лекции по микробиологии. Курс лекций по микробиологии пятигорск, 2008 Империя Доклеточные Империя Клеточные Надцарство Эукариоты
 Скачать 1.67 Mb.
|
|
инкубация при 37 С, 24 часа; в) пересев положительных проб (образование газа и диффузное помутнение) на среду Эндо и инкубация при 37 С, 24 часа; г) на среде Эндо E. coli образует тёмно-красные колонии с металлическим блеском; проводят микроскопическое подтверждение колоний E. coli (из подозрительной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; под микроскопом видны мелкие грам"-" палочки); г) расчет коли-титра (с учетом разведения и навески почвы определяют количество почвы в граммах, в котором обнаружена клетка кишечной палочки). 3.Определение перфрингенс-титра почвы: а) почвенную суспензию прогревают 10-15 мин при 80 С для того, чтобы неспоровые бактерии не росли на среде; б ) посев 10- кратных разведений почвы на среду Вильсона-Блера и инкубация при 37 - 43 С, 3-18час или посев на среду Тукаева (молочная среда) и инкубация 3 – 4 часа; в) на среде Вильсона-Блера C. perfringens образует чёрные колонии и газ разрывает среду, а на среде Тукаева наблюдается створаживание молока, а газ разрывает сгустки казеина и вытесняет в верхнюю часть пробирки; наличие C. perfringens подтверждается микроскопически (готовят мазок, окрашивают по Грамму и микроскопируют, под микроскопом видны крупные грам «+» палочки) г) расчет перфрингенс-титра (с учетом разведения определяют количество почвы в граммах, в котором обнаружена клетка C. perfringens).Перфрингенс-титр определяется максимальным разведением почвенной суспензии, при посеве которого образуются на среде Вильсона-Блера характерные черные колонии. Нормативы по коли-титру и перфрингенс-титру почвы. Оценка почвы Коли-титр Перфрингенс-титр Незагрязнённая 1 г и больше 0,1 г и больше Слабо загрязнённая 0,1-0,01 0,01-0,001 Умеренно загрязнённая 0,01-0,001 0,001-0,0001 Сильно загрязнённая 0,001 и меньше 0,0001 и меньше Микрофлора воды. Вода – естественная среда обитания микроорганизмов. Состав микрофлоры воды зависят от химического состава воды, температуры, содержания CO 2 и O 2 , рН, облучения солнечными лучами, содержания питательных веществ, флорой и фауной, глубиной водоёма, выпуском сточных и промышленных вод. В пресных водоёмах (реки, озёра) нормальными обитателями являются Micrococcus roseus и др. микрококки, Pseudomonas fluorescens, извитые формы (Sp. rubrum). В воду поступают сапрофитные микробы почвы: p. Azotobacter, p. Nitrobacter, p. Proteus, p. Pseudomonas, p. Spirillum и др. Микробы воды участвуют в самоочищении водоемов. Они расщепляют органические вещества и делают их пригодными для усвоения другими организмами. Они являются также пищей для раков и моллюсков. Больше всего микроорганизмов находится в придонных слоях, на дне, в прибрежной зоне (осенью и весной), т.к. на твердых частицах, в пористых материалах задерживаются питательные вещества. Чем больше органических веществ содержится в открытых водоёмах, тем у них более богатая микрофлора. В такой загрязненной органическими веществами воде можно обнаружить клостридии и другие анаэробы, увеличивается также количество аэробов (бактерий, вибрионов, спирохет). В водоёмах, богатых сероводородом, обитают фотосинтезирующие бактерии. Таким образом, микрофлора рек и озёр определяется, в основном, степенью их биологического загрязнения, которое происходит при поступлении в водоемы сточных и промышленных вод. В большой степени она отражает микрофлору почвы около водоёма, т.