кекер. Конспект лекций по спецкурсу Важнейшие группы прокариотических микроорганизмов
 Скачать 1.55 Mb.
|
|
1 БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Биологический факультет Кафедра микробиологии КОНСПЕКТ лекций по спецкурсу «Важнейшие группы прокариотических микроорганизмов» Лектор: доцент Лысак В.В. 2 СИСТЕМАТИКА БАКТЕРИЙ Принципы систематики Систематика (таксономия) бактерий является одним из наиболее важных и сложных, но менее разработанных разделов микробиологии. Задачами систематики являются классификация, номенклатура и идентификация организмов. Классификация – распределение множества организмов по группам (таксонам). Номенклатура– присвоение названий отдельным группам и видам микроорганизмов. В систематике бактерий, так же как и в ботанике, зоологии, принята бинарная номенклатура, согласно которой бактериям присваивается название, состоящее из двух слов: первое определяет их принадлежность к конкретному роду, второе – к виду. Например, Clostridium botulinum и Clostridium tetani – два различных вида бактерий, относящихся к одному роду. Названия бактериям присваивают в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий. Основной таксономической категорией является вид. Виды объединяются в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки, далее следуют классы, отделы, царства. В микробиологии существуют также более мелкие таксономические единицы, чем вид: подвид (subspeciens), разновидность. Подвиды могут различаться по физиологическим (biovar), морфологическим (morphovar) или по антигенным (serovar) свойствам. Большое значение в микробиологии имеют такие понятия, как клон – чистая культура, полученная из одной клетки, и штаммы – культуры бактерий одного вида, выделенные из различных источников либо из одного источника в разное время или полученные в ходе генетических манипуляций. Разные штаммы одного и того же вида бактерий могут отличаться друг от друга по целому ряду свойств, например по чувствительности к антибиотикам, способности к синтезу токсинов, ферментов и др. Идентификация устанавливает принадлежность микроорганизмов к определенному таксону на основании наличия конкретных признаков. В большинстве случаев идентификация заключается в определении родовой и видовой принадлежности микроорганизмов. Определение бактерий до вида важно не только с позиции чисто познавательной, общебиологической, но и связано с решением ряда прикладных и научных задач. Особенно это важно для медицинской, ветеринарной и промышленной микробиологии, где действующими 3 объектами являются микроорганизмы, и мельчайшие неточности в определении вида могут привести к нежелательным последствиям. В настоящее время в микробиологии приняты два различных подхода к систематике, обусловливающих существование двух систем классификации: филогенетической (естественной) и фенотипической (искусственной). В основу филогенетической классификации положена идея создания системы прокариот, объективно отражающей родственные отношения между разными группами бактерий и историю их эволюционного развития. Фенотипическая классификация преследует, в первую очередь, практические цели, заключающиеся в том, чтобы быстрее установить принадлежность микроорганизма к определенному таксону. Наиболее четко последняя получила свое выражение в Определителе бактерий Берджи (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology), периодически издаваемом Обществом американских бактериологов с привлечением к его написанию крупных специалистов из других стран, изучающих те или иные группы бактерий. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д. Берджи; девятое издание в русском переводе вышло в 1997 г. При классификации бактерий учитывается большое количество различных свойств и признаков. Свойства и признаки, характерные для всех бактерий данной группы и нехарактерные для микроорганизмов других групп, называют критериями систематики. Чем больше общих признаков имеют сравниваемые организмы, тем больше и оснований для включения их в одну таксономическую группу. В связи с тем что количество признаков, используемых для классификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х годов ХХ в. возникла нумерическая (численная) таксономия, основанная на принципах классификации французского ботаника М. Адансона (1757). В основе нумерической таксономии лежит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны. Однако допущение