лекции по микробиологии. Курс лекций по микробиологии пятигорск, 2008 Империя Доклеточные Империя Клеточные Надцарство Эукариоты
 Скачать 1.67 Mb.
|
|
Пребиотики – вещества немикробного происхождения, компоненты убитых микробных клеток и /или их метаболиты: - хилак-форте – концентрат продуктов обмена веществ бактерий – симбионтов толстого кишечника, а также биосинтетическая молочная кислота, молочно-солевой буфер, лактоза, аминокислоты, жирные кислоты; 3) Синбиотики – содержат как живые микроорганизмы, так и неклеточные стимуляторы роста нормальной микрофлоры: нутролин В (лактобациллы + витамины), ацидофилюс, примадофилюс, мальтидофилюс, бебилайф. Для нормализации микрофлоры используются живые бактерийные препараты для заквашивания молока и приготовления продуктов, обладающих пробиотическим действием ("наринэ" и др.). При некоторых формах кишечного дисбиоза используются также и бактериофаги: коли-протейный, стафилококковый, синегнойный бактериофаги. ЛЕКЦИЯ №9 Микрофлора лекарственных растений. Фитопатогенные микроорганизмы. Микробная порча растительного сырья, готовых лекарственных средств. Методы контроля микробной чистоты растительного сырья и лекарственных средств. Лекарственные растения используются для приготовления лекарств. Нужно знать, что растительное лекарственное сырье может быть загрязнено микроорганизмами, которые будут вызывать порчу растительного сырья. Растительное сырье может быть загрязнено микроорганизмами – представителями нормальной микрофлорырастений, а также фитопатогеннымимикроорганизмами – возбудителями инфекционных заболеваний растений. Нормальная микрофлора растений. В норме на поверхности живых растений (на листьях, стеблях, плодах, семенах) обитают микроорганизмы, которые называются эпифитной микрофлорой. Они питаются выделениями растений и органическими загрязнениями на поверхности растений. Эпифитная микрофлора не наносит вреда и препятствует проникновению фитопатогенных микробов в растительные ткани (антагонистическое действие). К эпифитной микрофлоре относятся: грам «-» бактерии Erwinia herbicola (на МПА образует золотисто-желтые колонии), грам«-» полиморфная палочка Pseudomonas fluorescens (на МПА – прозрачные колонии с флюоресценцией), спорообразующие бактерии – Bacillus mesentericus, Bacillus vulgatus, бесспоровые бактерии – Bacterium putidam, E. сoli, а также небольшое количество грибов. Возле корней растений в почве находится большое количество микроорганизмов. Эта зона называется ризосферой. Здесь встречаются псевдомонады, микобактерии (неспорообразующие палочки), актиномицеты, а также спорообразующие бактерии и грибы. Эти микроорганизмы переводят различные сложные вещества в соединения, доступные для растений, синтезируют биологически активные соединения (витамины, антибиотики и др.), вступают в симбиотические взаимоотношения с растениями, обладают антагонистическими свойствами по отношению к фитопатогенным микробам. Состав ризосферы специфичен для каждого вида растений. Состав нормальной микрофлоры растений зависит от вида, возраста растений, типа почвы, температуры, влажности окружающей среды, от других условий произрастания, от времени проверки растений, их высоты и целостности. Растения культурных почв в большей степени загрязнены микроорганизмами, чем растения лугов и лесов. Осенью на листьях обнаруживается больше микробов, чем ранней весной. При повышении влажности воздуха повышается количество микробов на поверхности растений (эпифитная микрофлора). На поврежденных растениях накапливается большое количество пыли, а, следовательно, и микроорганизмов. Особенно много микробов содержится в нижней части растений, что связано с их попаданием из почвы. В большом количестве обнаруживаются микроорганизмы на растениях, растущих на, свалках, вблизи навоза, в местах выпаса скота. При этом на растениях могут быть обнаружены и патогенные микроорганизмы. Фитопатогенные микроорганизмы. К фитопатогенным микробам относятся возбудители инфекционных заболеваний у растений - бактерии, грибы и вирусы. Болезни, вызываемые бактериями, называются бактериозами. Различают местные и общие бактериозы. Общие бактериозы вызывают гибель всего растения или его отдельных частей. Местные бактериозы - поражения только отдельных участков растений. Передача возбудителей бактериозов происходит через