуляторных нуклеотидных последова тельностей, ибо уже изначально просто не воспроизводятся при их транскрипции. Иначе обстоит дело с вириоными РНК. Синте зированные на них ДНК-транскрипты полностью комплементарны РНК-генам и кодируют аналогичные им генные продукты. |
