Курслекций по дисциплине в. Од. 1 Ветеринарная микробиология, вирусология
 Скачать 1.08 Mb.
|
|
Мясопептонный агар (МПА) — плотная среда. Для приготовления ее добавляют в МПБ 2% измельченного агара, смесь расплавляют при нагревании, устанавливают рН 7-7,2, фильтруют, разливают по емкостям (пробирки, колбы и др.) и стерилизуют 30 мин при 120°С в автоклаве. Неохмеленное пивное сусло — жидкая среда для плесневых грибов и дрожжей, а также многих ацидофильных бактерий (молочнокислых, уксуснокислых). Для приготовле- ния сусла берут пророщенный ячмень, измельчают его, заливают водой и выдерживают при температуре 55-58° С. При этом под влиянием ферментов зерна происходит осахаривание крахмала и гидролиз белков до аминокислот и полипептидов. Смесь фильтруют и определя- ют содержание сахара ареометром Беллинга, градусы (°Б) которого соответствуют содержа- нию сахара в сусле. До нужной крепости его разбавляют водопроводной водой (для грибов — до 3-4° Б, для дрожжей - 8° Б, для молочнокислых бактерий — 8-12° Б). Стерилизуют со- лодовое сусло паром при 0,5 атм 20-30 мин или дробно 3 дня по 30 мин текучим паром. Сусло-агар (СА) — плотная среда. Готовят ее путем добавления к солодовому суслу 2-2,5 % агара. Расплавляют агар при нагревании, горячий раствор фильтруют через вату, раз- ливают в емкости и стерилизуют 30 мин при 120° С. Элективные среды. Среда Кесслер (для накопления бактерий группы кишечной па- лочки) - жидкая. К 1 л водопроводной воды добавляют 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Смесь кипятят 30 мин на водяной бане, фильтруют, добавляют 25 г глюкозы и до- водят стерильной водой до первоначального объема (до 1 л), устанавливают рН среды 7,4-7,6 и добавляют 2 мл водного раствора генциановый фиолетовый. Готовую среду разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют 10 мин при температуре 120° С в автоклаве. Среда имеет темно-фиолетовый цвет. Среда Кауфмана (для накопления сальмонелл) — жидкая. В мясопептонный бульон добавляют мел, раствор Люголя и серноватистокислого натрия; образующаяся при взаимо- действии этих ингредиентов тетратионовая соль натрия подавляет рост кишечной палочки и способствует росту сальмонелл. Затем к среде добавляют водный раствор бриллиантовой зе- лени и бычьей желчи. Среда дрожжевой экстракт, или дрожжевая вода (для накопления дрожжей). На- веску прессованных дрожжей 70 г измельчают и размешивают в 1 л воды, добавляют 3 г хлороформа (консервант) и выдерживают при 37° С трое суток. Надосадочную жидкость, обогащенную за счет самопереваривания дрожжей, сливают и стерилизуют текучем паром по 20мин в течение 3 дней. Дифференциально-диагностические среды. Среда Гисса - жидкая среда. К 1 % пеп- тонной воды (рН 7) добавляют 0,5 % углевода и несколько капель индикатора Андредэ (1 г кислого фуксина, 32 мл 1 н раствора едкого натрия, 200 мл дистиллированной воды), настаи- вают при комнатной температуре 3 суток и фильтруют. Разливают в пробирки по 5-6 мл, на дно помещают поплавок запаянным концом вверх и стерилизуют текучим паром по 30 мин в 17 течение 3 дней. Промышленность изготовляет сухие среды Гисса, из которых в лаборатории готовят полужидкие среды. Среда Эндо (для дифференциации бактерий группы кишечных палочек) — плотная среда, К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,4-7,6) добавляют 1 г лактозы, разведенной в 3 мл стерильной воды. К. среде добавляют смесь, состоящую из 0,5 см3 10 %-ного раствора ос- новного фуксина и 2,5 см 3 свежеприготовленного 10 %-ного раствора Na 2 SO 3 -7H 2 O. Среду размешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Промышленность изготовляет сухие среды Эндо, которые перед употреблением растворяют. Кровяной МПА применяют для выявления гемолитических свойств бактерий. Пред- варительно в стерильную колбочку со стеклянными бусами асептично берут кровь (у барана, лошади или кролика), встряхивают 15-20 мин, чтобы фибрин отделить от остальной массы крови. Фибрин сгустками осаждается на бусах и дефибринированную (5-10%) стерильно до- бавляют к расплавленному и остуженному МПА.