к. микроорганизмы попадают в воду с частичками пыли, ливневыми, сточными, талыми водами. Микроорганизмы также попадают в водоёмы из организма рыб, гниющих растений, с отбросами и выделениями человека, животных, а также из воздуха. В морях и океанах обитает меньшее количество микробов, чем в пресных водоемах. Это, в основном, солелюбивые (галофильные) и светящиеся микроорганизмы. В воду могут попадать патогенные и условно-патогенные микробы из почвы, вместе со сточными и промышленными водами из населённых пунктов и плавающих судов, при стирке белья, купании лошадей, при попадании в воду трупов грызунов и других животных, погибших от инфекций. Эти бактерии не приспособлены к существованию в воде и через некоторое время погибают. Но определенное время они сохраняются в воде: сальмонеллы – от 2 дней до 3 месяцев, шигеллы 5-9 дней, лептоспиры 7-150 дней, холерный вибрион до нескольких месяцев и даже может размножаться. Таким образом, вода может быть фактором передачи инфекционных заболеваний (брюшного тифа и паратифа, дизентерии, сальмонеллёза, холеры, лептоспироза, полиомиелита, гепатита, туляремии). В связи с этим необходимо проводить санитарно-эпидемиологический контроль состояния воды. Оценка санитарного состояния воды. Критерии санитарного состояния воды. 1. ОБЩАЯ МИКРОБНАЯ ЗАГРЯЗНЕННОСТЬ ВОДЫ. 2. КОЛИЧЕСТВО САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ВОДЫ. Санитарно-показательными микроорганизмами воды являются: а) E. coli, Str. faecalis (свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении); б) p. Citrobacter, p. Enterobacter (свидетельствуют о сравнительно давнем фекальном загрязнении). Показатели санитарного состояния воды. 1. ОБЩЕЕ МИКРОБНОЕ ЧИСЛО (ОМЧ) ВОДЫ – общее количество микроорганизмов в 1 мл воды. 2. КОЛИ-ТИТР, КОЛИ-ИНДЕКС, ТИТР ЭНТЕРОКОККА и др. (оценивают количество санитарно-показательных микробов). КОЛИ-ИНДЕКС – число жизнеспособных клеток E. coli в 1 л воды. КОЛИ-ТИТР – наименьший объём воды в мл, в котором определяется хоть одна жизнеспособная клетка E. coli. Методы определения. Для оценки санитарного состояния исследуют: 1) водопроводную воду; 2) дистиллированную воду; 3) воду открытых водоемов. Определение ОМЧ водопроводной воды: а) берут не менее 500 мл воды с соблюдением асептики (обжигают краны, используют стерильную посуду); б) делают посев 10-кратных разведений воды (1:10, 1:100 и т.д.) в чашки Петри по 1 мл глубинным методом Коха на МПА (для бактерий) и на сусло-агар (для грибов); в) инкубируют при 37 С, 24 час для бактерий и при 24 С, 2-3 суток для грибов; г) считают число колоний (1 колония – 1 клетка); г) число колоний (1 колония=1 клетка) умножают на степень разведения и получают микробное число воды (т.к. объем посева - 1 мл, а ОМЧ воды – число микроорганизмов в 1 мл воды). Определение микробного числа дистиллированной воды. 300 мл воды отбирают в стерильные бутылки из бюретки, которую обжигают ваткой, смоченной спиртом. Бутылки закрывают ватными пробками и бумажными колпачками. Дистиллированную воду для приготовления инъекционных растворов, отбирают в стерильные флаконы по 15- 20 мл из ёмкостей, в которых проводится стерилизация. Посев и расчет производят так же, как и при исследовании водопроводной воды. Определение микробного числа речной воды. 100 мл воды берутпри помощи батометра с определенной глубины. Делают посевы 1,0; 0,1 и 0,001 мл так же, как и при исследовании водопроводной воды. Определение коли-титра и коли-индекса. Разработаны стандарты определения этих показателей для водопроводной воды и воды артезианских скважин. Для воды открытых водоемов стандарты не разработаны и для ее анализа используют разные методы в зависимости от загрязнения воды. Для определения коли-титра воды чаще используют двухфазный бродильный метод. Двухфазный бродильный метод. Первый этап (1-ый день) – делают посев на среду Эйкмана (глюкозопептонная среда – ГПС) с поплавками для сбора газа и посевы ставят в термостат (инкубируют) при 43 C на 24 часа. Для посева малых объёмов воды используется разведённая среда Эйкмана (1% пептон; 0,4% NaCl; 0,5% глюкоза). Для посева больших объёмов – концентрированная среда Эйкмана, содержащая 10- кратную концентрацию основных компонентов. Концентрированную среду Эйкмана используют для анализа водопроводной воды. Делают посев двух проб воды по 100 мл в колбы с 10 мл среды и десяти проб по 10 мл воды в пробирки с 1 мл среды. Таким образом, объем засеянной воды – 300 мл: 2 колбы по 100 мл и 10 пробирок по 10 мл. Второй этап (2-ой день) – делают пересевы на среду Эндо и РДА (розолово- дифференциальный агар) из тех колб и пробирок, где наблюдается рост. Признаки роста E. coli на среде Эйкмана - диффузное помутнение и