лекции по микробиологии. Курс лекций по микробиологии пятигорск, 2008 Империя Доклеточные Империя Клеточные Надцарство Эукариоты
 Скачать 1.67 Mb.
|
|
для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37 С 24 часа. Третий этап (3-ий день): проделывают работу по идентификации (определение вида) культуры и проверяют чистоту культуры. Для определения вида изучают морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства: а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом); б) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; если культура чистая, то обнаруживают одинаковые морфологические и тинкториальные клетки; в) делают посев на среды Гисса и МПБ для изучения сахаролитических и протеолитических свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37 С на 24 часа. По совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств делают вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры бактерий. При необходимости изучают и другие признаки (факторы вирулентности, антигенную структуру, чувствительность к фагам и др.). В бактериологической практике установление вида возбудителя позволяет поставить диагноз заболевания, поэтому выделение и идентификация чистой культуры - это и естьбактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Постановка этого метода обязательно включает и определение чувствительности выделенной чистой культуры возбудителя к антибиотикам (определение антибиотикограммы). Выделение чистой культуры анаэробных бактерий также осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом и идентификацией. Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше). Три этапа: Первый день. Делают посев (земля, гной) на среду Китта-Тароцци. Второй день: для получения колоний делают пересев со среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца. Третий день: колонии пересевают в пробирку с новой средой Китта-Тароцци для накопления чистой культуры; проводят идентификацию чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам. Посев по методу Цейсслера. Каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци последовательно засевают в три чашки Петри с кровяным агаром. Посевы ставят в анаэростат или аппарат Аристовского, которые ставят в термостат. На следующий день на третьей чашке вырастают отдельные колонии. Делают пересев этих колоний на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов. Посев по методу Вейнберга. Пастеровской пипеткой переносят материал со среды Китта-Тароцци последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, погружая пипетку в расплавленный агар до самого дна пробирки. Пробирки быстро охлаждают под холодной водой. Агар застывает и разобщает микробные клетки в глубине агара. Из этих клеток вырастают колонии, которые пересевают в новую среду Китта-Тароцци, накапливают чистую культуру и идентифицируют. Культивирование вирусов. Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий. Методы культивирования. 1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека. 2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений. 3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток. Бывают культуры растущих тканей и переживающих тканей (утративших способность к росту). Существуют три типа растущих тканевых культур: а) однослойные тканевые культуры – клетки прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя по поверхности стекла лабораторной посуды; б) культуры суспензированных клеток – клетки растут и размножаются во взвешенном состоянии; в) органные культуры - кусочки органов животных и человека, выращиваемые вне организма. Однослойные культуры – основные культуры. Различают: а) первичные – клетки этой культуры делятся один раз, поэтому каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани; чаще всего используют эмбриональные ткани и опухолевые ткани взрослого человека; б) полуперевиваемые – клетки делятся до 50 раз, сохраняя диплоидный набор хромосом; их можно перевивать несколько раз; используют диплоидные клетки человека (фибробласты человеческого эмбриона, диплоидные клетки легких человека); в) перевиваемые – клетки культуры постоянно делятся в условиях in vitro (вне организма), поэтому их можно перевивать непрерывно; их готовят из линий клеток, которые хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых клеток. Получено около 200 штаммов таких клеток: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д. Первичные и перевиваемые линии клеточных культур могут быть загрязнены неизвестными вирусами, в том числе онкогенными, это ограничивает их применение, особенно в производстве вакцин. Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики. К культуре клеток добавляют антибиотики против бактериального загрязнения. Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре. Вирусы можно обнаружить следующим образом. 1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом ( 8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток. 2. По образованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом. 3. По гемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;. 4. По реакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются. 5. По "цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды. Особенности культивирования риккетсий и хламидий. Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются: а) тканевые культуры (описаны выше); б) куриные эмбрионы; в) лабораторные животные. Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37 С 10-14 дней или на Тироде- сывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37 С 6-10 дней. Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе. Эмбрион заражают в полость желточного мешка или на хорион-аллантоисную оболочку. Зараженные яйца помещают в термостат при 37 С на 6-7 дней. Этот метод используется при изготовлении вакцин и диагностических препаратов из риккетсий. Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий. Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга. Для этого платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров. Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа. ЛЕКЦИЯ № 7 Микрофлора почвы, воды, воздуха. Санитарно-показательные микроорганизмы. Методы санитарно-бактериологических исследований почвы, воды, воздуха. Микроорганизмы широко распространены в природе: в воздухе, воде, почве, на предметах, в организме растений, животных и человека. Из организма человека и животных в окружающую среду (в почву, воду, воздух и др.) попадают условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Попадают, в основном, 2-мя путями: 1) фекальный (с испражнениями из кишечника); 2) воздушно- капельный (с капельками слизи из дыхательных путей). Загрязнение окружающей среды патогенными микроорганизмами делает ее фактором передачи инфекционных заболеваний. Для определения в окружающей среде микроорганизмов, которые отрицательно влияют на здоровье человека, проводится санитарно-бактериологическое исследование почвы, воды, воздуха. Методы исследования разрабатывает санитарная микробиология. Определение в объектах среды патогенных микроорганизмов затруднительно, т.к. они находятся в среде временно, в небольшом количестве, а методы их определения длительные и трудоемкие. Поэтому для оценки санитарного состояния среды применяют: 1) определение общей микробной загрязненности; 2) определение санитарно-показательных микроорганизмов. Санитарно-показательные микроорганизмы – представители нормальной микрофлоры кишечника и дыхательных путей человека и теплокровных животных. Эти микроорганизмы обладают следующими свойствами: 1) выделяются в среду теми же путями, что и патогенные микробы (с испражнениями из кишечника и с капельками слизи из дыхательных путей); 2) сохраняются в среде те же сроки, что и патогенныемикробы; 3) живут только в организме человека или животных и не имеют других мест обитания; 4) не размножаются в среде, поэтому их количество постоянно некоторое время после попадания в среду; 5) методы их определения легкие и доступные (их содержание можно оценить количественно); 6) обладают стабильными и типичными свойствами, поэтому их легко отличить от других видов. Таким образом, санитарно-показательные микроорганизмы свидетельствуют о загрязненности окружающей среды выделениями (испражнениями, мокротой и пр.) человека и животных. Если в объектах среды повышается количество санитарно-показательных микробов, то повышается вероятность присутствия в них патогенных и условно- патогенных микробов. Для разных объектов окружающей среды выбраны определенные санитарно- показательные микробы. Микрофлора почвы. В почве обитает очень много микроорганизмов, т.к. в почве имеются благоприятные условия для их жизнедеятельности (питательные вещества, вода, защищённость от солнечных лучей). В почве обитают бактерии, грибы, лишайники, простейшие, бактериофаги, водоросли, вирусы. Почвенные бактерии: а) аммонифицирующие бактерии, которые разлагают белки (p. Pseudomonas, p. Proteus, p. Bacillus); б) азотфиксирующие бактерии (p. Azotobacter, Azomonas, Mycobacter); в) нитрифицирующие (p. Thiobacillus); г) клубеньковые (p. Rhizobium); д) серо- и железобактерии. Состав микрофлоры почвы зависит от плодородия почвы, рН, температуры, освещения, количества влаги, способов обработки почвы, времени года и других факторов. Больше всего микроорганизмов находится в культурной почве, на юге, летом, на глубине 10-20 см. Вместе с испражнениями, мочой, с отбросами и трупами животных и человека в почву попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных, патогенные и условно-патогенные микробы: кишечная палочка, Str. faecalis, возбудители брюшного тифа, сальмонеллёзов, дизентерии, возбудители холеры, клостридии газовой гангрены (C. Perfringens).. В почве они через некоторое время погибают по различным причинам (недостаток питательных веществ, высыхания, действия света). Основная причина - антагонизм постоянных обитателей почвы (бактерий, актиномицетов, грибов). Но некоторое время они сохраняются в почве. Сроки выживания – от нескольких дней до нескольких месяцев. Долго сохраняются в почве споры. Споры возбудителя сибирской язвы (Bac. anthracis), столбняка (Clostridium tetani), ботулизма (C. botulinum), газовой гангрены (C. perfringens и т.д.) сохраняются в почве в течение нескольких лет. Таким образом, почва является фактором передачи инфекционных заболеваний. В связи с этим проводят санитарно-бактериологический контроль состояния почвы. Оценка санитарного состояния почвы. Критерии санитарного состояния почвы. 1. ОБЩАЯ МИКРОБНАЯ ЗАГРЯЗНЕННОСТЬ ПОЧВЫ. 2. КОЛИЧЕСТВО САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЧВЫ. Санитарно-показательными микроорганизмами почвы являются: а) E. сoli (а также бактерии группы кишечной палочки (БГКП) - p. Citrobacter, p. Enterobacter, p. Klebsiella); б) Str. faecalis; в) C. perfringens. Эти бактерии имеют общий путь выведения с возбудителями кишечных инфекций (с фекалиями) и служат показателями фекальной загрязнённости почвы. Показатели санитарного состояния почвы. 1. ОБЩЕЕ МИКРОБНОЕ ЧИСЛО (ОМЧ) ПОЧВЫ - общее количество микроорганизмов в 1 г почвы. 2. КОЛИ-ТИТР ПОЧВЫ, ПЕРФРИНГЕНС-ТИТР ПОЧВЫ и др. (оценивают количество санитарно-показательных микробов почвы). КОЛИ-ТИТР ПОЧВЫ – наименьшее количество почвы в граммах, в котором определяется хоть одна жизнеспособная клетка кишечной палочки – E.coli. ПЕРФРИНГЕНС-ТИТР ПОЧВЫ - наименьшее количество почвы в граммах, в котором определяется хоть одна жизнеспособная клетка возбудителя газовой гангрены - C. perfringens. Методы определения. 1. Определение ОМЧ почвы: а) посев 10-кратных разведений почвы (1:10, 1:100 и т.д.) в чашки Петри на МПА (для бактерий) и на сусло-агар или среду Сабуро (для грибов); посев можно делать в глубину (1 мл) или на поверхность (0,1 мл) среды; б) инкубация посевов (48 час) при 24 С для грибов и при 37 С для бактерий; в) подсчет числа колоний для каждого разведения; в) расчет микробного числа почвы (с учетом навески почвы, разведения, объема посева), зная, что 1 колония – это 1 клетка. 2. Определение коли-титра почвы: а) посев 10-кратных разведений почвы на жидкую среду Кесслера (содержит желчь, лактозу, пептон, генциановый фиолетовый, |