лекции по микробиологии. Курс лекций по микробиологии пятигорск, 2008 Империя Доклеточные Империя Клеточные Надцарство Эукариоты
 Скачать 1.67 Mb.
|
|
Для предупреждения токсического действия нужно назначать больному человеку наиболее безвредные для его состояния антибиотики. Например, если у человека больны почки, то нельзя применять препараты, обладающие нефротоксическим действием. Нужно использовать комбинации антибиотиков с другими лекарственными средствами. Это позволит снизить дозу антибиотика, а, следовательно, и его токсичность. 2. Дисбактериозы бывают при длительном лечении антибиотиками широкого спектра действия. Гибнут не только патогенные микробы, но и представители нормальной микрофлоры. Освобождается место для антибиотикоустойчивых микробов, которые могут стать причиной различных заболеваний. Дисбактериоз может не только усиливать уже имеющееся заболевание, но делает организм более восприимчивым к другим заболеваниям. Для предупреждения дисбактериоза нужно использовать антибиотики узкого спектра действия, сочетать антибиотики с противогрибковыми препаратами для уничтожения грибов и с эубиотиками для восстановление нормальной микрофлоры. 3. Отрицательное действие на иммунную систему: а) развитие аллергических реакций (10% случаев); наиболее сильными аллергенами являются пенициллины, цефалоспорины; при аллергических реакциях на антибиотики появляется сыпь, зуд, иногда даже анафилактический шок; для предупреждения аллергических реакций нужно знать индивидуальную чувствительность людей, для предупреждения анафилактического шока – делать кожно-аллергические пробы; б) подавление иммунитета (иммунодепрессия): левомицетин подавляет образование антител, циклоспорин А – функцию Т-лимфоцитов; для профилактики – строгий подход к назначению антибиотиков; в) нарушение формирования полноценного иммунитета после перенесения инфекционного заболевания; это связано с недостаточным антигенным действием микробов, которые погибают от антибиотиков раньше, чем успеют выполнить антигенную функцию; в результате возникают повторные инфекции (реинфекции) и рецидивы; для предупреждения нужно сочетать антибиотики с вакциной (антибиотики вызывают гибель возбудителей, а вакцина формирует иммунитет); 4. Реакция обострения – развитие интоксикации в результате выделения из микробных клеток эндотоксинов при массовой их гибели (разрушение клеток) под действием антибиотиков. 5. Отрицательное влияние антибиотиков на развитие плода. Это происходит в результате повреждения организма матери, сперматозоидов, плаценты и нарушения метаболизма самого плода. Например, тетрациклин оказывает прямое токсическое действие на плод. Известны случаи появления детей-уродов. В 1961 г. из-за применения препарата талидомида рождались дети-калеки без рук, без ног и наблюдались случаи детской смертности. Чтобы не причинить вреда организму человека, антибиотики должны обладать специфической тропностью. Trope – направляю, т.е. их действие должно быть целенаправленно на подавление (уничтожение) патогенных микробов. Антибиотики также должны обладать органотропностью – свойство антибиотика избирательно действовать на определенные органы. Например, энтеросептол применяют для лечения кишечных инфекций, т.к. он практически не всасывается из ЖКТ. Под влиянием антибиотиков могут измениться и сами микроорганизмы. Могут образоваться дефектные формы микробов – L-формы. Могут измениться не только морфологические свойства, но и биохимические, вирулентность и т.д. Это затрудняют диагностику заболеваний. ЛЕКЦИЯ № 12 Лекарственная устойчивость. Определение активности антибиотиков и чувствительности бактериальных культур к антибиотикам. Механизмы развития устойчивости микробов к антибиотикам. Помимо побочного действия антибиотиков на макроорганизм человека, антибиотики оказывают нежелательное воздействие и на микроорганизмы: 1) изменяются свойства микробов, что затрудняет их распознавание и диагностику заболеваний; 2) формируется приобретенная антибиотикоустойчивость (резистентность). Различают также врожденную или видовую устойчивость к антибиотикам. Она обусловлена видовыми свойствами, которые определяются геномом