зараженные семена, остатки больных растений, почву, воздух, воду, путем переноса насекомыми, моллюсками, нематодами. Бактерии проникают в растения через устьица, нектарники, через повреждения. Внутри растения бактерии могут распространяться 2-мя путями: 1) межклеточный путь; такие заболевания называются паренхиматозными; 2) по сосудам; бактерии закупоривают сосуды, поэтому растения увядают; такие заболевания называются сосудистыми. Основные роды бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний растений: Род Erwinia - вызывает болезни типа ожога, увядания, мокрой или водянистой гнили. Род Pseudomonas – вызывает бактериальную пятнистость (на листьях образуются пятна различной окраски и размеров). Род Xanthomonas – вызывает сосудистые бактериозы (закупорка сосудов, увядание и гибель), поражает листья, вызывает пятнистость. Род Corynebacterium – сосудистые и паренхиматозные заболевания, бактериальный рак. Род Agrobacterium – вызывает образование опухолей (корончатые галлы). Род Pectobacterium – вызывает преимущественно гнили растений. К вирусным заболеваниям растений относятся мозаичные болезни, желтухи, болезнь увядания, карликовость, закукливание и др. Грибные болезни растений – микофитозы: фузариозы, гнили, аскохитозы, головни и др. Грибы, поражающие растения, могут в случае приготовления из пораженного зерна продуктов питания вызывать пищевые отравления человека – микотоксикозы. Примером является эрготизм – заболевание, возникающее при употреблении продуктов, приготовленных из зерна, зараженного спорыньей. Срезанные и сорванные при заготовке лекарственные растения (растительное сырье) могут содержать большое количество микробов. Растительное сырье может быть загрязнено: 1) нормальной микрофлорой растений; 2) фитопатогенной микрофлорой; т.е. микробами самих растений, 3) микробами из окружающей среды (почвы, воздуха, от людей). Растительное лекарственное сырье может загрязняться микроорганизмами из окружающей среды на всех этапах его заготовки и хранения: сбор, первичная обработка, сушка, измельчение, упаковка, получение резаного сырья, растительных порошков, а также при приготовлении брикетов, гранул, таблеток. Срезанные и сорванные растения являются хорошей питательной средой для размножения микроорганизмов (грибов, гнилостных и целлюлозоразрушающих бактерий и др.). Поэтому происходит микробная порча сырья. Признаки порчи: изменение цвета, появление очагов размножения плесени и пр. Микробная порча приводит к изменению фармакологических свойств растений и лекарственных препаратов, полученных из растений, а также может служить причиной образования токсичных продуктов. Патогенные микроорганизмы могут вызывать заболевания у людей, использующих препараты. Одним из способов, препятствующих росту микроорганизмов на растениях, является их высушивание. На высушенных растениях жизнедеятельность микробов значительно снижается, многие бактерии погибают. В связи с этим, микробная порча сырья происходит в первую очередь при повышенной влажности, которая способствует размножению гнилостных микробов. Поэтому необходимо строго соблюдать условия хранения растительного сырья и проводить бактериологический контроль его микробной загрязненности. Методы контроля микробной чистоты растительного сырья. Для оценки микробной обсемененности растительного сырья используется метод смывов. В асептичных условиях, используя стерильные инструменты, взвешивают 1 г сырья, помещают в стерильную пробирку с 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 10 мин; берут 1 мл смыва, делаю разведения 1:10, 1:100; из каждого разведения делают посев 1 мл в глубину питательной среды в чашках Петри. Для выявления роста грибов и дрожжей используют среду Сабуро или сусло-агар, для выявления бактерий – МПА. При этом засевают 2-3 параллельные чашки на каждое разведение. Оставляют в термостате при 37 С для бактерий и при 24 С для грибов и дрожжей, подсчитывают число выросших колоний и, зная разведение смыва, подсчитывают микробную загрязненность сырья. Микробную загрязненность лекарственного сырья выражают количеством клеток микроорганизмов в 1 г сырья. Микрофлора готовых лекарственных форм. Микроорганизмы могут загрязнять и различные готовые лекарственные препараты. В готовые лекарственные препараты микробы попадают: 1) из растительного