легким вращением колбочки равномерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Среда Козера (определение способности усваивать соли лимонной кислоты — цитра- ты). К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфата натрия аммония, 1 г фосфата ка- лия однозамещенного, 0,2 г сульфата магния, 2,5-3 г цитрата натрия. Раствор стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 мин, прибавляют к нему 10 мл 0,5 %-ного раствора бром- тимолового синего и разливают в стерильные пробирки. Среда Левина. Готовят 2%-ный агар на бульоне Хоттингера, рН 7,2-7,4, стерилизуют в автоклаве. К 100 мл готового расплавленного агара добавляют: 2 мл 0,55-ного раствора ме- тиленовой синьки, 1,5 мл 2%-ного эозина (щелочного бактериологического). 2 г лактозы и 0,2 г двуосновного фосфорного калия (К2НРО4). Растворы красителей готовят на дистиллиро- ванной воде и стерилизуют в аппарате Коха. Раствор метиленовой синьки перед употребле- нием нагревают на паровой бане и добавляют к агару в теплом виде. После добавления этих компонентов среду тщательно перемешивают и разливают в чешки Петри. Среда фиолетово- го цвета. Висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера). МПА (рН 7,5) с индикатором, содер- жащим лимоннокислый висмут, сернокислый натрий, соль Мора (серноаммонийная соль железа), двухосновный фосфорнокислый натрий, глюкозу и бриллиантовую зелень. В настоящее время висмут-сульфит агар (как и агар Эндо, среду Плоскирева) промышленность выпускает в сухом порошкообразном виде. 6 г сухого порошка растворяют в 100 мл дистил- лированной воды, подогревают при непрерывном помешивании, разливают в стерильные пробирки и оставляют в наклонном положении. Применяют также среды с химическими ве- ществами, которые изменяют окраску в результате окислительно-восстановительных (реду- цирующих) процессов, обусловленных ферментами бактерий. Для этого готовят молоко с метиленовой синькой. Свежее обезжиренное коровье молоко подщелачивают двууглекис- лым натром до слабощелочной реакции по лакмусовой бумажке, добавляют 1%-ный раствор метиленовой синьки до голубого окрашивания. Стерилизуют текучим паром дробно. Если есть предположение, что в исследуемом материале небольшое количество бак- терий, то рекомендуют использовать среды накопления (обогащения). Среда Шустовой. К МПА (рН 7.4) добавляют 10% 50%-ного водного раствора гипо- сульфита и 2% раствора Люголя. Применяют для накопления бактерий паратифа. Среда Раппопорт: к МПА добавляют 1% глюкозы, 10% желчи и 1% индикатора Ан- дрэде. Стерилизуют текучим паром. Специальные питательные среды. Бульон Мартена. Свиные желудки (или сычуги рогатого скота) очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке, заливают водой 1:4 и добавляют 1% (к объему жидкости) соляной кислоты. Смесь выдерживают при 50° 24 ч. нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу, автоклавируют при 120° 15 мин. Для приготовления бульона смешивают равные количества воды и получен- ной смеси, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-ным раствором NaOH до рН 7,9. кипятят 30 мин. фильтруют, разливают в пробирки, автоклавируют при 0,5 атм. (110°) 30 мин. Добавление 2% агара обеспечивает получение плотной среды - агар Мартена. Бульон Хоттингера готовят из триптического гидролизата (перевара) мясных отхо- 18 дов - фасций, жира, сухожилий. 1 кг мясных обрезков заливают 2 л кипящей воды, кипятят 5 мин. охлаждают до 45° и добавляют 5,0-10,0 панкреатина, подщелачивают до рН 7,8-8,0 уг- лекислым натром встряхивают и доливают хлороформ (10 мл на 1 л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, ежедневно встряхивая. Полученный перевар подкис- ляют соляной кислотой до рН 5,5. Хранят в темном месте. Для приготовления питательной среды к 1л воды добавляют 100-200 мл полученного перевара, кипятят 1-2 мин, фильтруют, подщелачивают, стерилизуют. Агар Хоттингера готовят так же, как и обычный МПА. Сахарный (глюкозный) бульон (или агар) изготавливают как обычные среды, но к ним добавляют 1-2% глюкозы и стерилизуют при 0,5 атм. Мясо-пептонная желатина. К МПБ добавляют 10-20% желатины (продукт, полу- чаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют и в горячем