образование газа. Посевы инкубируют при 37 C 24 часа. Третий этап (3-ий день) – просматривают посевы на среде Эндо и РДА. Признаки роста E. coli на среде Эндо - образование гладких колоний красного цвета, с металлическим блеском. Признаки роста E. coli на РДА - пожелтение среды, вспенивание конденсационной жидкости и разрывы в РДА. Проводят микроскопическое подтверждение E. coli: из подозрительных колоний делают мазки и окрашивают по Граму; под микроскопом наблюдают грам «-» мелкие палочки. Проводят биохимическое подтверждение E. coli - оксидазный тест на цитохромоксидазу. Если есть цитохромоксидаза - бумажка синеет в течение 1 минуты. E. coli - оксидазоотрицательная. Оксидазный тест позволяет отличить E. coli от грамотрицательных, но оксидазоположительных бактерий семейства Pseudomonadaceae. Если обнаруживают в мазках грам «-» мелкие палочки, которые являются оксидазоотрицательными, результат анализа считается положительным (вывод: обнаружена кишечная палочка). По количеству положительных проб по специальным таблицам ГОСТа 18963-73 определяют коли-титр и коли-индекс. Например, E. coli обнаружена в одной колбе и в трёх пробирках. Ищем в таблице по вертикали 1 и горизонтали 3. На пересечении находим коли-титр 56 и коли-индекс 18. Если проводят определение коли-титра воды открытых водоемов, то для анализа используют разведённую среду Эйкмана, т.к. эта вода более загрязненная, поэтому ее засевают в малых объемах (1 мл воды + 10 мл среды). Дляопределения коли-индекса воды используют метод мембранных фильтров. Метод мембранных фильтров. 1. Воду пропускают через мембранный фильтр №3 (диаметр пор = 0,7 мкм). Мембранные фильтры перед фильтрованием стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной системы Москвы и Санкт-Петербурга и воду артезианских скважин фильтруют в объёме 500 мл, воду других городов – в объёме 333 мл. 2. Фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри. 3. Инкубируют при 37 C в течение суток и подсчитывают количество выросших колоний, типичных для E. coli. 4. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму, а также ставят оксидазный тест. Если в мазках видны грам «-» мелкие палочки, которые являются оксидазоотрицательными, то результат считается положительным. 5. 2-3 такие колонии засевают в разведённую среду Эйкмана и инкубируют в течение суток при 37 C. Если в пробирках имеется газообразование, дают окончательный положительный ответ на наличие E. coli. Коли – индекс рассчитывают по количеству красных колоний на фильтре. Например, на фильтре выросли 3 окрашенные колонии, а воды было 300 мл. Следовательно, в 100 мл – 1 клетка E. coli, а в 1000 мл – 10 клеток, т.е. коли-индекс равен 10. Исходя из этого значения коли-индекса, рассчитываем коли-титр: 1000/10 = 100. Если коли-индекс равен 5, то коли-титр равен 1000/5=200. Нормативы по коли-титру и коли-индексу воды. Таблица . Коли-титр Коли-индекс Водопроводная вода г. Москва и Санкт- Петербург Не менее 500 Не более 2 Водопроводная вода других крупных городов Не менее 333 Не более 3 Вода открытых водоёмов 111 9 Микробное число водопроводной воды не должно превышать 50, а дистиллированной воды, используемой для приготовления лекарств, не должно превышать 10-15. Микрофлора воздуха. Воздух является неблагоприятной средой для микроорганизмов. Отсутствие питательных веществ, влаги, оптимальной температуры, губительное действие солнечных лучей и высушивания приводят к быстрой гибели микробов в воздухе. Но некоторые виды могут сохраняться в воздухе достаточно долго. Их распространение в воздухе связано с образованием в нём аэрозоля – системы из воздуха, капель жидкости и твёрдых частиц. Микроорганизмы адсорбируются на частицах аэрозоля и оказываются надёжно защищёнными от губительного действия УФ-лучей. В воздухе могут встречаться до 100 видов сапрофитных микроорганизмов: пигментообразующие бактерии (микрококки, жёлтая сарцина, палочка чудесной крови и др.), спорообразующие микробы (дрожжи, плесневые грибы, актиномицеты), споровые палочки (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus), которые наиболее устойчивы к действию прямого солнечного света и высушивания. Количество микробов в воздухе открытого воздушного пространства колеблется от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч в 1 мм 3 . Это зависит от степени загрязнённости воздуха частицами пыли, от температуры, от характера местности, осадков, влажности, от населённости, от времени года и т.