лекции по микробиологии. Курс лекций по микробиологии пятигорск, 2008 Империя Доклеточные Империя Клеточные Надцарство Эукариоты
 Скачать 1.67 Mb.
|
|
Облигатные аэробы - бактерии, которые могут расти только при наличии кислорода. К ним относятся бруцеллы, микрококки, микобактерии туберкулеза (для роста необходимо около 20% кислорода). 2. Облигатные анаэробы - бактерии, которые растут только при отсутствии кислорода (в анаэробных условиях). Для облигатных анаэробов кислород токсичен, т.к. у них отсутствуют ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза), нейтрализующие перекисные радикалы кислорода. К облигатным анаэробам относятся возбудители ботулизма, газовой гангрены, столбняка. Для них характерно сульфатное дыхание, при котором акцептором водорода являются сульфаты, восстанавливающиеся до H 2 S. При выращивании таких бактерий необходимо создавать анаэробные условия. 3. Факультативные анаэробы - бактерии, которые могут расти как при наличии, так и отсутствии кислорода, т.к. они способны переключаться с анаэробного дыхания на аэробное дыхание. К ним относится большинство патогенных и сапрофитных бактерий (E. coli и др.). Для них характерно нитратное дыхание, при котором акцептором водорода являются нитраты, восстанавливающиеся до N 2 и NH 3 Размножение и рост бактерий. Размножение – увеличение числа особей. Способы размножения бактерий: а) деление клетки на 2 части (бинарное деление); б) почкование; в) распад нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты). Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Культивирование (выращивание) бактерий в такой среде называют периодическим, а культуру – периодической. Если при культивировании непрерывно подается свежая питательная среда, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной. Рост периодической культуры на жидкой питательной среде разделяют на несколько фаз:. I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения; II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий и рост количества клеток; III фаза – фаза стационарного роста – количество клеток не меняется и равно максимальной концентрации (М-концентрация); IV фаза – фаза гибели - снижение количества живых клеток; V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток – клетки переходят в состояние покоя. На жидких питательных средах рост бактерий может быть: а) поверхностным – образование пленки; б) диффузным – равномерное помутнение среды; в) придонным – образование осадка. На плотной питательной среде бактерии образуют колонии. Колониия– это макроскопическое скопление микробов одного вида, образовавшееся из одной клетки. Колонии бывают разными по размеру, форме, цвету, поверхности, форме края, консистенции, структуре. По размеру колонии бывают крупные (более 5 мм), средние (2 -4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (менее 1 мм). Форма бывает круглая, неправильная, ризоидная, звездчатая и др. Поверхность – гладкая, шероховатая, морщинистая, матовая, блестящая, сухая, влажная, выпуклая, плоская и др. Края – ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и др. Цвет – безцветные, белые, желтые, оранжевые, красные, розовые и др. Консистенция – слизистая, волокнистая, мягкая, плотная, хрупкая и др. Структура – прозрачная, непрозрачная, однородная (гомогенная), неоднородная (гетерогенная) и др. Колонии, имеющие округлую форму, ровные края и гладкую поверхность – колонии S-формы. Колонии с неровными краями и шероховатой поверхностью – колонии R-формы. S-форма характерна для вирулентных бактерий. R-форма – для авирулентных (исключение: возбудители сибирской язвы, чумы, туберкулеза и дифтерии). Характер роста бактерий на жидких и плотных питательных средах называется культуральными свойствами бактерий. Ферменты бактерий. Ферменты – это биологические катализаторы (повышают скорость химических реакций). По химической природе они являются белками. Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций: - 1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции; - 2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от одних соединений к другим; - 3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления веществ на более простые соединения с участием воды; - 4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем; - 5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры; - 6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых соединений. Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Эндоферментыкатализируют процессы внутри клетки. Экзоферменты выделяются бактериями в окружающую среду. Это ферменты: а) пищеварительные ферменты, которые расщепляют сложные питательные вещества до простых веществ; б) защитные ферменты, например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий; - гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту; - дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток; - фибринолизин – расщепляет коллаген; - плазмокоагулаза – свертывает плазму крови; - нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту; - лецитовителлаза – расщепляет лецитин. Методы изучения ферментативной активности бактерий. Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз. Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО). Каталаза – фермент, расщепляющий Н 2 О 2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н 2 О 2 Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание. Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами. Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО 2 или Н 2 ), а при распаде белков - образование щелочей, H 2 S, NH 3 Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий. Изучение сахаролитических свойств. Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса. Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор. Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии. Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого. Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов. Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно- желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется. Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде. Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом". Изучение протеолитических свойств. Протеолитические свойства бактерий изучают: а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа; б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н 2 S, NH 3 Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н 2 S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH 3 – лакмусовая бумажка (синий цвет). Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др. ЛЕКЦИЯ № 6 Культивирование бактерий и вирусов. Культивирование – искусственное выращивание микроорганизмов. Используется для изучения свойств микроорганизмов и для диагностики инфекционных заболеваний. Культивирование бактерий. Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О 2 ) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час). Требования к питательным средам. а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества; б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4; в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды; г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки; д) быть стерильными для получения чистой культуры; е) содержать достаточное количество Н 2 О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии; ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH 2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5; з) быть прозрачными; Классификация питательных сред. По консистенции среды делят на: а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ); б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.; в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка; г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок; д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью; Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100 С и застывают при 45 С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%. По составу среды делят на: а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови; б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ; в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях. По назначению среды делят на: а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред; б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ; в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза); г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого. Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет. Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет. Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов). Эти среды используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволяют отличить патогенные микроорганизмы от кишечной палочки (см. лекцию №5).. Среды Гисса служат для изучения сахаролитических свойствах микробов (см. лекцию №5 Методы создания бескислородных условий для культивирование анаэробов. Для создания бескислородных условий используются физические, химические и биологические методы. Физические методы: 1) посев в глубину плотных питательных сред (кровяной или сахарный агар): а)посев уколом в высокий столбик агара (анаэробы вырастают в глубине посева); б) посев в трубках Виньяля-Вейона; 2) выращивание на специальных средах: на среде Китта-Тароцци (жидкая питательная среда - 0,5 % глюкоза, кусочки животных тканей, например, печени, которая связывает кислород). Перед посевом среду кипятят и быстро охлаждают. После посева заливают слоем стерильного вазелинового масла. в) выращивание в анаэростатах – специальный сосуд, из которого удален кислород. Анаэростат – толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой с резиновой прокладкой. В него ставят чашки Петри (крышкой вверх) с посевами и удаляют воздух или вытесняют инертным газом. Химические методы - поглощение кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (аппарате Аристовского) химическими веществами (такими как щелочной пирогаллол или гидросульфит натрия). Биологические методы (метод Фортнера) - совместное выращивание анаэробов и аэробов. После посева чашки Петри герметически закрывают пластилином или парафином. Вначале в чашке Петри размножаются аэробы, а когда весь кислород используется, начинают расти анаэробы. Выделение чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий. Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде. Выделение чистой культуры – бактериологический метод. Этот метод является основным методом диагностики бактериальных инфекций. Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. Чаще всего используются механические способы отделения клеток– специальные методы посева: а) посев шпателем по Дригальскому в три чашки Петри; на третьей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – один вид, т.к. колония – потомство одной клетки; б) посев петлей "штрихами" или "сеткой": делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии; Таким образом, при помощи специальных методов посева получают изолированные колонии разных видов бактерий. Выделение чистой культуры проводят в три этапа: Первый этап (1-ый день): а) из материала (смесь бактерий разных видов) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; б) делают посев материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37 С на 24-48 часов. Второй этап (2-ой день): а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция); б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать один вид бактерий); в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА |