Курслекций по дисциплине в. Од. 1 Ветеринарная микробиология, вирусология
 Скачать 1.08 Mb.
|
|
Приготовление микроскопических препаратов. Для микроскопического иссле- дования с целью выявления форм микробов и их, структурных и некоторых биохимических особенностей препарат готовят на предметном стекле. В качестве материала применяют взвеси бактерий, непосредственно бактериальную культуру, выросшую на жидкой или плот- ной среде, молоко, кровь, гной (препарат - мазок); кроме того, используют отпечатки ткани печени, селезенки или других органов (препарат-отпечаток). Для приготовления препарата на рабочем столе должно быть: исследуемый материал (взвесь бактерий, микробные культуры, гной и др.), обезжиренные предметные стекла, бак- териологическая петля, газовая (или спиртовая) горелка, бутыль (с сифоном) дистиллиро- ванной воды, сливная чашка с «мостиком» (рис. 8), красители, фиксирующие и протравли- вающие жидкости. Из жидкой микробной культуры (или гноя) для приготовления препарата-мазка в левой руке держат пробирку с названным материалом, в правой - бактериологическую петлю (как пи- шущее перо), тщательно прожигают ее на пламени горелки и, не выпуская из рук осторожно около пламени открывают пробирку свободными пальцами правой руки (мизинцем и безы- мянным), петлей захватывают каплю материала, пробирку закрывают и ставят в штатив. Свободной левой рукой берут предметное стекло, наносят на его поверхность каплю и лег- кими круговыми движениями растирают по стеклу, затем препарат высушивают на воздухе, петлю прожигают. Высохший препарат фиксируют, - закрепляют на стекле. Для этого чаще пользуются физическим способом: препарат (обратной стороной мазка) 2-3 раза слегка про- водят над пламенем горелки. Из фиксирующих химических средств используют эфир, этило- вый или метиловый спирт, формалин, смеси формалин-спирт, спирт-эфир. Для фиксации вы- сушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью (или 1-2 капли жид- кости наносят на препарат) и выдерживают 3-5 минут. Затем мазок промывают, высушивают фильтровальной бумагой. С обратной стороны стекла препарата восковым цветным каранда- шом обводят границу (зону) мазка, чтобы после окраски точно знать место его нахождения. Для приготовления препарата из бактериальной культуры, выросшей на плотной среде, на предметное стекло петлей наносят каплю стерильного физиологического раствора, затем, прокалив петлю на огне, берут ею очень небольшое количество микробной массы из пробирки с поверхности среды и аккуратно растирают в капле физиологического раствора на предметном стекле тонким равномерным слоем. В остальном поступают, как описано выше. Простой метод окраски. При простом методе окраски используют только один какой- либо краситель. На фиксированный препарат, помещенный на «мостике» над сливной чаш- кой, наливают раствор либо метиленовой синьки (окрашивают 4-5 мин.), либо карболовый фуксин Пфейффера (1-2 мин.) или карболовый генцианвиолет (1-2 мин.). Краску смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой. На готовый препарат нано- сят каплю иммерсионного масла, помещают на предметный столик и микроскопируют. Окрашивание микроорганизмов. Для окраски микроорганизмов используют анили- новые красители (основные, кислые, и нейтральные). Наибольшее применение имеют основ- ные краски — метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый и др.; для окраски препаратов готовят спиртовые, водные и водно-спиртовые растворы, в некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Окраска микроорганизмов — это сложный физико-химический процесс, обусловлен- ный механизмами электроадсорбции, капиллярности, химического сродства между красите- лем и объектом. Основные красители состоят из окрашивающего катиона и бесцветного аниона. Поскольку бактерии обладают поверхностным отрицательным зарядом и в них со- держатся соединения кислой природы (нуклеиновые кислоты), основные красители характе- ризуются большим сродством к клеткам, чем кислые краски, и поэтому широко используют- ся в микробиологии. Некоторые красители характеризуются избирательным химическим сродством к от- дельным компонентам клетки (ядерному веществу, включениям) и применяются для их вы- явления.