о равнозначности всех признаков является и основным недостатком нумерической таксономии. При идентификации бактерий приоритетным является использование генетических (молекулярно-биологических), фенотипических и серологических подходов и критериев систематики. Генетические критерии систематики Наиболее объективными и дающими представление о филогенетических связях между микроорганизмами являются генетические (молекулярно- 4 биологические) критерии. К ним относятся определение относительного содержания ГЦ-пар в ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот, определение нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК или РНК, применение генетических зондов (ДНК-зондов), рестрикционный анализ ДНК, методы генетического анализа (изучение переноса генов, генетических скрещиваний, картирование хромосом бактерий и др.). Относительное содержание ГЦ-пар в ДНК представляет собой стабильный признак бактерий, не зависящий ни от возраста, ни от условий культивирования, ни от отдельных перестроек генов в хромосоме (т. е. данное свойство практически не изменяется под влиянием большинства мутаций). Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличаются друг от друга относительным содержанием пуриновых и пиримидиновых оснований, которые формируют комплементарные пары в антипараллельных цепях ДНК. Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или сходное содержание ГЦ-пар в ДНК, а далеко отстоящие в генетическом отношении сильно отличаются по относительному содержанию этих азотистых оснований. Молярное содержание ГЦ-оснований у широкого круга прокариот колеблется в широких пределах: от 25 до 80 мол. %. В то же время, например у разных видов бактерий рода Pseudomonas, содержание ГЦ-пар в ДНК имеет близкие величины – от 61,8 до 69,5 мол. % от общего количества оснований. Следовательно, каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным средним содержанием ГЦ-пар, и эту величину можно рассматривать как один из важных признаков вида. Нуклеотидный состав ДНК бактерий можно определить химическими и физическими методами. К химическим относится метод хроматографии на бумаге. Определение состава ДНК этим методом включает следующие основные этапы: выделение ДНК, ее гидролиз до азотистых оснований, разделение их с помощью хроматографии на бумаге, элюирование оснований с бумаги и последующая ультрафиолетовая спектрофотометрия. Хотя этот метод довольно длителен и трудоемок, он позволяет определить непосредственное соотношение азотистых оснований в ДНК, в то время как в других методах расчеты содержания ГЦ- или АТ-пар основаны на косвенных данных. Метод хроматографии на бумаге является классическим методом определения нуклеотидного состава ДНК, в сравнении с которым можно выявить точность и корректность использования других. К физическим относятся метод определения содержания азотистых оснований по температуре плавления ДНК и метод ультрацентрифугирования ДНК в градиенте плотности хлорида цезия. 5 Установлено, что существует прямая зависимость между содержанием ГЦ-пар в молекуле ДНК и температурой ее плавления. Температура плавления– это температура, при которой происходит денатурация ДНК в результате разрыва водородных связей между азотистыми основаниями. Поскольку число водородных связей между гуанином и цитозином больше (3), чем между основаниями в АТ-парах (2), то чем выше содержание ГЦ-пар в ДНК, тем выше температура ее плавления. Следовательно, температура плавления любой ДНК служит показателем ее нуклеотидного состава. Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптической плотности при 260 нм, т. е. максимуме поглощения ДНК в УФ-све-те, что легко измерить спектрофотометрически. При постепенном нагревании образца ДНК поглощение увеличивается по мере разрыва водородных связей и достигает плато при температуре, когда ДНК становится полностью одноцепочечной (рис. 2). Температура, °С Отн оси тел ьн ая оп ти ческ ая пло тно ст ь (D t° /D 25 ° C ) пр и 26 0 нм Рис. 2. Зависимость поглощения ДНК от температуры Средняя точка на кривой возрастания поглощения (указана на рисунке стрелкой) – температура плавления (Т пл. ) – служит мерой содержания ГЦ- оснований, а нуклеотидный состав ДНК определяется по формуле: (Г + Ц) % = (Т пл. – 69,3°) . 