клетки (пенициллин не действует на микроорганизмы, у которых отсутствует пептидогликан в клеточной стенке). Циркуляция в природе антибиотикорезистентных бактерий создает трудности в лечении инфекционных заболеваний. Для того, чтобы антибиотик оказал свое действие на микроорганизм необходимо следующее: 1) антибиотик должен проникнуть в клетку; 2) антибиотик должен вступить во взаимодействие с «мишенью» (структура, на которую должен действовать антибиотик, например, молекула ДНК или рибосомы клетки); 3) антибиотик должен сохранять свою активную структуру. Если какое-либо из этих условий не будет выполнено, антибиотик не сможет оказать свое воздействие и у бактерий или других микробов развивается устойчивость к данному антибиотику. Развитие устойчивости объясняется генетическими процессами, что затем проявляется через определенные биохимические механизмы. Например, устойчивость грибов р. Candida к нистатину связана с мутацией генов, которые отвечают за строение клеточной мембраны, которая является «мишенью» для действия нистатина. Генетические процессы связаны с изменениями в геноме бактерий в результате мутаций и с наличием R-плазмид. В связи с этим различают: 1) хромосомную устойчивость- возникает в результате мутаций в геноме (хромосоме) и обычно бывает к одному антибиотику; такая устойчивость может передаваться по наследству при всех видах генетического обмена; 2) внехромосомную устойчивость (наблюдается значительно чаще) - связана с наличием в цитоплазме бактерий R–плазмиды, которая определяет множественную лекарственную устойчивостью (к нескольким антибиотикам); она может передаваться другим бактериям при конъюгации и трансформации. Биохимические механизмы: 1) изменение проницаемости мембраны для антибиотика; например, снижение проницаемости наружной мембраны у грамотрицательных бактерий обеспечивает их устойчивость к ампициллину; 2) изменение «мишени»; например, устойчивость к стрептомицину связана с изменением рибосомального белка, с которым взаимодействует стрептомицин; 3) нарушение специфического транспорта антибиотика в бактериальную клетку; например, устойчивость к тетрациклину может быть связана с подавлением транспорта этого антибиотика в клетку; 4) превращение активной формы антибиотика в неактивную (основной биохимический механизм) при помощи ферментов; образование таких ферментов связано с R-плазмидами и транспозонами (отрезками ДНК). Важное значение имеют ферменты пептидазы, которые вызывают гидролиз антибиотиков. Например, ферменты лактамазы, разрушающие –лактамное кольцо. К этим ферментам относится индуцибельный фермент пенициллиназа. 98% стафилококков образуют пенициллиназу, разрушающую пенициллин, поэтому они обладают устойчивостью к пенициллину. У E.coli и протея пенициллиназа является конститутивным ферментом, чем и объясняется их естественная резистентность к пенициллину. E. сoli образует фермент стрептомициназу, которая разрушает стрептомицин. Имеются бактерии, образующие ферменты, которые вызывают ацетилирование, фосфорилирование и другие изменения структуры антибиотиков, что приводит к потере их активности; 5) возникновение у микробов другого пути метаболизма вместо того пути, который нарушен антибиотиком. Распространению антибиотикорезистентности способствуют следующие условия: 1) широкое бесконтрольное применение антибиотиков для лечения (самолечение) и профилактики заболеваний, что способствует отбору резистентных форм, возникших в результате генетических процессов; 2) применение одних и тех же антибиотиков для лечения человека и животных (или в качестве консервантов пищевых продуктов). Для предупреждения развития устойчивости к антибиотикам и для правильного лечения необходимо соблюдать следующие принципы. 1. Микробиологический: антибиотики применять по показаниям, предварительно определять антибиотикограмму. 2. Фармакологический: при назначении антибиотика необходимо определить правильную дозировку препарата, схему лечения, по возможности сочетать различные средства, чтобы предупреждать формирование резистентных форм. 3. Клинический: учитывать общее состояние больных, возраст, пол, состояние иммунной системы, сопутствующие заболевания, наличие беременности. 