лекарственного сырья (нормальная и фитопатогенная микрофлора растений); 2) из окружающей среды во время изготовления лекарственных препаратов в аптеках и на фармацевтических фабриках. Источники микробного загрязнения лекарственных препаратов: 1) лекарственные растения; 2) вода 3) аптечная посуда, оборудование и пр.; 4) воздух производственных помещений; 5) руки персонала. Микроорганизмы могут попадать в лекарственные средства в процессе неправильного анализа, особенно органолептического. Микрофлора готовых лекарственных форм, изготовляемых в аптеках и на производстве, зависит от : 1) вида сырья, его питательной ценности для микроорганизмов или, напротив, его антимикробной активности, начальной загрязненности; 2) химической природы веществ, входящих в состав лекарственного средства; 3) технологии приготовления (настои, отвары, температура, время, объем и пр.); 4) условий хранения; 5) санитарно-гигиенических условий в аптеках и на фабриках. Микроорганизмы, попадающие в лекарства, приводят к их порче и могут изменить их качество, разлагая своими ферментами действующее начало и переводя его в другие соединения. Таким образом,. микроорганизмы могут изменять свойства лекарств, делая их неактивными или даже токсичными, например, в результате образования микробных токсинов и пирогенов. Патогенные микроорганизмы могут вызывать инфекционные заболевания у людей, использующих препараты, загрязненные микроорганизмами родов Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella и др. Среди готовых лекарственных форм наиболее загрязненными являются препараты растительного происхождения – настои и отвары. При хранении этих лекарств, особенно в теплом месте, количество микробов в них возрастает до высоких цифр, и появляются признаки порчи. Признаками микробной порчи жидких лекарственных форм является помутнение, если лекарственная форма должна быть прозрачной, появление осадка, увеличивающегося в объеме, образование пленки на поверхности, появление запаха, несвойственного данной лекарственной форме. В связи с этим осуществляется бактериологический контроль соблюдения санитарно-гигиенического режима изготовления лекарственных препаратов на предприятиях и в аптеках и проводится санитарно-микробиологический контроль каждой серии выпускаемой лекарственной формы, т.е. проводится определение микробной загрязненности различных готовых лекарственных препаратов. Методы определения микробной загрязненности готовых лекарственных препаратов. Имеются определенные требования ВОЗ и фармакопеи по микробной загрязненности различных лекарственных средств. Лекарственные средства для парентерального введения в виде инъекций, глазные капли, мази, пленки, средства для новорожденных, должны быть стерильными. Стерильные инъекционные растворы могут обладать пирогенными свойствами, т.е. вызывать повышение температуры тела. Это обусловлено наличием в них убитых бактерий или продуктов их распада. Пирогены – это сложные по своей структуре вещества, которые содержат протеины, липиды и полисахариды, и вызывают в макроорганизме комплекс изменений, характеризующихся повышением температуры тела, вазомоторными расстройствами, в тяжелых случаях – шоковым состоянием. Пирогенами являются бактериальные эндотоксины. Все растворы, предназначенные для инъекций не должны содержать пирогенов. Но освободить от них готовый продукт не удается, т.к. пирогены проходят через бактериальные фильтры и устойчивы к нагреванию. Для этого необходимо соблюдать специальные требования при изготовлении стерильных лекарственных средств: 1) дистиллированная вода уже до стерилизации не должна содержать кишечной палочки; 2) общее количество микробов в воде не должно превышать 10 – 15 клеток на 1 мл; 3) препараты готовят в асептических условиях, пользуются стерильной посудой, соблюдают стерильность при их упаковке, после приготовления стерилизуют. Проверку стерильности производят в боксах со строгим соблюдением правил асептики. Делают посев на тиогликолевую среду (для выявления различных бактерий, в том числе анаэробов) и посев на среду Сабуро (для выявления грибов, г.