2,439. Метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl) основан на том, что имеется линейная зависимость между плотностью ДНК и содержанием в ней ГЦ-пар. Препарат ДНК добавляют к концентрированному раствору CsCl и центрифугируют в течение 24 ч. Установившееся за это время распределение ДНК в градиенте CsCl зависит от ее плотности. При определении нуклеотидного состава ДНК по градиенту плотности в CsCl в качестве стандарта используют ДНК с заведомо известной плотностью. Применение этого метода ограничено из-за сложности оборудования. 6 Существуют и другие методы определения нуклеотидного состава ДНК (при помощи бромирования оснований, депуринизации, спектрального анализа, электрофореза в полиакриламидном геле и др.), но они не нашли широкого применения в основном из-за высокой требовательности к качеству исследуемых препаратов ДНК и недостаточной точности. Более тонким методом оценки генетического сходства организмов является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов. Главным достоинством этого метода является то, что он впервые позволил провести количественную оценку родства микроорганизмов. В основе метода лежит способность денатурированных (одноцепочечных) ДНК в подходящих условиях реассоциировать, т. е. соединяться с образованием двухцепочечных молекул ДНК. Для этого ДНК, выделенную из клеток одного микроорганизма, денатурируют нагреванием. Клетки другого штамма выращивают в среде, содержащей радиоактивный предшественник ДНК ( 3 Н, 14 С), в результате включения которого ДНК становится меченой. Из клеток этого штамма выделяют ДНК, денатурируют ее и смешивают с денатурированной ДНК первого штамма. Раствор выдерживают при температуре ниже температуры плавления ДНК. При этом происходит «отжиг», или специфическая реассоциация комплементарных цепей с образованием двухцепочечных гибридных молекул ДНК. Оставшиеся после «отжига» одноцепочечные ДНК удаляют обработкой ДНКазой. Гибридные молекулы можно обнаружить путем центрифугирования препарата в градиенте CsCl, где они образуют полосы, занимающие промежуточное положение между «легкими» и «мечеными» молекулами двуспиральной ДНК. При аналогичных экспериментах с препаратами ДНК из двух неродственных бактерий никакой гибридизации не выявляется; после «отжига» двойные спирали образуются при специфическом спаривании только тех цепей, которые первоначально были получены из одной и той же молекулы ДНК. Однако оценка гомологии на основе метода центрифугирования в градиенте плотности слишком громоздка для повседневного использования и, кроме того, позволяет обнаружить реассоциацию только тех комплементарных цепей, которые обладают очень высокой степенью сходства. Для измерения реассоциации молекул нуклеиновых кислот был разработан ряд более простых методов. Все они основаны на том, что образование двойных спиралей ДНК должно происходить при использовании двух разных образцов денатурированной ДНК, один из которых помечен радиоактивным изотопом; необходимо лишь отделение двойных спиралей от 7 остаточной одноцепочечной нуклеиновой кислоты и измерение радиоактивности двойных спиралей. Простейший повсеместно используемый способ изучения реассоциации нуклеиновых кислот – метод с применением колонки, содержащей гидроксилапатит. Гидроксилапатит представляет собой гель фосфата кальция, который при определенных условиях специфически адсорбирует только двойные, но не одиночные цепи нуклеиновых кислот. Гибридизационную смесь пропускают через колонку, которую затем промывают для удаления из нее одноцепочечных молекул. Адсорбированные двойные спирали элюируют, и в элюате определяют радиоактивность. Для этого метода необходимо присутствие очень большого избытка немеченой ДНК (в несколько тысяч раз превышающего количество меченой ДНК), чтобы предотвратить реассоциацию меченых комплементарных цепей. В экспериментах по реассоциации любого типа должны быть стандартизированы температурные условия, ионная сила раствора и средняя длина фрагментов ДНК, так как все эти факторы влияют на возможность образования двойных спиралей. Следует отметить, что метод молекулярной гибридизации ДНК не всегда может быть использован для изучения родственных связей между эволюционно далекими группами бактерий. Существует определенный уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей ДНК, ниже которого образования гибридных молекул не происходит. В таком случае изучают реассоциации ДНК–рРНК. Этот метод позволяет значительно расширить список организмов, у которых можно выявить генетическую гомологию благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующего рибосомные РНК, исходная последовательность оснований является более консервативной и сохраняется значительно полнее, чем в основной массе хромосомной ДНК. В итоге путем реассоциации ДНК–рРНК часто можно обнаружить довольно высокую гомологию геномов двух бактерий, у которых реассоциация ДНК–ДНК не выявляет заметной гомологии. Как уже отмечалось, сравнивать генотипы бактерий можно с помощью методов генетического анализа. Известно, что перенос генетической информации и рекомбинация ее с ДНК реципиента может происходить только между двумя родственными организмами. Осуществлению межвидового, межродового переноса генов могут препятствовать внешние барьеры, например различия в строении поверхностных структур клеток, что ограничивает конъюгацию или необходимое для трансдукции прикрепление бактериофага. Таким же препятствием является ферментативное расщепление «чужой» ДНК после ее проникновения в клетку в результате рестрикции со 8 стороны хозяина. Образование генетических рекомбинантов служит значительно более точным показателем уровня генетической гомологии, чем гибридизация in vitro, поскольку включение каждого отдельного фрагмента молекулы ДНК донора зависит от степени его гомологии с ДНК реципиента именно в том небольшом специфическом участке хромосомы, в котором должна произойти рекомбинация. В последние годы в таксономических исследованиях нашел применение такой метод изучения строения генома бактерий, как рестрикционное картирование. Ферменты рестриктазы способны распознавать специфические нуклеотидные последовательности и в строго определенных участках (сайтах рестрикции) «разрезать» молекулы ДНК на фрагменты (рестрикты). Расположение фрагментов ДНК, продуктов расщепления, разделенных с помощью электрофореза в агарозном геле, дает существенную информацию о типе и количестве специфических нуклеотидных последовательностей в хромосомах изучаемых организмов и позволяет судить об их сходстве или различии. Этот метод привлекателен в силу того, что дает возможность выявить сравнительно тонкие различия в последовательностях нуклеотидов ДНК и поэтому его можно использовать для дифференциации микроорганизмов на внутривидовом уровне. Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов) основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический и консервативный для данного вида бактерий ген, с полимерной ДНК изучаемого микроорганизма. С помощью этого метода можно идентифицировать любой биологический объект. Точность метода зависит от используемого зонда (его «чистоты»). Наилучшими ДНК-зондами являются полученные путем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности, расположение нуклеотидов в которых соответствует таковому в участке гена (или всего гена), ответственного за определенную функцию бактерий. ДНК-зонды метят различными способами, например флуоресцентными красителями, радиоизотопами или биотином. Разрешающая способность метода может быть значительно повышена с помощью цепной ДНК-полимеразной реакции. В основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) лежит многократное реплицирование специфического участка нуклеотидной последовательности, катализируемое ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, и использование праймера (от англ. primer – запал, средство воспламенения) – фрагмента ДНК, несущего наиболее специфичную для данного микроорганизма нуклеотидную последовательность гена (или участка гена). С помощью праймера обнаруживают искомый фрагмент идентифицируемого микроорганизма. Чувствительность метода исключительно высока и за несколько часов он 9 позволяет увеличить число копий исследуемого фрагмента ДНК в 10 6 –10 8 раз. ПЦР может быть использована для идентификации ДНК любого микроорганизма, если для него имеется соответствующий праймер. Применение ПЦР особенно показано в тех случаях, когда трудно выделить чистую культуру возбудителя какого-либо заболевания из-за сложности методов культивирования, малого количества возбудителя в исследуемом образце, высокой антигенной изменчивости и т. д. ПЦР незаменима для обнаружения во внешней среде так называемых некультивируемых, но жизнеспособных форм бактерий, в том числе патогенных (холерного вибриона, сальмонелл, легионелл и др.). Тест-системы с праймерами для проведения ПЦР в целях обнаружения возбудителей различных заболеваний разработаны и внедряются в практику. |