виде устанавливают нужную реакцию среды, пропускают через ватно-марлиевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно. Мясо-пептоный печеночный бульон Китта-Тароцци - жидкая среда для культиви- рования анаэробов. Печень КРС нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1. кипятят, фильтруют и печеночную воду добавляют к МПБ 2:1 (на 2 л МПБ 1л печеночного отвара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высоким столбиком, в которые пред- варительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1-2 мл вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин. Сывороточный бульон и сывороточный мясо-пептонный агар готовят путем асепти- ческого добавления к МПБ или расплавленному и охлажденному до 45-50° МПА 5-10% сте- рильной сыворотки крови лошади (или барана, кролика), затем сывороточный бульон разли- вают в стерильные пробирки (колбы). Сывороточный МПА разливают в стерильные про- бирки (столбиком) или чашки Петри. Синтетические среды применяют для изучения метаболизма бактерий и других био- логических особенностей. Их составляют из химически чистых растворимых в воде веществ, в строго определенных количествах: фосфорнокислого аммония, фосфорного калия, хлори- стого натра, сернокислого магния, глюкозы или другого углевода, никотинамида и др. По мере необходимости готовят плотные синтетические среды путем добавления агара. Стери- лизуют в автоклаве. Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют сле- дующие среды. Синтетическая среда Ван-Итерсона: азотнокислого аммония 0,5 калия фосфорно- кислого одноосновного 0,5 воды водопроводной 1 л. Автоклавируют при 1 атм. 20 мин. Глюкозный агар Сабуро: глюкозы 4,0, пептона 1,0, агара 1,8, воды 100 мл. Стерили- зуют автоклавированием. Агар Литмана с бычьей желчью: пептона 10,0, глюкозы 10,0 обезвоженной бычьей желчи 15 мл, кристаллвиолета 0,01, воды 1л. агара 20,0. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 15 мин. Разливают в чашки толстым слоем, чтобы предупредить обезвоживание сред. Выделение и изучение чистой культуры бактерий. Чистой культурой микроорга- низмов называют культуру одного вида, выращенную как потомство одной клетки. Выделе- ние микроорганизмов в виде чистых культур, свободных от примесей других видов микро- бов, необходимо при изучении их свойств и определении видового названия. В естественных условиях различные объекты (почва, вода, пищевые продукты) со- держат, как правило, смешанную микрофлору. Поэтому при изучении состава микрофлоры того или иного объекта бактериологическое исследование обычно начинают с выделения микроорганизмов в виде чистых культур. Чистые культуры бактерий необходимы также для некоторых производственных процессов. Так, применение при получении кисломолочных продуктов, антибиотиков, квашении овощей микроорганизмов с известными свойствами без примеси посторонних видов позволяет улучшить качество продукции и экономические пока- затели производства. Основной метод выделения чистых культур — это изоляция одной микробной клетки из смеси микроорганизмов и выращивание потомства этой клетки на питательной среде в виде изолированной колонии. При посевах исходного материала (пищевых продуктов, почвы и т. д.), содержащего 19 смешанную микрофлору, на плотных средах вырастают колонии различных видов микроор- ганизмов. Поэтому для получения чистых культур определенного вида следует одну коло- нию из выросшего первичного посева пересеять на изолированную среду. Для посева обычно используют агаризованные среды, например мясопептонный агар в чашках Петри. Метод выделения чистых культур путем изоляции микроорганизмов из од- ной колонии носит название метода чашечных культур Коха. При выделении чистой культуры бактерий методом Коха основным условием являет- ся предварительное разведение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательной среде выросли изолированные коло- нии. Существуют два основных способа разведения исследуемого материала: а) путем истощающего посева на плотной питательной среде; б) разведением материала в стерильной водопроводной воде перед посевом. Видовое название выделенных