Так, зерна волютина хорошо красятся хризоидином, метиленовым синим, зерна гра- нулезы и гликогена — раствором йода, зерна жира — суданом III. Способность микроорга- низмов к окрашиванию называется тинкториальным свойством. При светлопольной микроскопии фиксированные окрашенные препараты имеют ряд преимуществ перед прижизненными: высокую контрастность; возможность дифференциро- ванного выявления клеточных структур; безопасность работы; длительность сохранения препарата. Метод исследования окрашенных препаратов широко применяется при качественных и количественных микробиологических исследованиях. Сложные методы окраски отличаются от простых тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях используют еще специальные реактивы (рас- твор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсутствие) отдельных структурных элементов и некоторых органических соединений клетки, чем и оп- ределяют тинкториальные свойства каждого вида микроба. Окраска по методу Грама. Окраска бактерий по методу Грама является диф- ференциальной и широко используется для определения их видовой принадлежности. По способности окрашиваться по методу Грама все бактерии делятся на две группы: грамполо- жительные (гр+) и грамотрицательные (гр-). Грамположительные бактерии удерживают комплекс красителя генцианового фиолетового с йодом при обработке спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет; грамотрицательные бактерии не обладают такой способ- ностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином они приобрета- ют красную окраску. Способность бактерий окрашиваться по Граму в настоящее время связывают с моле- кулярной организацией и химическим составом клеточной стенки бактерий. Техника окраски по Граму (в модификации Синева) состоит в следующем: 1. на фиксированный мазок кладут сухую фильтровальную бумагу, пропитанную генциано- вым фиолетовым, наносят на бумагу 2-3 капли дистиллированной воды и окрашивают в те- чение 2 мин; 2. снимают бумагу и, не промывая препарат водой, наносят на мазок 2-3 капли раствора Лю- голя, выдерживают реактив 1-2 мин; 3. сливают раствор Люголя и для обесцвечивания наносят на мазок этиловый спирт 96° на 30 с; 4. промывают препарат водой; 5. для дополнительной окраски наливают на мазок водный раствор фуксина на 1 мин; 6. промывают препарат водой, промокают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсионным объективом. Бактерии, окрашенные в синий цвет - грамположительны, в красный — грамотрица- тельны. Окраска спор бактерий Палочковидные микробы, образующие во внешней среде (поч- ве, воде, кормах, на питательных средах) стойкую форму существования - спор называются бациллами. При спорообразовании под влиянием неблагоприятных условий в клетке проис- ходят процессы, обуславливающие сгущение цитоплазмы, уменьшение свободной воды (до 40 %). Цитоплазматическое содержимое покрывается многослойными оболочками, химиче- ский состав которых обеспечивает высокую стойкость споры к нагреванию, высушиванию, действию многих кислот, щелочей, красителей. При законченном спорообразовании спора лежит свободно, без остатков вегетативной клетки; при не законченном процессе спора, в зависимости от вида микроба, располагается либо в центре клетке, либо на конце (терми- нально) или между концом и центром клетки (субтерминально) (рис. 10). При микроскопиро- вании препаратов, окрашенных простым методом или по Граму, видна окрашенная вегета- тивная часть клетки и не окрашенные, хорошо преломляющие свет, споры. Споры окрашиваются специальными методами. Метод Ауески. Высушенный на возду- хе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5%-ной соляной кислотой с подогреванием (2-3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламенем. Затем на препарат кладут листочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров 7-8 мин. краску сливают, препарат обрабатывают 5-7сек с 5% рас- твором серной кислоты, хорошо промывают его водой, дополнительно окрашивают метиле- новой синькой 4-5 мин, опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют под иммерсионной системой. Вегетативная часть клетки - синяя, споры - красные. Метод Мёллера. Фиксированный на пламени препарат протравливают 5%-ной хромовой кислотой 2-3 мин промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой, далее посту- пают, как в предыдущем методе. Результат окраски тот же. Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих 2-х методах, только без протравы. Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синькой с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 10 сек 1%-ным водным раствором нейтральрота, смывают, просушивают. Споры окрашиваются в синий цвет, а вегетативные клетки - в крас- ный. Спорообразующие виды микробов:Вас. anthracis. Cl. septicum, Cl. perfringens.Cl. oеdematiens.Cl. histoliticum, Cl. tetani. Cl. botulinum.Вас. subtilis. Вас. mesenthericus. Вас. cere- us. Вас. megatherium. Вас. mycoides. Cl. sporogenes. Неспорообразующие виды бактерий: Сем. Fnterobacteriaceae (E. Coli. Salmonel- la.Proteus и др.).Pseudomonas acrugenosa. Mycobacterium, brucella.Pasteurella.Erysipelothrix insidiosa, Listeria monocytogenes. Staphylococcus. Streptococcus. Diplococcus. Bact. acidophilus, serratia marsensis. 