4. Эпидемиологический: знать, к каким антибиотикам устойчивы микроорганизмы в среде, окружающей больного (отделение, больница, географический регион). 5. Фармацевтический: необходимо учитывать срок годности, условия хранения препарата, так как при длительном и неправильном хранении образуются токсические продукты деградации антибиотика. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Так как одним из важнейших принципов правильного лечения инфекционных заболеваний является выбор антибиотика, к которому возбудитель наиболее чувствителен, перед назначением антибиотиков проводится определение чувствительности возбудителя заболевания к антибиотикам, т.е. устанавливается антибиотикограмма. Наиболее известны 3 метода: 1. Метод бумажных дисков на питательном агаре. В чашку Петри на питательный агар делают посев микробной взвеси. Избыток жидкости удаляют пипеткой. После впитывания взвеси в агар на засеянную поверхность пинцетом наносят 5-6 разных бумажных дисков с антибиотиками, диски отличаются по цвету. Чашки с дисками ставят в термостат при 37 С на 18-20 часов. Антибиотики из дисков диффундируют в агар. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры судят о ее чувствительности к антибиотикам. Этот метод нельзя применять, если антибиотики плохо диффундируют в агар. Преимущество метода – можно определить чувствительность исследуемой бактериальной культуры сразу к нескольким антибиотикам. 2. Метод серийных разведений в МПБ. Готовят основной раствор антибиотика в соответствующем растворителе. Из основного раствора готовят последующие 2-хкратные разведения в бульоне. Обычно берут 12 пробирок по 1 мл МПБ в пробирке. После последовательных разведений антибиотика в МПБ, в каждую пробирку добавляют 0,1 мл взвеси клеток испытуемой бактериальной культуры, содержащей 10 6 -10 7 клеток. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч. Результаты отмечают по наличию роста. Если есть рост бактерий – среда мутная. Если нет роста бактерий – среда прозрачная. Если среда в пробирке мутная, то в данной концентрации антибиотик не действует, если прозрачная– антибиотик действует. По последней пробирке с прозрачной средой определяют минимальную ингибирующую дозу антибиотика. Одновременно ставят контрольные пробы: 1-ый контроль (контроль бактериальной культуры) - 1 мл МПБ + взвесь бактерий без антибиотика, 2-ой контроль (контроль антибиотика) - 1 мл МПБ + антибиотик, но без взвеси бактерий. В контрольных пробирках должны быть следующие результаты: 1-ый контроль – помутнение среды (есть рост); 2-ой контроль – среда прозрачная (нет роста). Для того, чтобы узнать какое действие оказал антибиотик (бактерицидное или бактериостатическое), петлей делают посевы из пробирок на сектора ПА. Роста нет – бактерицидное действие, рост есть – бактериостатическое действие. Преимущество метода – определение минимальной концентрации антибиотика, которая ингибирует (подавляет) рост бактериальной культуры. 3. Метод «канавки» (предложен А. Флемингом). Берут чашку Петри с питательным агаром. В центре по диаметру вырезают полоску агара шириной 1 см. Затем канавку заполняют агаром, смешанным с антибиотиком. После застывания канавки перпендикулярно делают посев исследуемых культур (4-5). После инкубации в термостате чувствительность определяют по длине зоны задержки роста, чем она больше, тем культура чувствительнее и наоборот. Преимущество метода – можно определить чувствительность сразу нескольких культур к данному антибиотику. Биологическая активность антибиотиков. Биологическая активность антибиотика – это его способность убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов. Активность выражают в единицах действия (ЕД). 