о. рода Кандида). Если нет роста микробов на средах, то препарат является стерильным. Если лекарственное средство обладает антимикробным действием, то стерильность определяют путем мембранной фильтрации. После фильтрации исследуемого препарата фильтр делят на части и вносят для роста задержанных микроорганизмов в жидкие питательные среды. При отсутствии роста препарат считается стерильным. Лекарственные средства, не требующие стерилизации, содержат микроорганизмы. Но их содержание не должно превышать предельно допустимых значений для различных лекарственных форм. Оценка микробной загрязненности нестерильных препаратов. Определяют: 1) количество жизнеспособных бактерий в 1 г или 1 мл препарата; 2) количество жизнеспособных грибов в 1 г или 1 мл препарата; 3) кишечную палочку и представителей семейства энтеробактерий, синегнойную палочку и золотистого стафилококка, которые не должны присутствовать в нестерильных лекарственных средствах. Методы определение микробной загрязненности лекарственных средств, не обладающих антимикробным действием. От каждой серии препарата отбирают 10 проб из 10 разных упаковок, в целом не меньше 50 г или мл. На анализ берут 30 г т(мл), разделив на 3 части по 10 г (мл). Определение общего количества бактерий и грибов. 10г (мл) разводят в 10 раз 0,1 М раствором фосфатного буфера, доводя конечный объем до 100 мл. Делают посев по 1 мл разведенного препарата двухслойным агаровым методом в 2 чашки Петри с МПА, содержащим 0,1% глюкозы для определения бактерий и по 1 мл в 2 чашки Петри со средой Сабуро с антибиотиками для грибов. Чашки с МПА для определения бактерий инкубируют при 37 С 5 дней, а со средой Сабуро для определения грибов при 24 С 5 дней. Затем подсчитывают число колоний, находят среднее арифметическое для 2-х чашек и высчитывают количество бактерий и грибов в 1г (мл) отобранного на анализ образца. Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae. Следующие 10 г(мл) образца вносят в 90 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 37 С 24 – 48 час. При наличии роста делают пересев на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Инкубируют при 37 С 24 – 48 час. На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют малиновые колонии с металлическим блеском. На висмут-сульфитном агаре – черные или зеленовато-бурые, светло-зеленые или коричневые колонии. Колонии исследуют микроскопически и выявляют грам «-» неспоровые палочки. Подозрительные колонии пересевают на скошенный в пробирках МПА с 0,1% глюкозой и инкубируют при 37 С 24 час. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы на : 1) среду с глюкозой и феноловым красным ( энтеробактерии ферментируют глюкозу и среда становится желтой); 2) среду с нитратом калия (энтеробактерии восстанавливают нитраты в нитриты и не имеют фермента цитохромоксидазы). Если в образце обнаружены грам «-» неспоровые палочки, которые дают отрицательную реакцию на цитохромоксидазу, ферментируют глюкозу и восстанавливают нитраты в нитриты, то делают вывод, что исследуемый препарат содержит бактерии семейства Enterobacteriaceae. Определение бактерий S. aureus и P. aeruginosa. Следующие 10 г(мл) образца вносят в 90 мл накопительной среды и инкубируют при 37 С 24 – 48 час. При наличии роста делают пересев петлей на чашки Петри с солевым агаром с маннитом для стафилококка и на чашки Петри со средой для идентификации синегной палочки. Инкубируют при 37 С 24 – 48 час. Стафилококк на солевом агаре образует желтые колонии, окруженные желтыми зонами. При микроскопии обнаруживаются грам"+" кокки. С чистой культурой стафилококка ставят реакцию плазмокоагуляции. Для этого в пробирку с 0,5 мл разведенной (1:4) плазмой крови человека или кролика вводят петлю агаровой культуры стафилококка и инкубируют 1-24 час при 37 С. Стафилококк коагулирует плазму. P. aeruginosa на диагностической среде образует зеленые флюоресцирующие колонии. Их идентифицируют микроскопически и биохимически. Под микроскопом бнаруживают грам «-» палочки. Реакция на цитохромоксидазу положительна (бумажка с индикатором синеет). Нормативы. В нестерильных лекарственных средствах для приема внутрь в 1 г (мл) должно быть не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов, а также должны отсутствовать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы - представители семейства энтеробактерий, синегнойная палочка и золотистый стафилококк. Лекарственные средства для местного применения (полость уха, носа, интравагинально) не должны содержать более 100 (суммарно) микробных клеток в 1 г (мл). |