чистых культур бактерий устанавливают путем изуче- ния их морфологических, культуральных и физиологических свойств. По совокупности изу- ченных признаков определяют таксономическое положение (положение в систематике) мик- роорганизмов, пользуясь специальными определителями. Морфологические свойства бактерий исследуют при микроскопии фиксированных окрашенных препаратов. Культуральные свойства бактерий устанавливают по особенностям роста на пита- тельных средах. На жидких питательных средах отмечают характер распределения культуры в жидкости (равномерное, вызывающее помутнение среды, придонное или поверхностное), который обусловлен отношением микроорганизмов к кислороду воздуха. Мутность среды может быть хлопьевидной, однородной; пленка — тонкой, плотной и рыхлой, гладкой, мор- щинистой или складчатой; осадок — скудным или обильным (количество), плотным, рых- лым, слизистым (консистенция). На плотных питательных средах изучают характер колоний. Поскольку колония об- разуется в результате размножения клеток, ее строение зависит от особенностей деления микробов данного вида и, следовательно, каждому виду присущи характерные признаки ко- лоний. При описании колоний, выросших на поверхности МПА, отмечают: форму, блеск, цвет — невооруженным глазом; край — при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х); консистенцию — прикосновением петли к колонии; величину — линейкой или окулярным микрометром при малом увеличении микроскопа (колонии точечные — менее 1 мм в диа- метре, мелкие — 1-2, крупные — 3-4 мм и более). Физиологические свойства микроорганизмов обусловлены ферментативной актив- ностью и, следовательно, выражают особенности обмена веществ клетки. В микробиологической практике распространенным методом изучения физиологиче- ских свойств микроорганизмов является выращивание их на дифференциально- диагностических средах. Наиболее существенными физиологическими свойствами являются следующие: 1) отношение к кислороду (тип дыхания) - определяют по характеру роста в столбике агара (МПА) при посеве уколом. После инкубации в термостате в течение 48 ч при темпера- туре 30-38 °С возможны три типа роста в зависимости от типа дыхания: рост шляпкой на по- верхности (аэробные микроорганизмы), рост у дна пробирки (анаэробные микроорганиз- мы), рост равномерный по всей длине укола (факультативно анаэробные микроорганиз- мы); 2) протеолитические свойства (способность расщеплять белковые вещества) — определяют по выделению из питательной среды газов — продуктов расщепления белка. Для определения протеолитических свойств культуру выращивают на жидкой среде (МПБ или мясной воде), закрепив в пробирке полоску фильтровальной бумаги, пропитанную реак- тивом, который выявляет наличие газа. Бумагу закрепляют между пробкой и стенкой пробирки так, чтобы она не касалась среды. Например, выделение аммиака обнаруживают по лакмусовой бумажке, посинение которой свидетельствует об увеличении щелочности среды под влиянием NH 3 ; выделение сероводорода устанавливают с помощью фильтровальной 20 бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом (бумага чернеет в результате образования сернистого свинца); выделение индола — с помощью бумажки, пропитанной щавелевой ки- слотой (покраснение в результате образования соединения с индолом). О протеолитических свойствах микробов судят также по способности разжижать же- латин. При посеве уколом в столбик желатина через 2 ч культивирования отмечают наличие и характер разжижения его (послойное, воронкообразное, пузырчатое); 3) сахаролитические свойства — определяют на средах (МПБ, 1%-ной пептонной во- де и др.), содержащих тот или иной углевод и индикатор. Расщепление углеводов под влия- нием микробов сопровождается изменением цвета индикатора в результате подкисления среды, а на жидких средах в ряде случаев и газообразованием, которое улавливают с помо- щью поплавка (поплавок — это маленькая стеклянная, запаянная на одном конце трубочка, помещенная на дно пробирки со средой запаянным концом вверх; образовавшийся газ вы- тесняет жидкую среду и обнаруживается в поплавке в виде пузырька). Перечень исследуемых признаков, а также методы культивирования дифференциру- ются в зависимости от предполагаемого вида микроорганизмов. Лекция №2 Формы взаимодействия микро и макро организмов, эпизоотология Эпизоотология – это наука об эпизоотическом процессе, который проявляется в виде непрерывной цепи следующих друг за другом специфических инфекционных состояний (яв- но больные, скрыто больные, носители), обусловленных характерным для данной инфекции механизмом передачи возбудителя. В зависимости от объектов и задач эпизоотология подразделяется на общую, частную и клиническую. Общая эпизоотология – выявляет и изучает общие закономерности эпизоотического процесса путем обобщения частных закономерностей, свойственных отдельным заразным болезням, а так же разрабатывает общие принципы профилактики и ликвидации этих болез- ней. Частная эпизоотология – изучает особенности отдельных инфекционных болезней и разрабатывает общие и специфические мероприятия по их профилактике и ликвидации. Клиническая эпизоотология – наука, занимающаяся решением клинических задач и повышением эффективности клинической работы. Исходя из понятий общей, частной и клинической эпизоотологии, основными зада- чами эпизоотологии являются: 1. Изучение эпизоотологического процесса, т.е. причин возникновения, развития, распро- странения, угасания и исчезновения инфекционных болезней и влияния условий внешней среды и социально-экономических факторов (хозяйственных) на интенсивность этого про- цесса. 2. Разработка и совершенствование методов профилактики и ликвидации инфекционных бо- лезней. Применительно к повседневной деятельности ветеринарной службы и исходя из зако- на РФ «О ветеринарии» задачи эпизоотологии в прикладном значении заключаются в сле- дующем: - предупреждение и ликвидация карантинных и особо опасных болезней животных; - подготовка ветеринарных специалистов; - производство препаратов и средств для ветеринарии; - научные исследования по ветеринарии; - контроль за соблюдением ветеринарного законодательства; - охрана территории России от заноса возбудителей заразных болезней животных из-за ру- бежа; - ветеринарно-санитарный надзор. 21 Безусловно, при решении своих задач эпизоотология тесно опирается и взаимодейст- вует с другими науками, прежде всего ветеринарными, биологическими, медицинскими, ес- тественными, гуманитарными. Связь эпизоотологии с микробиологией, вирусологией, иммунологией, биохимией, генетикой позволяет разрабатывать средства диагностики, специфической профилактики и лечения. Достижения в клинической диагностике, терапии, фармакологии, патфизиологии и анатомии широко используются эпизоотологами в клинической и патологоанатомической диагностике инфекционных болезней, при оказании помощи больным животным и расшиф- ровке механизмов патогенеза. Совместно с ветеринарной санитарией и зоогигиеной разрабатываются и применяют- ся на практике общие профилактически-оздоровительные мероприятия. Результаты изучения зоологами и паразитологами биологии переносчиков возбудите- лей инфекционных болезней используются эпизоотологами при расшифровке механизма пе- редачи и путей распространения возбудителей. Связь с эпидемиологией и медицинской микробиологией вытекает из необходимости совместного изучения и ликвидации болезней, общих для человека и животных. Большую помощь эпизоотологии оказывает статистика, экономика, география, исто- рия, организация ветеринарного дела, т.к. они позволяют отслеживать появление и распро- странение инфекционных болезней, наладить наиболее оптимальные мероприятия при их ликвидации. Связь эпизоотологии с физикой и химией позволяет участвовать в разработке экс- пресс методов диагностики инфекционных болезней. В частности уже широко используются такие методы как иммуноферментный анализ, полимеразно-цепная реакция, предложен ме- тод характеристического рентгеновского излучения и кристаллографический метод. Опираясь на методологию дисциплин имеющих прямое и косвенное отношение к проблеме инфекционных болезней, эпизоотология использует и собственные методы – метод эпизоотологического исследования и эпизоотологический мониторинг. |