д. Чем выше концентрация в воздухе пыли, дыма, копоти, тем больше микробов, т.к. каждая частица адсорбирует на поверхности множество микроорганизмов. Микрофлора открытого воздушного пространства в основном отражает микрофлору почвы, т.к. в воздух микроорганизмы попадают с поверхности почвы с пылью. Воздух больших городов содержит большие количества микроорганизмов, а воздух лесов, гор, полей, лугов и также воздух над водной поверхностью отличается сравнительной чистотой. Особенно мало микроорганизмов в воздухе хвойных лесов, над ледяными и снежными просторами Арктики. Летом воздух загрязнён больше, чем зимой. Атмосферные осадки способствуют очищению воздуха от микробов. Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений. Количество микробов в воздухе закрытых помещений зависит от их объёма, частоты проветривания, качества уборки, степени освещённости, нахождения в них людей и др. Воздух закрытых помещений отражает, в основном, микрофлору организмов людей и животных, находящихся в этих помещениях. Микроорганизмы попадают в воздух с поверхности тела (с чешуйками кожи) и через верхние дыхательные пути при разговоре, кашле, чихании. В результате в воздух попадают и патогенные микроорганизмы: гноеродные кокки, микобактерии туберкулёза, дифтерийная палочка, палочка коклюша, сибиреязвенная бацилла, стрептококки, бактерии туляремии, риккетсии и другие. Некоторое время они могут находиться в воздухе, что связано с их устойчивостью к высушиванию и действию УФ-лучей. Через воздух они могут передаваться вместе с каплями слизи и мокроты при чихании, кашле, разговоре. В связи с этим воздух может быть фактором передачи ряда инфекций: гриппа, кори, скарлатины, дифтерии, туберкулёза, коклюша, стрептококковых, стафилококковых и менингококковых инфекций, ангины, оспы, лёгочная форма чумы и др. Поэтому проводится санитарно-бактериологический контроль состояния воздуха, особенно в больничных и детских учреждениях, в аптеках. Оценка санитарного состояния воздуха. Состояние атмосферного воздуха оценивается по микробному числу . Критерии оценки санитарного состояния воздуха закрытых помещений. 1. ОБЩАЯ МИКРОБНАЯ ЗАГРЯЗНЕННОСТЬ. 2. КОЛИЧЕСТВО САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ ВОЗДУХА. Cанитарно-показательными микробами воздуха закрытых помещений являются: 1) золотистый стафилококк - S. aureus; 2) -зеленящий стрептококк - Str. viridans; 3) -гемолитический стрептококк - Str. haemolyticus. Эти бактерии являются показателями орально-капельного загрязнения. Они имеют общий путь выделения в окружающую среду с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путём. Сроки выживания их в окружающей среде не отличаются от сроков, характерных для большинства возбудителей воздушно- капельных инфекций. Показатели санитарного состояния воздуха. 1. МИКРОБНОЕ ЧИСЛО ВОЗДУХА - общее количество микробов в 1м 3 (1000 литров) воздуха. 2. КОЛИЧЕСТВО САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ В 250 ЛИТРАХ ВОЗДУХА. Методы определения показателей микробной загрязненности воздуха. Методы делятся на седиментационные и аспирационные. 1. Седиментационный метод Коха - наиболее простой метод. Он используется только для ориентировочного анализа. Посев воздуха делают так: чашку Петри с определенной плотной питательной средой оставляют открытой в течение определённого времени и микробы оседают из воздуха на поверхность среды. Затем чашки Петри с посевом инкубируют в термостате и подсчитывают число колоний, зная, что 1 колония – 1 клетка. Микробное число воздуха или количество санитарно-показательных микробов подсчитывают, пользуясь правилом Омелянского: на поверхность питательной среды площадью 100 см 2 за 5 мин оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха. 2. |