1 ЕД - минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма тест-микроба в определенных условиях. Так, для пенициллина 1 ЕД является минимальное количество, способное задержать рост золотистого стафилококка штамма 209-р в 50 мл МПБ. Для стрептомицина 1 ЕД должна задерживать рост E.coli в 1 мл МПБ. В настоящее время активность большинства антибиотиков измеряется в мкг. Обычно 1мкг химически чистого препарата соответствует 1 ЕД. Для бензилпенициллина 1мг содержит 1670 ЕД, в 1 мг нистатина содержится 4000 ЕД. Методы определения активности антибиотиков. Активность антибиотиков определяют: 1) методом серийных разведений; 2) методом диффузии в агар. Для определения активности антибиотиков в качестве тест - культуры используют непатогенные или условно-патогенные микробы, проявляющие наибольшую чувствительность к данному веществу. Так, для определения активности пенициллина используют S. аureus 209-р. 1. Определение активности антибиотиков методом серийных разведений. Берут ряд пробирок с одинаковым объемом МПБ (1-10 мл). Количество пробирок определяется количеством разведений (степенью разведения) антибиотика. В первую пробирку вносят определенное количество антибиотика, перемешивают, определенный объем раствора переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают, из второй пробирки – в третью и т.д. Из последней пробирки такой же объем выливают, чтобы во всех пробирках содержался одинаковых объем жидкости. Контроль – пробирка без антибиотика. Во все пробирки с разведениями антибиотика и контрольную пробирку вносят 0,1 мл взвеси тест культуры (2,5 10 6 клеток в 1 мл). На следующий день определяют разведение антибиотика, при котором в пробирке нет роста - среда осталась прозрачной (если нет роста, следовательно антибиотик подействовал). Эта наименьшая концентрация и есть минимальная активная доза антибиотика. Можно использовать этот метод с применением плотной среды, в том случае, если микробы не растут на жидких средах (для туберкулезных палочек – свернутую сыворотку). Разведения антибиотика в среде готовят следующим образом. Вначале готовят различные разведения антибиотика в растворителе, а затем по 1 мл каждого разведения вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45-50 С МПА. Пробирки скашивают для застывания агара, а на поверхность среды петлей засевают тест- культуру. 2. Определение активности антибиотика методом диффузии в агар. Питательный агар (ПА) по 15 мл разливают в чашки Петри. После застывания и подсушивания агара в каждую чашку наливают по 5 мл ПА, смешанного с тест культурой (20 млн. клеток на 1 мл среды). После застывания второго слоя агара на его поверхность наносят по трафарету 6 цилиндров и делают 6 лунок. В 3 лунки вносят по 0,1 мл испытуемого раствора антибиотика, в другие 3 лунки – по 0,1 мл стандартного раствора. Через 16-18 часов термостатирования при 37 С цилиндры удаляют и измеряют диаметр зон задержки роста. Активность антибиотика устанавливается с помощью расчетной таблицы ГФК или по стандартной кривой на основе диаметра задержки роста. ЛЕКЦИЯ № 13 Учение об инфекции. Понятие инфекция, инфекционный процесс, инфекционная болезнь. Инфекция (infectio – заражение) – процесс проникновения микроорганизма в макроорганизм и его размножение в нем. Инфекционный процесс – процесс взаимодействия микроорганизма и организма человека. С биологической точки зрения инфекционный процесс – это разновидность паразитизма, когда один вид (паразит) использует другой вид (хозяин) как источник питания и место обитания, нанося ему вред. Инфекционный процесс имеет различные проявления: от бессимптомного носительства до инфекционного заболевания (с выздоровлением или летальным исходом). Инфекционная болезнь - это крайняя форма инфекционного процесса. Для инфекционной болезни характерно: 1) наличие определенного живого возбудителя; 2) заразность, т.е. возбудители могут передаваться от больного человека здоровым, что приводит к широкому распространению заболевания; 3) наличие определенного инкубационного периода и характерная последовательная смена периодов в течение болезни (инкубационный, продромальный, манифестный (разгар болезни), рековалесценции (выздоровление)); 4) развитие характерных для данного заболевания клинических симптомов; 5) наличие иммунного ответа (более или менее продолжительный иммунитет после перенесения заболевания, развитие аллергических реакций при наличии возбудителя в организме и др.) Названия инфекционных болезней формируются от названия возбудителя (вида, рода, семейства) с добавлением суффиксов "оз" или "аз" (сальмонеллез, риккетсиоз, |