14 Методы культивирования микроорганизмов. Физиология микроорганизмов — это- раздел микробиологии, изучающий процессы жизнедеятельности микробов. Особенности жизнедеятельности микроорганизмов, т. е. потребности в питательных веществах (тип питания), способ биологического окисления (тип дыхания), реакция клетки на воздействие различных факторов среды обитания, называются физиологическими свойст- вами. Знание физиологических свойств микробов необходимо для понимания их расселения и поведения в природе, использования в народном хозяйстве. В лабораторной практике ис- следование физиологических свойств микробов проводится наряду с морфологическими для идентификации микроорганизмов, т. е. определения их названия. Для исследования физиологических свойств микроорганизмы выращивают в лабора- торных условиях. Развитие микроорганизмов на питательных средах зависит от многих факторов: вида микроба, его возраста и условий выращивания, однако в их размножении можно отметить и определенные закономерности (рис. 19). Скорость деления клеток обычно измеряется мину- тами. Например, у кишечной палочки — 20-30 мин, болезнетворных стафилококков — 30 мин. Обратите внимание на терминологию, которой пользуются при выращивании микро- организмов. Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях называется культиви- рованием, а выращенные на питательной среде микробы — культурой. Культуры, состоящие из различных видов микроорганизмов, называют смешанными; культуры, состоящие из одного вида микробов — чистыми. При специальных способах посева, когда в питательную среду вносится одна клетка, в результате размножения ее образуется совокупность особей, которая называется клон. Если клон развивается на поверхности плотной питательной среды, по мере роста числа особей он образует видимое невооруженным глазом скопление микробов, которое называется коло- нией. Микроорганизмы одного вида, выделенные из определенного источника внешней среды (из организма человека, животного, пищевого продукта и т. д.), называют штаммом. Например, если стафилококк одного вида выделен из пяти источников (пяти разных порций продукта, от пяти разных человек и т. д.), считают, что получено пять штаммов данного вида стафилококка. На занятиях по данной теме рассматриваются условия выращивания микроорганиз- мов и методы выделения чистой культуры (одного вида) из смеси микробов. Питательные среды. Микроорганизмы, выращенные в лабораторных условиях, назы- вают микробными культурами. Оптимальный температурный режим для разных групп мик- робов неодинаковый (37-38°, 26-30°, 22-25°). В условиях большого объема работы (биофаб- рики) имеются термостатные комнаты. Выращивание (культивирование) микроорганизмов широко применяется для выделения, накопления и сохранения их. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают при качественном анализе микрофлоры различных объектов, при количественном анализе — для подсчета жизнеспособных клеток, а в производственных условиях — для накопления полезных человеку микроорганизмов и продуктов их обмена веществ. Среда, используемая в лабораторных условиях для накопления микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, называется питательной. К питательным средам для вы- ращивания микроорганизмов предъявляют определенные требования: они должны содер- жать необходимые питательные вещества в легкоусвояемой форме (азотистые, углеводные, минеральные вещества, витамины), должны быть изотоничны по отношению к микробной клетке, обладать буферными свойствами, иметь оптимальную вязкость и определенный оки- слительно-восстановительный потенциал. Обязательное условие - стерильность питательных сред, поскольку посторонние микроорганизмы изменяют свойства среды и затрудняют куль- тивирование и изучение определенных микробов. Универсальных сред, пригодных для всех видов микроорганизмов, не существует. Отдельные виды микробов в зависимости от особенностей обменных процессов нуждаются в 15 различных питательных веществах и условиях культивирования. В качестве питательной среды в ряде случаев используют натуральные продукты (картофель, молоко и т. д.). Такие среды называются естественными. Однако чаще питатель- ные среды, используемые в лабораторной практике, являются искусственными, т. е. приго- товленными в лаборатории специально для данной цели по определенным рецептам. Питательные среды различны по составу, консистенции и назначению. Состав сред. В микробиологической практике широко применяют так называемые простые (или обычные) среды, пригодные для культивирования многих видов микроорга- низмов. К простым средам для выращивания бактерий относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА). Пептон, мясная вода, входящие в состав этих сред, слу- жат источником азота, углерода, зольных элементов и факторов роста, необходимых для микробной клетки. Простые среды для выращивания микроскопических грибов — неохме- ленное пивное сусло и сусло-агар. Сложные среды готовят, как правило, на основе простых, добавляя к ним питательные вещества, необходимые для более требовательных видов микроорганизмов (например, са- харный бульон, кровяной агар и др.). Консистенция сред. По консистенции питательные среды бывают жидкими, полу- жидкими и плотными. К жидким средам относят мясопептонный бульон, сусло и др. Уплотнение сред дос- тигается добавлением к жидким средам агар-агара и желатина. Агар (по-малайски — желе) - плотный волокнистый материал, получаемый из мор- ских водорослей и образующий в водных растворах плотный гель. Агар растворяется в воде при нагревании и застывает при комнатной температуре. Благодаря способности придавать питательному продукту консистенцию плотного студня и высокой устойчивости к фермента- тивному действию микробов агар широко применяется при изготовлении полужидких (0,5% агара) и плотных (1-2%) питательных сред. Желатин — белковое вещество животного происхождения. Применение его как уп- лотнителя ограничено из-за низкой (22-27 °С) температуры разжижения. Плотными средами являются, например, мясопептонный агар (МПА), сусло-агар (СА), мясопептонный желатин. Назначение сред. В зависимости от задач исследования, кроме простых сред, исполь- зуемых для выращивания многих видов микробов, применяют элективные и дифференци- ально-диагностические среды. Элективные (накопительные) среды обеспечивают преимущественное накопление одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны или вовсе непригодны для раз- вития других. Эти среды были предложены С. Н. Виноградским и О. М. Бейеринковым и ис- пользуются в микробиологической практике для выделения микробов из мест естественного обитания, для получения накопительных культур определенного вида из материала, содер- жащего смешанную микрофлору. Дифференциально - диагностические среды служат для дифференциации различных видов микроорганизмов на основании различий в обменных процессах. В состав этих сред обычно вводят вещества, позволяющие изучить особенности ферментов исследуемых куль- тур. Дифференциально-диагностическими средами пользуются в основном для идентифика- ции неизвестных видов микроорганизмов. К ним относятся среды для определения способ- ности микробов к расщеплению белков (мясопептонный желатин), ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо и др.), гемолитической способности (кровяной агар), восстановительной способности (среды, содержащие красители, обесцвечивающиеся при восстановлении, и др.) и т.д. В настоящее время многие питательные среды изготовляют фабричным способом и выпускают в виде порошка. Для хранения питательных сред и выращивания микроорганизмов обычно использу- ют стеклянную посуду различной вместимости. Основой многих питательных сред животного происхождения является мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжьего мяса, освобожденного от костей, фасций, сухо- 16 жилий. Измельченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1:2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстрагируют 12-24 ч, кипятят 1,5-2 ч, фильтруют, добавляют дистиллированной воды до первоначального объема, разливают в бутыли, колбы, закрывают ватно-марлиевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Простые среды. Мясопептонный бульон (МПБ) — жидкая среда для выращивания бактерий. Для приготовления мясной воды свежее мясо (без костей и сухожилий) измельча- ют в мясорубке, заливают двойным количеством водопроводной воды и нагревают 30 мин слабым огнем при температуре воды 50°С, а затем кипятят в течение часа. Отфильтрованную через ткань массу доводят водой до первоначального объема. К полученной мясной воде до- бавляют 1 % пептона и 0,5% NaCl. Смесь фильтруют, охлаждают, подщелачивают 10%-ным раствором соды до рН 7,2. Для осветления к бульону добавляют взбитый белок куриного яй- ца, смесь нагревают до 100°С и кипятят 20 мин. Горячий бульон фильтруют, разливают в различные емкости и стерилизуют 20 мин в автоклаве при 120° С. МПБ является средой, богатой питательными веществами, но почти не содержит уг- леводов. Поэтому для выращивания более требовательных бактерий готовят так называемый сахарный бульон, добавляя к МПБ 1-2 % углеводов. |